Determinazione della distribuzione dell'RNA virale nelle cellule ospiti mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Si parte da un vetrino contenente cellule ospiti infette dal virus e permeabilizzate, in cui gli RNA virali sono distribuiti tra i compartimenti nucleare e citoplasmatico.

Aggiungere un buffer di pre-ibridazione e incubare in condizioni umide.

Nel buffer, i reagenti di blocco saturano i siti di legame non specifici, mentre gli inibitori della RNasi inattivano le RNasi e preservano l'integrità dell'RNA.

Rimuovere il tampone e aggiungere sonde oligonucleotidiche denaturate, marcate con digossigenina, complementari all'RNA virale.

Incubare al buio per consentire l'ibridazione tra la sonda e l'RNA, quindi lavare ripetutamente.

Aggiungere un fissativo per stabilizzare gli ibridi sonda-RNA, quindi eseguire ripetuti lavaggi. Aggiungere un buffer supplementato con detergente per mantenere la permeabilità cellulare.

Aggiungere un anticorpo anti-digossigenina coniugato con un fluoroforo verde che interagisce con la digossigenina, quindi eseguire ripetuti lavaggi.

Fissare le cellule per preservare i complessi, quindi lavare nuovamente.

Aggiungere un colorante legante del DNA per colorare i nuclei. Lavare ripetutamente l'eccesso di colorante.

Montare con un coprioggetto e sigillarlo.

Sotto un microscopio confocale, visualizzare la fluorescenza verde, che riflette la distribuzione dell'RNA virale tra il nucleo e il citoplasma della cellula ospite.

Dopo tre lavaggi con PBS come mostrato, fissare nuovamente i campioni in formaldeide al 4% in PBS per 10-15 minuti prima di una seconda permeabilizzazione come dimostrato. Quindi coprire il vetrino con della carta d'alluminio per preservare il segnale fluorescente e prevenire lo sbiancamento fotoindotto.

E lavare le cellule con 2x salino citrato di sodio, prima di applicare 45 microlitri di soluzione di ibridazione. Dopo un'ora a 37 gradi Celsius in una camera umidificata, aggiungere acqua distillata agli oligonucleotidi antisenso di interesse per portare il volume di denaturazione a 10 microlitri. Denaturare gli oligonucleotidi a 95 gradi Celsius per cinque minuti, prima di aggiungere 35 microlitri di soluzione di ibridazione fresca per ogni vetrino.

Quindi incubare i campioni da 10 a 24 ore nella camera umidificata a 37 gradi Celsius, protetti con stagnola. Il giorno successivo, lavare le cellule con due lavaggi di 10 minuti ciascuno in soluzione salina citrato 2X a temperatura ambiente, seguiti da un lavaggio in soluzione salina citrato 1X per 10 minuti a 25 gradi Celsius.

Dopo l'ultimo lavaggio, fissare le cellule con formaldeide al 4% pre-raffreddata in PBS per 10-15 minuti sul ghiaccio, seguito da tre lavaggi con PBS fresco. Successivamente, permeabilizzare i campioni come dimostrato, quindi incubare con anti-digossigenina-FITC e BSA allo 0,1% pre-raffreddato in PBS per un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini tre volte con PBS fresco e fissare i campioni con paraformaldeide al 4% pre-raffreddata in PBS per 10-15 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo tre lavaggi in PBS, etichettare i nuclei con 0,4 microgrammi per millilitro di DAPI e 0,5% di Triton-X pre-raffreddato in PBS per 15 minuti sul ghiaccio, seguiti da tre lavaggi finali in PBS. Montare i vetrini con perline fluorescenti, secondo quanto rilevante sperimentalmente e nel mezzo di montaggio appropriato. Dopo aver rimosso l'eccesso di mezzo di montaggio con salviette sterili, sigillare un'immersione su ogni vetrino con più strati di smalto trasparente e utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare l'esecuzione corretta dell'esperimento.

Le immagini possono quindi essere acquisite al microscopio confocale per ottenere immagini dei campioni entro un'ora fino a una settimana dal montaggio, con un ingrandimento di 630 volte.