JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Iniziare con un monostrato di cellule aderenti e permissive al virus.
Lavare le cellule, quindi aggiungere un agente dissociante per staccarle.
Centrifugare e scartare il soprannatante. Lavare le cellule per rimuovere il mezzo residuo.
Risospendere le cellule in soluzione salina tamponata, quindi trasferire le cellule in una cuvetta.
Introdurre l'RNA trascritto da un clone cDNA di lunghezza intera del virus dell'encefalite giapponese (JEV) contenuto in un cromosoma artificiale batterico.
Applicare impulsi elettrici per permeabilizzare temporaneamente la membrana cellulare, consentendo l'ingresso dell'RNA.
Lasciare riposare le cellule, quindi trasferirle in un mezzo di coltura.
L'RNA introdotto imita l'RNA virale nativo per produrre nuovi virioni.
Diluire in modo seriale le cellule e seminarle su monocapati cellulari freschi.
Incubare per consentire ai virioni di infettare le cellule adiacenti.
Coprire con un mezzo all'agarosio e incubare. Il mezzo forma uno strato semisolido, limitando la diffusione virale alle cellule vicine.
Le cellule infette lisanosi e formano placche distinte, confermando il successo del recupero di JEV infettivo.
Iniziare con cellule BHK-21 coltivate per 24 ore in piatti
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