Marcatura dei residui di cisteina accessibili in superficie in particelle simil-virali ingegnerizzate

Iniziare con sospensioni di particelle virali simili a virus (VLPs) purificate da foglie di tabacco infette.

I VLP mutanti contengono residui di cisteina inseriti geneticamente in posizioni specifiche della proteina del capside virale.

Aggiungere un colorante fluorescente coniugato con maleimide e incubare la miscela al buio.

Il maleimide si lega solo ai residui di cisteina esposti sulla superficie delle particelle simili a virus (VLP), mentre le cisteine sepolte all'interno della struttura proteica rimangono inaccessibili e non vengono marcate.

Aggiungere un agente riducente per bloccare qualsiasi colorante non reagito e prevenire un'etichettatura non specifica.

Caricare i campioni in colonne di desalting riempite con una resina porosa, quindi centrifugare per purificare le VLP marcate.

I coloranti non reagiti e gli agenti riducenti diffondono nelle perle di resina porosa e vengono trattenuti, mentre le VLP più grandi sono escluse dai pori ed eluiscono per prime.

I VLP marcati fluorescentemente possono ora essere analizzati mediante elettroforesi su gel.

Le bande fluorescenti sul gel mostrano i mutanti marcati con residui di cisteina esposti sulla superficie.

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