JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Iniziare con un supernatante di coltura cellulare di mammifero contenente il virus dell'epatite C.
Diluire in modo seriale la sospensione virale nel mezzo di crescita.
Inoculare ogni diluizione su un monostrato di cellule di epatoma e incubare.
Il virus entra nelle cellule, rilascia il suo genoma ed esprime le proteine virali, inclusa la proteina replicativa non strutturale.
Questo produce nuove particelle virali che gemmano e infettano le cellule adiacenti, formando un focolaio di cellule infette.
Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo e aggiungere un fissativo. Incubare a temperatura fredda per fissare le cellule e permeabilizzare la membrana.
Lavare e aggiungere un buffer di blocco per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.
Introdurre gli anticorpi primari che si legano alla proteina di replicazione non strutturale.
Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.
Quindi, introduci anticorpi secondari marcati con fluorocromo che si legano agli anticorpi primari.
Lavare nuovamente per rimuovere gli anticorpi non legati. Aggiungere un colorante legante del DNA per colorare i nuclei.
Visualizzare mediante microscopio a fluorescenza e quantificare i focolai fluorescenti per determina
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