C. elegans Learning Positivo Butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa

L'obiettivo generale del seguente esperimento è testare la memoria a breve e a lungo termine di un'associazione positiva appresa tra cibo e l'attrattante chimico butano, utilizzando C. elegans come modello. Questo viene ottenuto prima sottoponendo a digiuno, per un'ora, vermi adulti giovani ben nutriti e sincronizzati.

Successivamente, i vermi vengono addestrati in presenza di cibo e butanone, mediante condizionamento massivo per la memoria associativa a breve termine e mediante condizionamento frazionato per la memoria associativa a lungo termine. Dopo il condizionamento, si misura la chemotassi verso il butanone e la si confronta con la chemotassi di vermi non addestrati. Per studiare la conservazione della memoria, si ottengono risultati che mostrano la durata della memoria associativa a breve e a lungo termine dell'associazione appresa tra cibo e butanone, in base alle variazioni dell'indice di apprendimento.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'invecchiamento cognitivo e delle malattie, ad esempio quali percorsi genetici sono necessari per la funzione neuronale durante l'invecchiamento normale e in condizioni di malattia neurodegenerativa, e come possano essere migliorati l'apprendimento e la memoria. In condizioni di compromissione cognitiva, i vermi vengono preparati utilizzando metodi standard su piastre di agar ad alto contenuto nutritivo da 100 millimetri, seminate con un millilitro di OP50 di e coli. Utilizzare adulti giovani a una densità di circa 5.000 vermi o meno per piastra.

Raccogliere i vermi versando delicatamente il buffer M nine sulla piastra e facendo staccare i vermi con un movimento rotatorio. Cercare di minimizzare l'agitazione, che potrebbe staccare batteri indesiderati. Successivamente, inclinare la piastra ed aspirare la miscela di vermi e buffer dall'angolo.

Utilizzando una pipetta P1000, trasferire i vermi in un tubo conico da 15 millilitri. Avere cura di non aspirare i vermi contro la parete del tubo se questi rimangono sulla piastra.

Ripetere questo passaggio da una a due volte. Lasciare sedimentare i vermi sul fondo del tubo per gravità. La centrifugazione non è consigliata per ottenere i migliori risultati.

Dopo il sedimentamento, rimuovere il sopranatante mediante aspirazione e lavare con almeno tre-quattro millilitri di tampone M nine. Procedere rapidamente per evitare la privazione nutrizionale. Ripetere questa procedura due volte per un totale di tre lavaggi.

A questo punto, un gruppo di vermi può essere messo da parte per fungere da gruppo naïve nei saggi di chemiotassi che verranno dimostrati in seguito; aggiungere tre o quattro millilitri di tampone M9 al tubo e lasciare i vermi in digiuno a temperatura ambiente per un'ora. Preparare le piastre di condizionamento tracciando due microlitri di butano al 10% in etanolo al 95% sull'interno dei coperchi di piastre NGM da 60 millimetri precedentemente seminate con 500 microlitri di OP50 E. coli. Rimuovere il soprannatante dal tubo contenente i vermi digiuni e utilizzare una pipetta P1000 per trasferire da 100 a 200 microlitri di vermi su ciascuna piastra di condizionamento. Incubare le piastre di condizionamento a temperatura ambiente per un'ora dopo il condizionamento.

Lavare i vermi dalle piastre con circa un millilitro di tampone M nove e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri. Ripetere i metodi di lavaggio delicato mostrati in precedenza fino a quando il tampone appare chiaro. Dopo il lavaggio, un sottoinsieme di vermi può essere prelevato e sottoposto al saggio di chemotassi per costituire il gruppo al tempo zero per l'apprendimento associativo una volta mast, al fine di preparare piastre rappresentative di ulteriori punti temporali.

Trasferire da 100 a 200 microlitri di vermi su piastre NGM da 60 millimetri seminate. Incubare queste piastre post condizionate per 0,51 o due ore a temperatura ambiente. Dopo ogni punto temporale, lavare delicatamente i vermi dalle piastre in un tubo conico da 15 millilitri e ancora una o due volte in più.

Con tampone M nine, seguendo le stesse procedure di lavaggio delicate, si verifica la memoria associativa a breve termine utilizzando il saggio di chemiotassi, che sarà dimostrato in seguito. Preparare le piastre di condizionamento e i vermi come illustrato per l'addestramento a breve termine, ma lasciare i vermi in incubazione a temperatura ambiente solo per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, raccogliere i vermi come precedentemente illustrato.

Trasferirli su piastre NGM da 60 millimetri NON SEMINATE. Mantenere i vermi su piastre non seminate a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo che i vermi sono stati sottoposti a digiuno, lavarli con tampone M nove e riposizionarli nel tubo conico da 15 millilitri. Ripetere questi passaggi fino a quando non siano stati completati un totale di sette blocchi di condizionamento e sei blocchi di digiuno.

Al termine della condizionatura, lavare i vermi dalle piastre di condizionatura e riposizionarli in un tubo conico. Come mostrato in precedenza, un gruppo di vermi può essere utilizzato per verificare l'apprendimento associativo a sette intervalli temporali immediatamente dopo la condizionatura. Trasferire la popolazione rimanente di vermi su piastre HGM da 100 millimetri seminate con un millilitro di OP50.

Applicare nuovamente da 100 a 200 microlitri di vermi per piastra per assicurare che ci sia una quantità sufficiente di batteri a sostegno della popolazione. Incubare le piastre post-condizionamento a 20 gradi Celsius per 1624 o 40 ore, corrispondenti ai punti temporali della memoria associativa a lungo termine, al fine di verificare la memoria associativa a lungo termine dell'alimento butan nota associazione. Lavare delicatamente i vermi dalle piastre in un tubo conico da 15 millilitri, e nuovamente, una o due volte con tampone M nove dopo ciascun punto temporale, quindi sottoporre i vermi al saggio di chemotassi.

Per preparare le piastre per il saggio di chemiotassi, segnare il fondo delle piastre NGM da 100 millimetri non inoculate con dei punti vicino al bordo in tre posizioni come mostrato qui. Applicare un microlitro di azoturo di sodio uno molare nei punti dell'odorante e nei punti di controllo. Non più di 15 minuti prima dell'inizio del saggio, per minimizzare la diffusione degli agenti paralizzanti.

Successivamente, applicare un microlitro di etanolo al 95% e un microlitro di butanone al 10% sui rispettivi punti della piastra per saggio precedentemente segnata. Sopra il punto di azoturo di sodio precedentemente applicato. Rimuovere la maggior quantità possibile del tampone M nine dal tubo contenente i vermi sedimentati.

Utilizzare una pipetta P20 con punta precampionata per aggiungere 15 microlitri di vermi in tre intervalli da cinque microlitri ciascuno al punto di origine della piastra per il saggio. Successivamente, arrotolare l'angolo di un fazzoletto Kim in una punta fine e usarlo per asciugare l'eccesso di tampone M9, avendo cura di non perforare l'agar.

La rimozione del buffer in eccesso rilascia i vermi sulla piastra per il saggio. Se si utilizza l'analisi mediante immagini per contare i vermi, un'immagine dell'origine immediatamente dopo questo rilascio fornirà il numero totale di animali per la piastra del saggio. Incubare la piastra per il saggio di chemiotassi per un'ora a temperatura ambiente dopo l'incubazione, quindi contare il numero di vermi presenti nei punti di origine contenenti etanolo e butanone, oltre al numero totale di vermi sulla piastra del saggio.

In genere, i vermi paralizzati dall'azoturo di sodio si troveranno entro un raggio di un centimetro dai punti e appariranno completamente rigidi. Quando molti animali sono ammassati l'uno sull'altro, i vermi possono essere contati manualmente oppure quantificati mediante software di analisi delle immagini. Preferiamo questo ultimo metodo per la facilità e l'affidabilità dei risultati.

Dopo aver quantificato i vermi presenti nei punti di origine degli spot di etanolo e butanone, calcolare l'indice KeyAx come mostrato qui. L'indice di chemiotassi tipico per vermi di tipo selvatico in risposta al 10% di butanone è circa 0,2. La formazione di tipo mast o intervallata aumenta generalmente l'indice di CHEMOTASSI a valori compresi tra 0,7 e 0,8 al tempo zero, ottenendo un indice di apprendimento di circa 0,6.

La chemiotassi naive è altamente sensibile a un'adeguata cura dei vermi. Questa figura mostra la marcata differenza nell'indice di chemiotassi (CI) tra vermi naive ben nutriti e vermi in stato di privazione, evidenziando l'importanza di una tecnica corretta. La conservazione della memoria è riflessa dal tempo necessario affinché l'indice di chemiotassi del Texas ritorni a livelli naive quando l'indice di apprendimento è pari a zero negli animali di tipo selvatico.

La memoria associativa a breve termine inizia a diminuire già un'ora dopo un addestramento di massa della durata di circa due ore ed è indipendente dal fattore di trascrizione kreb, a confronto. La memoria associativa a lungo termine di norma non inizia un declino significativo prima di 16 ore dopo un addestramento nello spazio della durata massima di 40 ore ed è dipendente da Creb. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che i saggi di chemiotassi possono essere influenzati dalla fame o da odori eccessivi nell'ambiente, e che la memoria nei vermi può essere alterata da un'eccessiva agitazione fisica.