JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:55 min. • September 30th, 2026
Prendere una coltura di cellule tumorali umane che esprimono una proteina bersaglio endogena e rimuovere il mezzo di coltura.
Prendere una sospensione di adenovirus ricombinante contenente un gene che codifica per la proteina bersaglio marcata con un fluorocromo.
Aggiungere un piccolo volume della sospensione virale alle cellule per garantire un contatto stretto tra il virus e la superficie cellulare.
Incubare con agitazione occasionale per favorire l'attacco virale.
Aggiungere ulteriore mezzo alla coltura.
Successivamente, introdurre un complesso di siRNA–fosfato di calcio per mirare l'mRNA della proteina endogena bersaglio e incubare.
Il fosfato di calcio migliora l'assorbimento dell'siRNA, e l'siRNA viene caricato nel complesso RISC.
Il complesso siRNA-RISC si lega quindi all'mRNA bersaglio e lo scinde, inibendo l'espressione proteica.
Nello stesso tempo, l'adenovirus entra nella cellula e rilascia il suo DNA, che indirizza l'espressione della proteina bersaglio marcata con un fluorocromo.
Questo consente l'eliminazione della proteina bersaglio endogena e il contemporaneo rimpiazzo con la proteina marcata con un fluorocromo.
Lavare le cellule con tampone ed eseguire l'analisi mediante ima
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