JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:45 min • August 31st, 2026
Iniziare con una sospensione di cellule batteriche che esprimono integrasi virale con tag poli-istidinico.
Sonicare la sospensione per rompere le membrane batteriche e rilasciare l'integrasi.
Trasferire il lisato in un tubo per ultracentrifuga.
Centrifugare a velocità elevata per formare un pellet dei detriti cellulari e raccogliere il sopranatante.
Successivamente, prendere una colonna cromatografica riempita con resina carica di nickel ed equilibrarla con il tampone.
Caricare il lisato chiarito sulla colonna.
Le proteine con istidine si legano debolmente al nichel, mentre l'integrasi con il tag poli-istidinico si lega fortemente.
Lavare con tampone per rimuovere le proteine non legate, quindi aggiungere il tampone di eluizione con una concentrazione di imidazolo crescente linearmente.
L'imidazolo compete con l'istidina per il legame con il nichel e rilascia l'integrasi.
Raccogliere le frazioni e trasferire aliquote in provette contenenti buffer di caricamento.
Riscaldare per denaturare le proteine, quindi caricarle su un gel di poliacrilamide.
Eseguire l'elettroforesi e analizzare le bande proteiche.
Identificare le frazioni contenenti integrasi pura, senza proteine contaminanti, e combinarle per ottenere l'integrasi virale purificata.
Iniziare scongelando un pellet di E. coli che esprime l'integrasi del prototipo del virus della schiuma su ghiaccio. Utilizzare un sonicator dotato di un biohorn da 0,5 pollici di diametro con una micro-punta conica da 0,125 pollici di diametro per sottoporre a sonica per 30 secondi al 30% di ampiezza con il tubo su ghiaccio. Dopo la sonica, trasferire il campione cellulare in un tubo da ultracentrifuga freddo e centrifugare a 120.000 × g per 60 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, dovrebbe formarsi un pellet evidente e il soprannatante potrebbe avere un colore giallo. Trasferire il soprannatante in un tubo conico da 50 millilitri freddo. Successivamente, preparare una colonna FPLC lunga 110 millimetri e di diametro cinque millimetri, contenente 1,5 millilitri di resina caricata al nichel.
Per prima cosa, collegare la colonna allo strumento FPLC ed applicare il tampone. Lo strumento dovrebbe raccogliere in tempo reale i dati di conducibilità e di assorbanza UV a 280 nanometri. I valori di conducibilità e UV dovrebbero stabilizzarsi.
Se necessario, continuare a far passare i tamponi attraverso la colonna fino a quando le letture non diventano stabili. Utilizzando un superloop, caricare il campione proteico sulla colonna a una velocità di flusso di 0,15 millilitri al minuto con un limite massimo di pressione di 0,5 megapascal. Collegare il superloop all'AKTA FPLC.
Dopo aver lavato la colonna ed eluito le proteine, prelevare aliquote di 15 microlitri del flusso iniziale, del lavaggio e delle frazioni di picco dell'assorbanza a 280 nanometri, e aggiungere 15 microlitri di tampone campione 2X SDS-PAGE a ciascun campione. Far bollire i campioni per tre minuti. Caricare 10 microlitri di ciascun campione su gel SDS-PAGE al 10%, insieme a 4 microlitri di marcatori proteici pre-colorati.
Ispezionare visivamente il gel per identificare le frazioni che sembrano contenere integrasi del prototipo del virus della schiuma pressoché pura. Combinare queste frazioni e prendere nota del volume durante la pipettaggio. Il volume è tipicamente di otto a dieci millilitri.