Purificazione di vettori di virus adeno-associati mediante cromatografia di affinità

Iniziare con un lisato cellulare filtrato contenente vettori del virus adeno-associato (AAV) e contaminanti di origine ospite.

Fare passare il lisato attraverso una colonna di affinità a base di eparina.

Le proteine del capside virale si legano elettrostaticamente ai gruppi di eparina carichi negativamente.

Risciacquare la colonna con un tampone per rimuovere i contaminanti non legati.

Applicare un buffer contenente un detergente per solubilizzare i detriti membranosi.

Risciacquare nuovamente con il buffer privo di detergenti.

Introdurre un buffer supplementato con cationi per creare un ambiente ionico, quindi lavare con un buffer a concentrazione moderata di sale per rimuovere le impurità legate debolmente.

Aggiungere un buffer ad alto contenuto salino per interrompere le interazioni tra capside e eparina ed eluire le particelle virali.

Raccogliere le frazioni di eluizione arricchite in particelle virali integre e trasferirle in tubi concentratori centrifughi dotati di membrane filtranti.

Centrifugare i tubi per rimuovere il buffer in eccesso, quindi raccogliere le frazioni virali concentrate in un tubo.

Risciacquare la membrana con il tampone per recuperare le particelle virali residue e massimizzare il rendimento.

Scongelare il lisato grezzo a quattro gradi Celsius durante la notte.

Dopo lo scongelamento, filtrare utilizzando un filtro da 0,22 micron. Immediatamente prima dei passaggi di purificazione, passivare il concentratore centrifugo aggiungendo quattro millilitri di tampone per il pretrattamento del filtro per ogni colonna di eparina-Sepharosio in uso. Posizionare il tubo in una pompa peristaltica.

Eseguire in sequenza le soluzioni e i mezzi. Prepararsi alla cromatografia collegando una colonna di eparina-Sepharosio da cinque millilitri al tubo, e facendo passare 25 millilitri di DMEM Bazell attraverso la colonna. Successivamente, caricare 0,2 micromoli del lisato grezzo filtrato sulla colonna a una velocità di flusso di una o due gocce al secondo.

Lavare la colonna in modo sequenziale per eluire cinque millilitri per cinque volte con HBSS contenente cloruro di sodio 300 millimolare, magnesio e calcio, etichettando le cinque eluzioni come E1 a E5. Quando pronto, centrifugare il concentratore centrifugo contenente il tampone di pretrattamento a 900 ×g per due minuti. Scartare il flusso passante. Lavare il filtro del concentratore centrifugo con quattro millilitri di HBSS con magnesio e calcio centrifugando a 1000 ×g per due minuti.

Quindi aggiungere l'eluato E2 al concentratore centrifugo e centrifugare a 1000 ×g per cinque minuti. Scartare il flusso passante. Analogamente, centrifugare l'eluato E3 nel concentratore centrifugo fino a quando il virus concentrato raggiunge un volume di circa un millilitro.

Rimuovere il virus concentrato dal concentratore centrifugo utilizzando una punta filtrata P200, e raccoglierlo in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Dopo il recupero del virus, risciacquare il concentratore centrifugo con 200 microlitri di HBSS contenente magnesio e calcio. Pipettare su e giù vigorosamente per 30 secondi per staccare qualsiasi particella virale aderente alla membrana, e raccogliere il virus concentrato nella stessa provetta da 1,5 millilitro.

Mescolare bene il tubo.