JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:07 min. • August 31st, 2026
Prendere un mezzo contenente particelle retrovirali che codificano oncogeni virali e un gene di resistenza agli antibiotici.
Centrifugare il mezzo per rimuovere i detriti cellulari.
Raccogliere il sopranatante contenente le particelle virali e sovrapporlo a una coltura di cellule endoteliali.
Incubare per consentire l'ingresso virale.
L'RNA virale viene trascritto a ritroso in DNA, che si integra nel genoma dell'ospite.
Il gene di resistenza agli antibiotici produce una proteina resistente. Gli oncogeni producono proteine che si legano alle proteine soppressori tumorali che controllano la divisione cellulare e le inattivano, prolungando la durata della vita cellulare.
Sostituire il mezzo con un mezzo fresco.
Incubare nuovamente per garantire l'integrazione stabile del DNA virale.
Rimuovere il mezzo e lavare le cellule.
Aggiungere una soluzione enzimatica di dissociazione per staccare le cellule.
Trasferire la sospensione cellulare, centrifugare e rimuovere il soprannatante.
Risospendere il pellet e trasferirlo in un matraccio.
Aggiungere un antibiotico al mezzo.
Sopravvivono solo le cellule che esprimono la proteina di resistenza all'antibiotico, selezionando così le cellule immortalizzate dalle proteine oncogeniche virali.
Dopo un'incubazione notturna, raccogliere il mezzo di coltura dalle cellule PA317 e chiarificarlo mediante centrifugazione a 300 × g per cinque minuti a temperatura ambiente. Sostituire il mezzo EGM da una coltura di cellule endoteliali al 50% di confluenza con 12 millilitri di mezzo PA317 chiarificato. Incubare le cellule per quattro ore.
Sostituire quindi sei millilitri del mezzo PA317 con sei millilitri di mezzo EGM fresco e incubare le cellule durante la notte. Successivamente, rimuovere il mezzo dalla coltura di cellule endoteliali e aggiungere 12 millilitri di mezzo EGM fresco. Continuare a incubare le cellule per ulteriori 48 ore.
Per sottocoltivare le cellule endoteliali, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con 12 millilitri di PBS privo di cationi. Quindi aggiungere tre millilitri di una soluzione commerciale di dissociazione enzimatica e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 300 × g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in mezzo EGM fresco e dividere in modo uniforme la sospensione in tre fiasche T75. Regolare il volume delle colture a 12 millilitri di EGM per fiasca. Quindi aggiungere 200 microgrammi per millilitro di G418 per selezionare le cellule endoteliali transdotte.