Immortalizzazione di cellule endoteliali tramite trasduzione retrovirale di oncogeni virali

Prendere un mezzo contenente particelle retrovirali che codificano oncogeni virali e un gene di resistenza agli antibiotici.

Centrifugare il mezzo per rimuovere i detriti cellulari.

Raccogliere il sopranatante contenente le particelle virali e sovrapporlo a una coltura di cellule endoteliali.

Incubare per consentire l'ingresso virale.

L'RNA virale viene trascritto a ritroso in DNA, che si integra nel genoma dell'ospite.

Il gene di resistenza agli antibiotici produce una proteina resistente. Gli oncogeni producono proteine che si legano alle proteine soppressori tumorali che controllano la divisione cellulare e le inattivano, prolungando la durata della vita cellulare.

Sostituire il mezzo con un mezzo fresco.

Incubare nuovamente per garantire l'integrazione stabile del DNA virale.

Rimuovere il mezzo e lavare le cellule.

Aggiungere una soluzione enzimatica di dissociazione per staccare le cellule.

Trasferire la sospensione cellulare, centrifugare e rimuovere il soprannatante.

Risospendere il pellet e trasferirlo in un matraccio.

Aggiungere un antibiotico al mezzo.

Sopravvivono solo le cellule che esprimono la proteina di resistenza all'antibiotico, selezionando così le cellule immortalizzate dall