JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:35 min. • September 30th, 2026
Prelevare i supernatanti di coltura contenenti virioni progenie rilasciati da cellule ospiti infettate con una variante sperimentale di HIV-1 o con un controllo di tipo selvaggio.
Il virus in esame porta una variante genica che altera l'efficienza della replicazione e influisce sulla produzione di virioni figli.
Aggiungere i supernatanti a una miscela di trascrizione inversa contenente un nucleotide radiomarcato, un nucleotide non marcato, un template di RNA, un primer, cofattori, un detergente e stabilizzanti.
Incubare per permettere la formazione del complesso modello-primer mentre il detergente lisa i virioni, liberando la trascrittasi inversa, o RT.
La trascrittasi inversa sintetizza il DNA a partire dal complesso modello–primer, incorporando il nucleotide radioattivo.
Trasferire i campioni su una membrana legante gli acidi nucleici e lasciarli asciugare all'aria per immobilizzare il DNA marcato radioattivamente.
Lavare ripetutamente con tampone ed etanolo sotto agitazione per rimuovere i componenti non legati.
Lasciare asciugare all'aria e avvolgere la membrana. Esporla a uno schermo sensibile alle radiazioni e rilevare i segnali utilizzando un fosforimager.
Un segnale ridotto nel tes
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