Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un fenotipaggio ad alto rendimento con topi vivi o fissati, utilizzando una risonanza magnetica cerebrale multiplo nei topi. Questo risultato si ottiene innanzitutto anestetizzando ogni topo. Successivamente, per la scansione in vivo, posizionare ogni topo su una slitta delle dimensioni appropriate prima di montarlo su un array di carico e di posizionarlo all'interno del foro del magnete.

In alternativa, per l'imaging ex vivo, eseguire una perfusione transcardiaca, isolare la struttura del cranio e posizionarla in tubi per imaging, che vengono quindi inseriti in un array a 16 canali di bobine solenoidali posizionato all'interno del foro del magnete. Alla fine, è possibile ottenere volumi tridimensionali di imaging a risonanza magnetica che mostrano immagini cerebrali di alta qualità, adatte per il fenotipaggio, nonché strutture maggiori e minori del cervello del topo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'istologia, è che conserva l'anatomia macroscopica dei campioni ancora all'interno dei crani, permettendo una copertura dell'intero cervello e un'analisi tridimensionale.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori biomedici, ad esempio riguardo alla relazione tra geni e differenze anatomiche che rappresentano fenotipi nel modello murino di malattia. In generale, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica troverà difficoltoso lo sviluppo di sistemi personalizzati per il caricamento dei topi e di array di bobine radiofrequenza necessari per l'acquisizione di immagini cerebrali ad alta produttività. La parte più complessa. Prima di iniziare questo protocollo, è necessario ottenere l'approvazione per tutte le procedure di manipolazione di massa da parte del comitato per la cura degli animali della propria istituzione, del comitato locale per la cura e l'uso degli animali, del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali o di un ente equivalente, oltre a procedure preliminari come l'identificazione e la pesatura.

Le registrazioni sugli animali devono essere effettuate all'interno di una cappa a sicurezza biologica. Successivamente, trasferire gli animali in un contenitore di plastica autoclavabile per il trasporto alla camera di induzione per risonanza magnetica. Anestetizzare gli animali da sottoporre a scansione nella camera di induzione preriscaldata utilizzando fluoruro di isoflurano al 4% e quattro litri al minuto di ossigeno.

Gli animali sono completamente anestetizzati quando non rispondono alla pressione sulle zampe. Se necessario, il pelo del torace può essere rimosso utilizzando un depilatore come nare, al fine di garantire un migliore contatto con i dispositivi di monitoraggio dell'ECG e della temperatura integrati nel slittino personalizzato. Applicare inoltre una soluzione oftalmica come lacrime artificiali PMM agli occhi per prevenire l'essiccamento e somministrare circa 0,3 millilitri di soluzione salina mediante iniezione sottocutanea.

Per idratare gli animali. Posizionare ora i topi su slitte individuali dotate di sonde incorporate per l'ECG, la respirazione e la temperatura. Prestare attenzione a posizionare gli arti anteriori e posteriori nelle depressioni presenti sulle slitte.

Nel caso in cui sia richiesto il monitoraggio dell'ECG, assicurarsi che le regioni prive di peli sulla pancia del topo siano allineate con le sonde dell'ECG, immobilizzare ogni animale con un cinturino per la testa e uno per il muso, quindi inserire ogni slitta in un tubo conico da 50 millilitri aperto alle estremità. Fino a sette topi vivi possono essere preparati per la scansione in una singola sessione di imaging. Successivamente, montare i tubi conici sull'apposito array di carico.

Assicurarsi di collegare tutte le linee di monitoraggio fisiologico una volta caricati tutti gli animali. Impostare il livello di isoflurano nel foro del magnete al 2% e il livello di ossigeno a otto litri al minuto. Trasportare ora l'array di caricamento al magnete e posizionarlo sul sistema di binari.

Utilizzare il sistema a rotaia per accoppiare l'array di carico con l'alveare per topi, progettato per posizionare i topi in modo uniforme all'interno di ciascuna bobina a radiofrequenza posizionata al centro del foro del magnete. Quando l'array è completamente inserito nel magnete, i tubi centrifuga si agganciano al sistema di somministrazione dell'anestetico all'interno delle bobine RF, come mostrato qui; il fluoruro ISOF mescolato con ossigeno viene fornito dall'alveare per topi al campione attraverso un tubo lungo l'asse di ciascuna bobina singola. Questa miscela gassosa anestetica fluisce nei tubi oltrepassando i topi ed è raccolta da un'unità di aspirazione attiva collegata alla parte posteriore dell'array di carico.

In base alle letture fisiologiche degli animali, come la respirazione e la temperatura, i livelli di isoflurano dovrebbero essere impostati tra lo 0,9 e il 2%. Ora, eseguire la scansione degli animali utilizzando una sequenza eco a bin rapida. La durata di ciascuna scansione tridimensionale è di circa tre ore, con una risoluzione dell'immagine risultante di 125 micrometri. Assicurarsi di monitorare costantemente i parametri di ECG, respirazione e temperatura su ciascun animale durante tutta la durata della scansione.

Gli animali devono inoltre essere mantenuti al caldo durante la sessione di scansione mediante un flusso di aria riscaldata. Al termine della scansione, rimuovere l'array di carico dal magnete e posizionarlo in una camera di induzione calda riempita con ossigeno al 100%. Scaricare gli animali dai tubi e trasferirli in contenitori sigillati di plastica per il trasporto verso un armadio a sicurezza biologica.

Infine, posizionare gli animali in una gabbia calda e protetta dalle correnti d'aria e lasciarli riprendere dall'anestesia per l'imaging animale ex vivo. In primo luogo, anestetizzare completamente gli animali mediante iniezione intraperitoneale di una combinazione di chetamina e xilazina. Prima di iniziare la perfusione, valutare il livello chirurgico di anestesia mediante pinzatura dell'alluce o della zampa.

Aprire la cavità toracica e inserire un ago o un set di infusione con ala di sicurezza nel ventricolo sinistro del cuore. Quindi tagliare l'atrio destro per iniziare la perfusione transcardiaca. Inizialmente effettuare un lavaggio con 30 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato 1x a temperatura ambiente, miscelata con eparina a 1 microlitro per millilitro e 2 millimoli di pro hands, utilizzando un flusso di circa 100 millilitri all'ora.

Questo dovrebbe richiedere circa 20 minuti. Successivamente, effettuare un passaggio di fissazione con 30 millilitri di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente, miscelata con due millimoli di pro hands, a una velocità di 100 millilitri all'ora. Ora decapitare l'animale e rimuovere la pelle, la mandibola inferiore, le orecchie e la punta del naso cartilaginea.

Quindi posizionare la struttura cranica rimanente in paraformaldeide al 4% mescolata con due millimolari di pro hands e lasciare in incubazione tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire il campione in una soluzione di saline tamponato al fosfato 1x, mescolata con azide di sodio allo 0,02% e due millimolari di pro hands per la conservazione. La scansione MRI tridimensionale ad alta risoluzione a sette Tesla deve avvenire almeno quattro giorni dopo, ma non oltre due mesi e mezzo.

Dopo la perfusione, posizionare i cervelli da immagini in un array di bobine solenoidali a 16 canali e inserire questo nell'apparecchio di scansione. Scansionare ora i campioni utilizzando una sequenza di eco a spin veloce.

La durata di questa scansione è di circa 12 ore e le immagini finali avranno una risoluzione isotropica di 32 micrometri. Al termine della scansione, rimuovere i campioni dalla bobina di imaging e posizionare ciascun cranio in una soluzione di formalina al 10% con due millimoli di pro hands per la conservazione rappresentativa in vivo. Qui sono mostrate multiple immagini di cervelli di topo ottenute da una singola scansione di tre ore.

Questa figura mostra tre assi di visualizzazione per ciascuno dei sette topi sottoposti a scansione. Di seguito è riportata un'immagine rappresentativa del cervello ex vivo con risoluzione isotropica di 32 micron. E qui possiamo vedere una ricostruzione tridimensionale di un volume di immagine ex vivo una volta acquisita.

Questa tecnica in vivo può essere eseguita in tre o quattro ore se svolta correttamente. Questa tecnica può essere utilizzata da ricercatori in molti settori biomedici per studiare malattie come il lupus, la malattia di Huntington e la malattia di Alzheimer nel modello murino. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere immagini cerebrali di alta qualità mediante risonanza magnetica, sia su soggetti vivi che fissati.

Grazie per aver guardato.