Name: C. elegans Learning Positivo Butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Impara a valutare la memoria associativa a breve e lungo termine in C. elegans mediante saggi di chemotassi verso il butanone. Questo metodo consente di studiare i meccanismi genetici dell'apprendimento e dell'invecchiamento cognitivo.

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Ringraziamo W. Ryu per consigli sulla nostra immagine iniziale di set-up, Z. Gitai per il suggerimento di utilizzare ImageJ 13 a contare i vermi, e J. Ashraf per un aiuto con Google SketchUp. CTM è uno studioso Pew in Scienze Biomediche, studioso McKnight, e un Scholar Keck.

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<li>Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CREB+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CREB and memory.</a> Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+image+transformations+for+an+automatic+screening+of+cervical+smears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears.</a> J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).</li>
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<li>Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il C. elegans olfattivo apprendimento associativo e test di memoria presentata qui distinguere tra i processi di apprendimento ammassati, distanziati di apprendimento, memoria a breve termine e memoria a lungo termine. Questi test si basano sulle capacità del worm &#39;di percepire gli odori alimentari e chimiche nel loro ambiente e 1,2 per formare associazioni positive tra le due. 6 Perciò, i test sono molto sensibili alla fame la popolazione di partenza degli animali, e grande attenzione deve da adottare per garantire che i vermi sono ben nutriti, prima e dopo l&#39;allenamento. Singola formazione ammassati i rendimenti a breve termine memoria associativa. L&#39;aumento del numero di periodi di condizionamento e paradigma di formazione distanziati è fondamentale per il raggiungimento a lungo termine memoria associativa in C. elegans come in altri organismi. 6,8 Forse questo test potrebbe essere modificato per produrre memoria a lungo termine di associazioni tra diversi stimoli condizionati e incondizionati. Il nostro apprendimento associativo e test di memoria può essere utilizzata per confrontare le capacità di apprendimento e la memoria di tipo selvatico di animali mutanti invecchiamento o genetiche. Per esempio, mentre sia l&#39;apprendimento associativo e di lungo periodo associativo declino della memoria abilità nel processo di invecchiamento wild-type worm, l&#39;apprendimento è mantenuto più a lungo con l&#39;età negli animali con segnalazione dell&#39;insulina ridotta, e l&#39;apprendimento e la memoria è mantenuta più a lungo con l&#39;età negli animali restrizione calorica 6. Questi test sono anche suscettibili di RNAi trattamento o la manipolazione farmacologica di C. elegans. Per esempio, il trattamento di vermi con daf-2 RNAi migliora a breve e lungo termine della memoria associativa, per converso, il blocco della trascrizione genica e sintesi proteica con farmaci (actinomicina D e cicloeximide, rispettivamente) durante l&#39;allenamento distanziati interrompe a lungo termine formazione della memoria. 6 Memoria a lungo termine è un processo che è cruciale per la sopravvivenza in tutti gli animali, e sembra che gran parte delle macchine molecolari coinvolti nella memoria di una associazione pavloviana è conservata da vermi ai mammiferi. 6 La capacità di distinguere e test di apprendimento associativo, breve termine e memoria a lungo termine con questi test olfattivi rende C. elegans un eccellente sistema per lo studio ulteriore della memoria, e può fornire una conoscenza dei processi neurodegenerativi che portano alla perdita di apprendimento e memoria negli esseri umani.

<table><tbody><tr><td>Azoturo di Sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227</td><td>Preparare una concentrazione 1 M in acqua distillata</td></tr><tr><td>Alcol Etilico 190 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>DSP-CT-18</td><td>&amp;gt;95% di Etanolo può contenere impurezze che interferiscono con i saggi di chemotassi</td></tr><tr><td>2-Butanone 99+%</td><td>Acros Organics</td><td>14967-0010</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CMOS a scansione areale Basler IEEE-1394/FireWire</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-683</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo Video InfiniMite &amp;#8211; Alpha Industrial</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-202</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore a Fibra Ottica Dolan-Jenner MI-150</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT55-718</td><td></td></tr><tr><td>Fondo luminoso 8&amp;#8221; x 8&amp;#8221;</td><td>Schott AG</td><td>A08927</td><td></td></tr><tr><td>Supporto Standard con Braccio</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-120</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per Asta da 3/4&amp;#8221; per Supporti con Braccio</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-124</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Montaggio Fissa Standard 1/4-20</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-122</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans learning positivo butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Il ricordo di esperienze e di informazioni apprese è fondamentale per gli organismi di fare delle scelte che gli aiuti la loro sopravvivenza. C. elegans naviga il suo ambiente attraverso neurone-specifica rilevazione degli odori alimentari e chimiche 1, 2, e può associare gli stati nutritivo con odori chimici 3, temperatura 4, e la patogenicità di una fonte di cibo 5. Qui, descriviamo saggi di C. elegans apprendimento associativo e di breve e lungo termine della memoria associativa. Abbiamo modificato un paradigma avversiva olfattivo di apprendimento 6 a produrre invece una risposta positiva, il test coinvolge affamati ~ 400 vermi, poi alimentare i vermi, alla presenza del neurone-AWC percepito butanone volatili chemoattractant ad una concentrazione che provoca un basso indice chemiotattico (simile a Toroyama et al. 7). Una popolazione standard chemiotassi assay1 test di attrazione dei worm &#39;al odorizzante immediatamente o minuti a ore dopo il condizionamento. Dopo chemiotassi condizionata, wild-type animali &#39;ad aumenti butanone ~ 0,6 chemiotassi unità di indice, il suo &quot;Indice di apprendimento&quot;. Apprendimento associativo dipende dalla presenza di cibo e butanone durante l&#39;allenamento. Abbinamento cibo e butanone per un periodo di condizionamento singolo (&quot;formazione ammassati&quot;) produce memoria a breve termine associativa che dura circa 2 ore. Periodi di condizionamento multipli con periodi di riposo tra (&quot;formazione distanziati&quot;) rendimenti a lungo termine della memoria associativa (&lt;40 ore), e dipende dalla proteina cAMP Response Element Binding (CREB), 6 un fattore di trascrizione necessari per la memoria a lungo termine attraverso specie 8. Il nostro protocollo comprende anche i metodi di analisi delle immagini per la determinazione rapida e precisa degli indici chemiotassi. Immagini ad alto contrasto di animali su piastre saggio chemiotassi vengono catturati e analizzati dal software verme conteggio in MatLab. Il software corregge per lo sfondo non uniforme utilizzando una trasformazione morfologica tophat. Metodo 9 Otsu viene quindi utilizzato per determinare una soglia di vermi separati dallo sfondo. 10 particelle molto piccole vengono rimosse automaticamente e più grandi non-vite senza fine regioni (bordi piastra o pugni agar) sono rimosso dalla selezione manuale. Il software stime allora la dimensione del singolo verme, ignorando le regioni che si trovano sopra una dimensione massima specificata e prendendo la dimensione media delle restanti regioni. Il numero di worm è poi determinato dividendo l&#39;area totale occupata dal identificata come vermi dalle dimensioni stimato di un singolo verme. Abbiamo scoperto che l&#39;apprendimento e la breve e memoria a lungo termine possono essere distinti, e che questi processi condividono simili molecole chiave con organismi superiori. 6,8 nostro test può rapidamente testare geni candidati romanzo o molecole che influenzano l&#39;apprendimento e la breve oa lungo termine di memoria in C. elegans che sono rilevanti tra le specie.

Qui si descrivono i metodi per testare C. elegans apprendimento associativo e di breve e lungo termine della memoria associativa. Questi test popolazione impiegare le capacità worm per chemiotassi verso odoranti volatili, e la forma associazioni positive su di abbinamento cibo con il butanone chemoattractant. Aumentare il numero di periodi di condizionamento induce memoria a lungo termine.

C. elegans Learning Positivo Butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa

La memoria delle esperienze e delle informazioni apprese è fondamentale affinché gli organismi possano compiere scelte che ne favoriscano la sopravvivenza. C. elegans esplora il proprio ambiente...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è testare la memoria a breve e a lungo termine di un'associazione positiva appresa tra cibo e l'attrattante chimico butano, utilizzando C. elegans come modello. Questo viene ottenuto prima sottoponendo a digiuno, per un'ora, vermi adulti giovani ben nutriti e sincronizzati.Successivamente, i vermi vengono addestrati in presenza di cibo e butanone, mediante condizionamento massivo per la memoria associativa a breve termine e mediante condizionamento frazionato per la memoria associativa a lungo termine. Dopo il condizionamento, si misura la chemotassi verso il butanone e la si confronta con la chemotassi di vermi non addestrati. Per studiare la conservazione della memoria, si ottengono risultati che mostrano la durata della memoria associativa a breve e a lungo termine dell'associazione appresa tra cibo e butanone, in base alle variazioni dell'indice di apprendimento.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'invecchiamento cognitivo e delle malattie, ad esempio quali percorsi genetici sono necessari per la funzione neuronale durante l'invecchiamento normale e in condizioni di malattia neurodegenerativa, e come possano essere migliorati l'apprendimento e la memoria. In condizioni di compromissione cognitiva, i vermi vengono preparati utilizzando metodi standard su piastre di agar ad alto contenuto nutritivo da 100 millimetri, seminate con un millilitro di OP50 di e coli. Utilizzare adulti giovani a una densità di circa 5.000 vermi o meno per piastra.Raccogliere i vermi versando delicatamente il buffer M nine sulla piastra e facendo staccare i vermi con un movimento rotatorio. Cercare di minimizzare l'agitazione, che potrebbe staccare batteri indesiderati. Successivamente, inclinare la piastra ed aspirare la miscela di vermi e buffer dall'angolo.Utilizzando una pipetta P1000, trasferire i vermi in un tubo conico da 15 millilitri. Avere cura di non aspirare i vermi contro la parete del tubo se questi rimangono sulla piastra.Ripetere questo passaggio da una a due volte. Lasciare sedimentare i vermi sul fondo del tubo per gravità. La centrifugazione non è consigliata per ottenere i migliori risultati.Dopo il sedimentamento, rimuovere il sopranatante mediante aspirazione e lavare con almeno tre-quattro millilitri di tampone M nine. Procedere rapidamente per evitare la privazione nutrizionale. Ripetere questa procedura due volte per un totale di tre lavaggi.A questo punto, un gruppo di vermi può essere messo da parte per fungere da gruppo naïve nei saggi di chemiotassi che verranno dimostrati in seguito; aggiungere tre o quattro millilitri di tampone M9 al tubo e lasciare i vermi in digiuno a temperatura ambiente per un'ora. Preparare le piastre di condizionamento tracciando due microlitri di butano al 10% in etanolo al 95% sull'interno dei coperchi di piastre NGM da 60 millimetri precedentemente seminate con 500 microlitri di OP50 E. coli. Rimuovere il soprannatante dal tubo contenente i vermi digiuni e utilizzare una pipetta P1000 per trasferire da 100 a 200 microlitri di vermi su ciascuna piastra di condizionamento. Incubare le piastre di condizionamento a temperatura ambiente per un'ora dopo il condizionamento.Lavare i vermi dalle piastre con circa un millilitro di tampone M nove e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri. Ripetere i metodi di lavaggio delicato mostrati in precedenza fino a quando il tampone appare chiaro. Dopo il lavaggio, un sottoinsieme di vermi può essere prelevato e sottoposto al saggio di chemotassi per costituire il gruppo al tempo zero per l'apprendimento associativo una volta mast, al fine di preparare piastre rappresentative di ulteriori punti temporali.Trasferire da 100 a 200 microlitri di vermi su piastre NGM da 60 millimetri seminate. Incubare queste piastre post condizionate per 0,51 o due ore a temperatura ambiente. Dopo ogni punto temporale, lavare delicatamente i vermi dalle piastre in un tubo conico da 15 millilitri e ancora una o due volte in più.Con tampone M nine, seguendo le stesse procedure di lavaggio delicate, si verifica la memoria associativa a breve termine utilizzando il saggio di chemiotassi, che sarà dimostrato in seguito. Preparare le piastre di condizionamento e i vermi come illustrato per l'addestramento a breve termine, ma lasciare i vermi in incubazione a temperatura ambiente solo per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, raccogliere i vermi come precedentemente illustrato.Trasferirli su piastre NGM da 60 millimetri NON SEMINATE. Mantenere i vermi su piastre non seminate a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo che i vermi sono stati sottoposti a digiuno, lavarli con tampone M nove e riposizionarli nel tubo conico da 15 millilitri. Ripetere questi passaggi fino a quando non siano stati completati un totale di sette blocchi di condizionamento e sei blocchi di digiuno.Al termine della condizionatura, lavare i vermi dalle piastre di condizionatura e riposizionarli in un tubo conico. Come mostrato in precedenza, un gruppo di vermi può essere utilizzato per verificare l'apprendimento associativo a sette intervalli temporali immediatamente dopo la condizionatura. Trasferire la popolazione rimanente di vermi su piastre HGM da 100 millimetri seminate con un millilitro di OP50.Applicare nuovamente da 100 a 200 microlitri di vermi per piastra per assicurare che ci sia una quantità sufficiente di batteri a sostegno della popolazione. Incubare le piastre post-condizionamento a 20 gradi Celsius per 1624 o 40 ore, corrispondenti ai punti temporali della memoria associativa a lungo termine, al fine di verificare la memoria associativa a lungo termine dell'alimento butan nota associazione. Lavare delicatamente i vermi dalle piastre in un tubo conico da 15 millilitri, e nuovamente, una o due volte con tampone M nove dopo ciascun punto temporale, quindi sottoporre i vermi al saggio di chemotassi.Per preparare le piastre per il saggio di chemiotassi, segnare il fondo delle piastre NGM da 100 millimetri non inoculate con dei punti vicino al bordo in tre posizioni come mostrato qui. Applicare un microlitro di azoturo di sodio uno molare nei punti dell'odorante e nei punti di controllo. Non più di 15 minuti prima dell'inizio del saggio, per minimizzare la diffusione degli agenti paralizzanti.Successivamente, applicare un microlitro di etanolo al 95% e un microlitro di butanone al 10% sui rispettivi punti della piastra per saggio precedentemente segnata. Sopra il punto di azoturo di sodio precedentemente applicato. Rimuovere la maggior quantità possibile del tampone M nine dal tubo contenente i vermi sedimentati.Utilizzare una pipetta P20 con punta precampionata per aggiungere 15 microlitri di vermi in tre intervalli da cinque microlitri ciascuno al punto di origine della piastra per il saggio. Successivamente, arrotolare l'angolo di un fazzoletto Kim in una punta fine e usarlo per asciugare l'eccesso di tampone M9, avendo cura di non perforare l'agar.La rimozione del buffer in eccesso rilascia i vermi sulla piastra per il saggio. Se si utilizza l'analisi mediante immagini per contare i vermi, un'immagine dell'origine immediatamente dopo questo rilascio fornirà il numero totale di animali per la piastra del saggio. Incubare la piastra per il saggio di chemiotassi per un'ora a temperatura ambiente dopo l'incubazione, quindi contare il numero di vermi presenti nei punti di origine contenenti etanolo e butanone, oltre al numero totale di vermi sulla piastra del saggio.In genere, i vermi paralizzati dall'azoturo di sodio si troveranno entro un raggio di un centimetro dai punti e appariranno completamente rigidi. Quando molti animali sono ammassati l'uno sull'altro, i vermi possono essere contati manualmente oppure quantificati mediante software di analisi delle immagini. Preferiamo questo ultimo metodo per la facilità e l'affidabilità dei risultati.Dopo aver quantificato i vermi presenti nei punti di origine degli spot di etanolo e butanone, calcolare l'indice KeyAx come mostrato qui. L'indice di chemiotassi tipico per vermi di tipo selvatico in risposta al 10% di butanone è circa 0,2. La formazione di tipo mast o intervallata aumenta generalmente l'indice di CHEMOTASSI a valori compresi tra 0,7 e 0,8 al tempo zero, ottenendo un indice di apprendimento di circa 0,6.La chemiotassi naive è altamente sensibile a un'adeguata cura dei vermi. Questa figura mostra la marcata differenza nell'indice di chemiotassi (CI) tra vermi naive ben nutriti e vermi in stato di privazione, evidenziando l'importanza di una tecnica corretta. La conservazione della memoria è riflessa dal tempo necessario affinché l'indice di chemiotassi del Texas ritorni a livelli naive quando l'indice di apprendimento è pari a zero negli animali di tipo selvatico.La memoria associativa a breve termine inizia a diminuire già un'ora dopo un addestramento di massa della durata di circa due ore ed è indipendente dal fattore di trascrizione kreb, a confronto. La memoria associativa a lungo termine di norma non inizia un declino significativo prima di 16 ore dopo un addestramento nello spazio della durata massima di 40 ore ed è dipendente da Creb. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che i saggi di chemiotassi possono essere influenzati dalla fame o da odori eccessivi nell'ambiente, e che la memoria nei vermi può essere alterata da un'eccessiva agitazione fisica.

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