JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 5:56 min. • August 31st, 2026
Iniziare con un lisato cellulare contenente DNA cellulare aggregato a proteine cellulari e particelle virali.
Aggiungere ioni di magnesio, seguiti da una nucleasi, per attivare la degradazione enzimatica del DNA cellulare e interrompere gli aggregati DNA-proteina.
Centrifugare per separare i detriti e raccogliere il soprannatante contenente le particelle virali.
Aggiungere il sopranatante su un gradiente discontinuo di iodixanol con concentrazioni crescenti da cima a fondo, quindi riempire il tubo con tampone.
Ultracentrifugare per separare i componenti in base alla densità. Le particelle virali si accumulano all'interfaccia tra gli strati ad alta e media densità.
Inserire un ago a questa interfaccia e raccogliere le particelle virali in un tubo.
Aggiungere un buffer contenente componenti stabilizzanti, che previene l'aggregazione delle particelle virali.
Quindi trasferire la soluzione in un tubo con un filtro a membrana.
Centrifugare per concentrare le particelle virali al di sopra del filtro.
Aggiungere il tampone arricchito con agente stabilizzante e centrifugare nuovamente per ottenere le particelle virali purificate.
Per raccogliere le cellule transfezionate, staccare e sospendere le cellule utilizzando il mezzo di coltura per aspirare e dispensare più volte. Trasferire quindi le sospensioni cellulari in provette sterili da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 500 × g per cinque minuti.
Quindi aggiungere cinque millilitri di PBS in ogni provetta e risospendere i pellet cellulari prima di combinare tutte le sospensioni in un'unica provetta da 50 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule a 500 ×g per cinque minuti, scartare il soprannatante. Per purificare l'AAV, risospendere il pellet in 10 millilitri di buffer di lisi.
Congelare il lisato a meno 80 gradi Celsius o in un bagno di ghiaccio secco–etanolo. Quindi scongelarlo a 37 gradi Celsius. Vortexare il lisato per un minuto prima di ripetere il congelamento e lo scongelamento altre due volte.
Successivamente, aggiungere cloruro di magnesio da un millimolare al lisato scongelato. Quindi aggiungere la nucleasi a una concentrazione finale di 250 unità per millilitro. Incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per 15 minuti per sciogliere l'aggregazione DNA-proteina.
Centrifugare il campione a 4.800 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, raccogliere il soprannatante. Nel frattempo, per preparare una soluzione al 17% di iodixanol per gradiente, mescolare cinque millilitri di PBS 10X con 0,05 millilitri di cloruro di magnesio uno molare, 0,125 millilitri di cloruro di potassio uno molare, 10 millilitri di cloruro di sodio cinque molar, e 12,5 millilitri di mezzo per gradiente di densità.
Usare acqua per regolare il volume totale a 50 millilitri. Dopo aver preparato le soluzioni gradiente al 25%, 40% e 60% secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare un ago e una siringa per caricare cinque millilitri di soluzione gradiente al 17% in un tubo in polipropilene. Aggiungere quindi cinque millilitri ciascuna delle soluzioni gradiente al 25%, 40% e 60%.
Deporre il lisato sulla parte superiore del gradiente. Quindi riempire il tubo con il buffer di lisi e coprirlo con un tappo di sughero. Centrifugare il gradiente a 185.000 ×g e a 16 °C per 90 minuti.
Dopo la centrifugazione, utilizzare una siringa per raccogliere la frazione virale al 40% inserendo un ago da 21 gauge all'intersezione tra le frazioni al 40 e al 60%, evitando completamente lo strato al 25%. Mescolare la frazione virale con soluzione sterile di poliossietilene poliossipropilene, o soluzione di PBS con copolimero a blocchi PEG-PPG, fino a un volume totale di 15 millilitri. Caricare la miscela in una provetta filtrante con cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton.
Quindi centrifugare il campione a 2.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Decantare la soluzione dal fondo del tubo. Successivamente, utilizzare PEG-PPG per riempire nuovamente il tubo del filtro fino a 15 millilitri.
Centrifugare il tubo a 2.000 × g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo aver ripetuto il riempimento e la centrifugazione altre due volte, raccogliere la frazione purificata del virus rAAV9 ancora presente sopra il filtro.