Trasduzione di embrioni di ratto fecondati basata su vettori lentivirali

Prendere una piastra per microiniezione con una goccia di mezzo di coltura per embrioni al centro, ricoperta con olio minerale per prevenire l'evaporazione.

Posizionare la piastra sotto un microscopio invertito.

Posizionare una micropipetta per microiniezione e una pipetta di ritenzione su un sistema di micromanipolazione sotto il microscopio.

La capillare per microiniezione viene caricata con una sospensione di vettori lentivirali contenenti il transgene.

Successivamente, trasferire gli embrioni di ratto fecondati nel mezzo.

Fissare un embrione utilizzando la pipetta di ritenzione applicando un'aspirazione.

Con un ingrandimento maggiore, inserire la pipetta di microiniezione attraverso il rivestimento extracellulare di glicoproteine dell'embrione, la zona pellucida, e iniettare la sospensione lentivirale nello spazio perivitellino.

Successivamente, trasferire gli embrioni iniettati in una piastra di coltura e incubare.

Il virus entra nell'embrione e rilascia il suo genoma contenente il transgene nel citoplasma.

In seguito, viene trascritto a ritroso in DNA e si integra nel genoma dell'embrione, incorporando il transgene.

Gli embrioni trasdotti sono ora pronti per essere processati.

Per la microiniezione del vettore lentivirale sotto la zona pellucida di embrioni allo stadio a una cellula, utilizzare un estrattore di pipette per preparare capillari di vetro borosilicato per microiniezione con un filamento. Ogni volta che si cambia il filamento o si utilizza un nuovo capillare di vetro, eseguire un test Ramp per impostare i parametri ottimali.

Successivamente, utilizzare una punta microloader per caricare circa due microlitri di soluzione lentivirale appena scongelata per ogni pipetta di microiniezione all'interno di un'appaio a flusso laminare in condizioni di biosicurezza. Aggiungere una goccia di 100 microlitri di mezzo M2 al centro del coperchio di una piastra di Petri da 60 millimetri. Coprire il mezzo con olio minerale e montare la pipetta di ritenzione e la capillare di microiniezione caricata con il virus su un micromanipolatore.

Posizionare la piastra per microiniezione sotto un microscopio invertito e trasferire da 15 a 20 embrioni allo stadio a una cellula nella goccia di mezzo M2 presente sulla piastra. Catturare un embrione con la pipetta di ritenzione e utilizzare un ingrandimento di 400 volte insieme alla capillare di vetro per iniettare la soluzione lentivirale al di sotto della zona pellucida nello spazio perivitellino, mantenendo la capillare al di sotto della zona pellucida per un momento dopo il rilascio del virus. Una volta iniettati tutti gli embrioni, utilizzare una pipetta fine per riposizionare le cellule iniettate nella piastra di coltura e reinserire la piastra nell'incubatore per colture cellulari fino al momento dell'impianto.