Name: Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T18:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Impara a coltivare biofilm batterici in una camera a 8 pozzetti per studiare la morfologia e la cinetica di formazione. Questo metodo riduce i volumi di reagenti e consente l'osservazione con microscopia confocale.

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Il lavoro è stato finanziato dalla dell&#39;NIDCD / NIH R01DC003915 a LO Bakaletz.

1. Nella formazione di biofilm in vitro <ol><li> Colonie batteriche (che sono state coltivate su agar appropriato durante la notte), sono stati sospesi nei media e la OD 490 è stato rettificato a 0,65 </li><li> La sospensione batterica risultante è stato poi diluito 1:6 (1 ml di sospensione batterica + 5 ml preriscaldata media) e incubate a 37 ° C con 5% di CO 2 per circa 3 ore per raggiungere la metà del log fase. </li><li> Diluire il mid-log 1:2500 sospensione di crescita con pre-riscaldato media e 200 ul luogo di diluizione in ciascun pozzetto di una 8-scivolo e da camera. </li><li> Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Dopo circa 16 ore, media aspirato da un angolo di ogni camera e aggiungere 200 microlitri fresco, pre-riscaldato a medio - lungo dispensare muro di camera in modo da non creare forze di taglio all'interno della camera che potrebbe disturbare il biofilm. </li><li> Se incubazione più lungo di 24 ore, il cambiamento medio ogni 12 ore o secondo necessità per mantenere la vitalità dei batteri. </li></ol> 2. Visualizzazione dei biofilm <ol><li> Aspirare il terreno da ogni camera, come sopra descritto, e lavare biofilm residente due volte delicatamente con soluzione salina sterile. </li><li> Aggiungere 200 ml di BacLight Live / Dead macchia (3 microlitri componente A 3 componente B + microlitri per mL di soluzione salina) per ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Proteggere la cultura dalla luce da questo punto in avanti. </li><li> Aspirare la macchia e lavare due volte delicatamente con soluzione salina sterile come prima. </li><li> Aggiungere 200 ml di formalina neutra tamponata ad ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per risolvere campione. </li><li> Rimuovere fissativo e smaltire in conformità alle direttive istituzionali. </li><li> Lavare due volte con soluzione salina e smaltimento dei liquidi di lavaggio contenenti formalina come sopra. </li><li> Rimuovere i pozzi di plastica dalla diapositiva, aggiungere abbastanza salina in ogni pozzetto in modo che quando un coprioggetto è posto sulla guarnizione, non siano presenti bolle d'aria. </li><li> Coprioggetto e sigillare i bordi del coprioggetto con mezzo di montaggio. Smalto per le unghie può essere utilizzato per sigillare le diapositive tuttavia le diapositive non sarà permanente. </li><li> Lasciare che il sigillante ad asciugare per circa 1 ora prima di analizzare tramite microscopia. </li></ol> 3. Risultati <img src="/files/ftp_upload/2481/2481fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rappresentante immagini 3D composito di un biofilm formati in una 8-scivolo e da camera. I batteri sono stati etichettati con Live / Dead macchia batteri in cui vivono i batteri fluorescenti verdi e morto fluorescenza rossa. (A) immagine composita di biofilm intera che mostra l'architettura diversi con torri e canali d'acqua. (B) biofilm Stessa (A), ora visto in sezione trasversale.

<ol><li>Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms+in+otitis+media%3A+evidence+and+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance.</a> Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).</li>
<li>Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Comprendere il meccanismo con cui biofilm forma, così come caratterizzante la loro componenti della matrice, è un&#39;area di grande interesse. Questo protocollo può essere usato per aiutare a identificare le proteine ​​o altri costituenti che contribuiscono alla integrità strutturale del biofilm, così come aiutare a identificare e target le proteine ​​che possono si prestano ad una applicazione terapeutica. I tempi di incubazione e diluizioni nel protocollo sopra descritti sono stati stabiliti per la formazione di biofilm ottimale nontypeable da Haemophilus influenzae (NTHI). Alcuni lavori preliminari può essere necessaria per ottimizzare questi passaggi per altre specie di batteri (ad esempio diluizione iniziale e tempo di incubazione necessario per raggiungere la metà del log fase di crescita). La diluizione 1:2500 per la semina iniziale delle camere è stato creato per garantire che un biofilm robusta si svilupperebbe in camera di diapositive come indotta da questo organismo e nei tempi di incubazione ha dichiarato, senza il biofilm overgrowing la camera e / o estenuanti sostanze nutritive disponibili . Di conseguenza, la diluizione iniziale e tempi di incubazione possono o devono essere adeguate per le altre specie batteriche.

<table><tbody><tr><td>Agar al cioccolato II</td><td>Fisher Scientific</td><td>B21267X</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini con camera a 8 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-656-18</td><td></td></tr><tr><td>Kit BacLight per vitalità batterica Live/Dead</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9439023</td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Fisher Scientific</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Emina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Permaslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9693613</td><td></td></tr></tbody></table>

nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere camera

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

La natura di molte malattie croniche è attribuito alla formazione di biofilm batterici che sono recalcitranti alla tradizionale terapia antibiotica. Biofilm sono comunità di batteri associati collegato a una superficie e racchiusi in una matrice. Il ruolo della matrice extracellulare è multiforme, anche facilitando l&#39;acquisizione di nutrienti, e offre una protezione significativa contro gli stress ambientali (ad esempio risposta immunitaria). Nel tentativo di acquisire una migliore comprensione di come i batteri in un biofilm rispondere agli stress ambientali che abbiamo usato un protocollo in cui noi visualizziamo biofilm batterici che si sono formati in un 8-scivolo e da camera. I biofilm sono stati colorati con la BacLight Live / Dead macchia ed esaminate con un microscopio confocale a caratterizzare la dimensione relativa biofilm, e la struttura in diverse condizioni di incubazione. Z-stack immagini sono state raccolte tramite microscopia confocale e analizzati da COMSTAT. Questo protocollo può essere utilizzato per contribuire a spiegare il meccanismo e cinetica con cui formare biofilm, oltre a identificare i componenti che sono importanti per la struttura biofilm e la stabilità.

Questo articolo descrive la procedura per la formazione e la visualizzazione di un biofilm batterico cresciuto all&#39;interno di un 8-scivolo e da camera

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

La natura cronica di molte malattie è attribuita alla formazione di biofilm batterici, i quali risultano recalcitranti alla terapia antibiotica tradizionale. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare biofilm batterici nei pozzetti di una camera da scorrimento. Ogni pozzetto viene inizialmente inoculato con batteri in un mezzo di crescita, quindi coltivato a 37 gradi Celsius. Una volta formati i biofilm, un colorante vitale viene utilizzato per colorare le cellule.I biofilm vengono quindi lavati e fissati, e le pozzette sono sigillate utilizzando un coprivetrino. Infine, le cellule possono essere osservate mediante microscopia confocale e la morfologia dei diversi biofilm può essere caratterizzata. Un vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le celle a flusso, è che i volumi sono molto più piccoli e quindi riducono la quantità di qualsiasi composto sperimentale che verrà utilizzato.Inoltre, in una camera a otto pozzetti è possibile confrontare contemporaneamente un numero maggiore di variabili rispetto a una cella a flusso con tre camere. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a diverse domande fondamentali nel campo della microbiologia, come la cinetica della formazione del biofilm. Il metodo può inoltre fornire informazioni su molteplici malattie che presentano un componente biofilmico, quali l'otite media cronica, la fibrosi cistica e le infezioni croniche della vescica, solo per citarne alcune.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché esistono numerosi passaggi in cui il biofilm esistente può essere artificialmente perturbato. Pertanto, una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di rimozione e aggiunta del liquido sono difficili da apprendere e il rischio di perturbare il biofilm a causa delle forze di taglio è massimo proprio in questi punti del protocollo. A dimostrare la procedura oggi sarà Liz, una studentessa laureata del laboratorio. Inoculare i batteri in un mezzo di coltura liquido e incubare la coltura fino al raggiungimento della fase logaritmica media. Diluire la sospensione in fase logaritmica media in rapporto di uno a 2.500 in mezzo preriscaldato per Hemophilus influenzae non tipizzabile, che viene utilizzato in questo esempio.Questo fornirà 40.000 unità formanti colonie per millilitro come concentrazione iniziale. Trasferire asetticamente 200 microlitri di coltura diluita in ciascun pozzetto di una camera da microscopia sterile a otto pozzetti. Incubare la camera a 37 gradi Celsius in un'incubatrice con 5% di anidride carbonica per permettere ai batteri di iniziare a formare biofilm dopo 16-18 ore.Rimuovere la piastra dall'incubatore ed aspirare il mezzo dall'angolo di ogni camera. Quindi sostituirlo con 200 microlitri di mezzo fresco preriscaldato. Assicurarsi di aggiungere il nuovo mezzo lungo la parete delle camere per evitare di disturbare i biofilm.Rimettere la piastra nell'incubatrice e lasciare crescere le colture fino alla densità desiderata. Sostituire il mezzo ogni otto-sedici ore per mantenere la vitalità batterica. Per visualizzare i biofilm, rimuovere prima i soprannatanti di coltura come descritto in precedenza e lavare delicatamente i biofilm due volte utilizzando 200 microlitri di soluzione salina sterile.Dopo aver lavato i biofilm, aggiungere 200 microlitri di colorante live dead con retroilluminazione in ogni pozzetto di una piastra con otto camere. Preparare un volume totale di due millilitri di soluzione di colorante. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.A partire da questo passaggio, assicurarsi di proteggere il vetrino dalla luce. Incubare il vetrino al buio a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo aver colorato le cellule, rimuovere il colorante per la vitalità e lavare ogni pozzetto due volte con soluzione salina.Come dimostrato in precedenza, aggiungere 200 microlitri di formalina neutra tampone in ogni pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per fissare il campione. Al termine di questa incubazione, rimuovere e scartare il fissativo e lavare i biofilm due volte utilizzando soluzione salina; rimuovere i pozzetti di plastica dal vetrino e aggiungere circa 150 microlitri di soluzione salina a ciascuno. Coprire i pozzetti posizionando un coprioggetto sulla guarnizione, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria, e sigillare i bordi del coprioggetto con del mezzo di montaggio.In alternativa, lo smalto per unghie può essere utilizzato per sigillare il vetrino. In questo esempio, stiamo utilizzando lo smalto per unghie. Per una migliore visualizzazione della procedura, lasciare asciugare il sigillante a temperatura ambiente per almeno un'ora prima di esaminare i biofilm al microscopio. Questa immagine è una ricostruzione tridimensionale di immagini Zack di un biofilm di H influenza colorato con colorante vitale/morto, acquisite mediante microscopio confocale.Il biofilm mostrato qui è un esempio di biofilm formato da NTHI dopo 24 ore di crescita nella camera da coltura. Utilizzando questa tecnica, i batteri erano vitali al momento della fissazione, come indicato dalla fluorescenza verde e dall'assenza di fluorescenza rossa. L'architettura del biofilm può essere osservata con chiarezza, con numerose torri all'interno della struttura del biofilm e numerosi canali acquosi presenti.La vista laterale nel pannello B mostra l'altezza relativa del biofilm formato in questo punto temporale. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di aggiungere e rimuovere i liquidi dal pozzetto lentamente, per minimizzare la generazione di forze di taglio che potrebbero alterare il biofilm presente nel pozzetto. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre tecniche, come la marcatura immunoistochimica per proteine specifiche di interesse o la marcatura con lectine, al fine di rispondere ad ulteriori domande riguardanti i componenti biochimici presenti nella matrice formata dai batteri nel biofilm.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare una camera da otto pozzetti per studiare la formazione di biofilm batterici.

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