JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:53 min. • September 30th, 2026
Iniziare con cellule epiteliali infettate con il virus vaccinia e trasfettate con un vettore plasmidico di ricombinazione.
Il vettore porta un gene bersaglio marcato con fluorescenza verde e un gene di selezione metabolica marcato con fluorescenza rossa sotto un promotore virale.
Durante la replicazione del DNA virale, la cassetta plasmidica viene inserita nel genoma virale.
Raccogliere le cellule in mezzo privo di siero.
Utilizzare cicli di congelamento-scongelamento per lisare le cellule e rilasciare i virus.
Preparare diluizioni seriali del lisato.
Infettare cellule epiteliali fresche con il lisato diluito per ottenere placche singole separate.
Aggiungere mezzo contenente siero per la sopravvivenza cellulare e un reagente di selezione metabolica, quindi incubare.
Il reagente di selezione inibisce gli enzimi coinvolti nella sintesi dei nucleotidi. Solo le cellule infette che portano il gene metabolico di selezione esprimono un enzima alternativo che permette la sintesi dei nucleotidi, consentendo la sopravvivenza.
Rimuovere il mezzo e osservare al microscopio a fluorescenza.
La presenza di fluorescenza sia rossa che verde in una placca indica un'integrazione riuscita del cassetto e l'espre
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