Visualizzazione della soppressione trascrizionale in cellule infettate da virus

Iniziare con coprioggetti contenenti cellule di mammifero pretrattate con un analogo dell'uridina, di cui un gruppo infetto con il virus e l'altro non infetto.

In cellule infette da virus, le proteine virali si legano al macchinario trascrizionale dell'ospite e inibiscono la produzione di RNA dell'ospite, mentre in cellule non infette, la sintesi di RNA rimane ininterrotta.

Lavare con un tampone. Aggiungere paraformaldeide per fissare le cellule, quindi lavare. Aggiungere un detergente per permeabilizzare le membrane cellulari, quindi lavare.

Trasferire i coprioggetti in una camera umida.

Aggiungere la soluzione di colorazione click contenente azide fluorescente, un catalizzatore e un agente riducente, quindi incubare al buio.

L'agente riducente attiva il catalizzatore, permettendo all'azide fluorescente di legarsi all'RNA nascente marcato con uridina.

Risciacquare i coprioggetti nel buffer, immergerli in acqua ed eliminare l'eccesso di umidità.

Utilizzando un mezzo di montaggio antifade, montare le coprioggetti su un vetrino e farli asciugare all'aria.

Sotto un microscopio a fluorescenza invertito, una ridotta intensità del segnale nelle cellule infette rispetto alle cellule non infette i