Purificazione dell'integrasi virale mediante cromatografia di affinità con eparina

Iniziare con una frazione purificata dell'enzima integrasi virale contenente nucleasi batterica residua come contaminante.

Caricare il campione su una colonna di eparina-Sepharose pre-equilibrata con un tampone di legame a bassa concentrazione salina.

Man mano che la miscela passa attraverso la colonna, l'integrasi si lega più fortemente al ligando eparina rispetto alla nucleasi contaminante.

Successivamente, aumentare gradualmente la concentrazione di sale nel tampone che scorre attraverso la colonna.

A basse concentrazioni di sale, le nucleasi debolmente legate eluiscono per prime, mentre l'integrasi fortemente legata eluisce successivamente a concentrazioni di sale più elevate.

Raccogliere le frazioni eluite singolarmente per separare la nucleasi contaminante dall'integrasi.

Aggiungere il tampone campione SDS-PAGE a ciascuna frazione e riscaldare per denaturare le proteine. Caricare i campioni su un gel SDS-PAGE ed eseguire la separazione elettroforetica.

Osservare il gel colorato.

Identificare le frazioni contenenti una banda prominente di integrasi senza proteine contaminanti visibili, indicativa di purezza apparente.

Per eseguire la frazionatura mediante cromatografia di affinità con