JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:45 min. • August 31st, 2026
Iniziare con una sospensione di cellule batteriche che esprimono integrasi virale con tag poli-istidinico.
Sonicare la sospensione per rompere le membrane batteriche e rilasciare l'integrasi.
Trasferire il lisato in un tubo per ultracentrifuga.
Centrifugare a velocità elevata per formare un pellet dei detriti cellulari e raccogliere il sopranatante.
Successivamente, prendere una colonna cromatografica riempita con resina carica di nickel ed equilibrarla con il tampone.
Caricare il lisato chiarito sulla colonna.
Le proteine con istidine si legano debolmente al nichel, mentre l'integrasi con il tag poli-istidinico si lega fortemente.
Lavare con tampone per rimuovere le proteine non legate, quindi aggiungere il tampone di eluizione con una concentrazione di imidazolo crescente linearmente.
L'imidazolo compete con l'istidina per il legame con il nichel e rilascia l'integrasi.
Raccogliere le frazioni e trasferire aliquote in provette contenenti buffer di caricamento.
Riscaldare per denaturare le proteine, quindi caricarle su un gel di poliacrilamide.
Eseguire l'elettroforesi e analizzare le bande proteiche.
Identificare le frazioni contenenti integrasi pura, senza proteine contaminanti, e combinarl
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