Determinazione della distribuzione dell'RNA virale nelle cellule ospiti mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Si parte da un vetrino contenente cellule ospiti infette dal virus e permeabilizzate, in cui gli RNA virali sono distribuiti tra i compartimenti nucleare e citoplasmatico.

Aggiungere un buffer di pre-ibridazione e incubare in condizioni umide.

Nel buffer, i reagenti di blocco saturano i siti di legame non specifici, mentre gli inibitori della RNasi inattivano le RNasi e preservano l'integrità dell'RNA.

Rimuovere il tampone e aggiungere sonde oligonucleotidiche denaturate, marcate con digossigenina, complementari all'RNA virale.

Incubare al buio per consentire l'ibridazione tra la sonda e l'RNA, quindi lavare ripetutamente.

Aggiungere un fissativo per stabilizzare gli ibridi sonda-RNA, quindi eseguire ripetuti lavaggi. Aggiungere un buffer supplementato con detergente per mantenere la permeabilità cellulare.

Aggiungere un anticorpo anti-digossigenina coniugato con un fluoroforo verde che interagisce con la digossigenina, quindi eseguire ripetuti lavaggi.

Fissare le cellule per preservare i complessi, quindi lavare nuovamente.

Aggiungere un colorante legante del DNA per colorare i nuclei. Lavare ripetutamente l'eccesso di colorante.

Montare con un coprioggetto e sigillarlo.

Sotto un microscopi