Isolamento dei ribosomi Tradurre contenenti peptidil-tRNA per le analisi funzionali e strutturali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare la struttura e la funzione di ribosomi puri contenenti un TRNA peptidilico unico. Questo viene ottenuto eseguendo saggi di traduzione in vitro con estratti acellulari privi di fattori di rilascio e mRNA marcati con biotina, al fine di generare complessi ribosomiali arrestati con peptidil-TRNA legati agli mRNA marcati con biotina. Come secondo passaggio, perle paramagnetiche legate alla streptavidina vengono mescolate ai saggi di traduzione in vitro per consentire la loro interazione con le molecole di biotina presenti nell'mRNA.

In seguito, le perle vengono estratte utilizzando campi magnetici che separano i complessi ribosomiali arrestati di peptidil-tRNA legati agli mRNA dall'intera reazione. Successivamente, i complessi ribosomiali di peptidil-tRNA purificati possono essere mescolati con fattori traduzionali come fattori di rilascio, antibiotici inibitori o agenti chimici modificanti, al fine di analizzarne la funzione. Si ottengono risultati che mostrano l'inibizione dell'idrolisi dei peptidil-tRNA e la sua correlazione con modifiche strutturali nei ribosomi, basati su saggi di attività della peptidil transferasi o di terminazione traduzionale mediante gel SDS-PAGE o Tris-PAGE e saggi di protezione da modificazione mediante gel urea-PAGE.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la centrifugazione differenziale, è che i campioni isolati contengono prevalentemente ribosomi con un'unica popolazione di tRNA pep. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'espressione genica, come la natura dei polipeptidi nascenti e il modo in cui gli antibiotici influenzano la funzione ribosomiale modulando il processo di traduzione. Per iniziare questa procedura, ottenere due grammi di pellet batterico secco di E. coli proveniente da colture in fase logaritmica.

Lavare il pellet sospendendolo in un litro di tampone, seguito da centrifugazione a 5.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver effettuato due lavaggi, sospendere il pellet batterico risultante in 40 millilitri di tampone e rompere le cellule batteriche utilizzando una pressa francese applicando una pressione di 6.000 PSI. Questa pressione corrisponde a 600 unità utilizzando un pistone da un pollice.

Raccogliere la sospensione disgregata in un tubo di vetro pulito da 50 millilitri. Trattare la sospensione disgregata con triolo DIO o DTT ad una concentrazione di un millimolare, quindi centrifugare il campione a 30.000 ×g per 30 minuti. Rimuovere il soprannatante ottenuto e ripetere la procedura di centrifugazione.

Conservare il soprannatante ottenuto dalla seconda centrifugazione, distribuire il soprannatante finale in microtubi. Infine, congelare rapidamente le aliquote utilizzando una miscela di anidride carbonica solida ed etanolo o azoto liquido e conservare i campioni a meno 60 o meno 80 gradi Celsius.

Iniziare la preparazione di estratti acellulari privi del fattore di rilascio due mescolando 4,5 millilitri di sferette in sospensione di proteina A spheros four B con cinque millilitri di un antisiero anti fattore di rilascio due. Ruotare la miscela su una ruota rotante a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare la miscela a 2.500 G per separare le sferette dall'antisiero.

Eliminare il soprannatante. Le perle contengono ora gli anticorpi anti RF due e saranno indicate come perle anti RF due. Lavare le perle risospendendole in un millilitro di buffer B.

Quindi centrifugare le perle come in precedenza per separare le perle anti RF due dal buffer B. Ripetere questa procedura di lavaggio due volte. Dopo il lavaggio delle perle, mescolare un millilitro dell'estratto acellulare con 150 microlitri di perle anti RF due e incubare su una ruota rotante a quattro gradi Celsius per due ore dopo l'incubazione. Centrifugare la miscela a 10.000 G per separare l'estratto acellulare dalle perle.

Rimuovere il soprannatante e trattarlo nuovamente con altri 150 microlitri di anti RF due perle prima di ripetere l'incubazione e il recupero per la seconda volta. Distribuire la soluzione finale di estratto acellulare privo di RF due in microtubi da 100 microlitri ciascuno. Congelare le aliquote utilizzando una miscela di anidride carbonica solida ed etanolo o azoto liquido e conservare a meno 60 o meno 80 gradi Celsius.

Preparare la reazione PCR combinando il template plasmidico contenente le sequenze da tradurre, oligonucleotidi deossi, DTP, DNA polimerasi integra e tampone PCR secondo la strategia. Una volta preparato il campione PCR, eseguire la reazione di amplificazione e precipitare il DNA per purificare i prodotti PCR aggiungendo un decimo di volume di acetato di sodio 3 M a pH 5,2 e due volumi di etanolo ghiacciato. Dopo aver ripetuto la procedura di precipitazione un'altra volta, sospenderemo il DNA risultante in 100 microlitri di acqua trattata con diclorodimetilcarbonato o acqua trattata con dsy.

Verificare l'integrità dei prodotti della PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Tipicamente, questa procedura produce 100 microgrammi di un prodotto di DNA di 600 paia di basi. Preparare una reazione di trascrizione in vitro di 100 microlitri in acqua trattata con DEPC mescolando cinque microgrammi del frammento di DNA ottenuto dalla PCR con nucleotidi ribonucleici marcati con biotina (UTP) e una miscela enzimatica T7.

Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per tre ore. Per quantificare la quantità di mRNA ottenuta, eliminare il template di DNA aggiungendo DNasi priva di RNA. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Per purificare i prodotti di mRNA, precipitare l'RNA due volte aggiungendo un decimo di volume di acetato di sodio 3 M a pH 5,2 e due volumi di etanolo freddo; risospendere l'mRNA precipitato in 100 microlitri di acqua trattata con dpci. Verificare l'integrità dei prodotti di mRNA marcati con biotina mediante elettroforesi su gel aros. Di solito questa procedura consente di ottenere da uno a due milligrammi di un prodotto di mRNA marcato con biotina di 600 nucleotidi, da utilizzare per iniziare l'isolamento dei ribosomi in traduzione contenenti un peptidyl-tRNA. Si prepara una miscela di reazione di traduzione in vitro da 500 microlitri in acqua trattata con dey.

Per prima cosa, preparare la miscela di reazione tamponata descritta nel protocollo scritto allegato, quindi aggiungere 75 M di ciascun aminoacido, tranne quello che verrà sostituito con un aminoacido radioattivo. Successivamente, aggiungere da 20 a 50 microlitri dell'estratto privo di cellule RF due depleto alla soluzione tampone contenente gli aminoacidi. Incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire l'attivazione dei ribosomi.

Una volta attivati i ribosomi, aggiungere al campione da 10 a 15 microgrammi di mRNA marcati con biotina. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Nel frattempo, preparare tre millilitri di microsferette paramagnetiche di streptavidina o SMB in tampone C. Dopo l'incubazione, aggiungere la sospensione di SMP alla miscela di reazione di traduzione. Incubare la nuova sospensione a temperatura ambiente per 10 minuti. Separare le SMB dalla miscela applicando un campo magnetico mediante supporti per separazione magnetica. Resus.

Sospendere le microsfere in tampone C e separarle nuovamente utilizzando il supporto magnetico. Dopo aver ripetuto questa procedura di lavaggio due volte, risospendere le microsfere in 500 microlitri di tampone C. Conservare la sospensione sul ghiaccio ed eseguire immediatamente la procedura successiva. Per visualizzare il peptidotRNA, mescolare 10 microlitri delle microsfere sospese in tampone C con 10 microlitri di tampone di carico e separare i componenti legati alle microsfere eseguendo i campioni su gel di poliacrilamide al 10% in Tris-tric.

Asciugare i gel utilizzando un essiccatore per gel a vuoto. Successivamente, verificare l'integrità e la purificazione dell'RNA peptidico esponendo il gel essiccato a una pellicola a raggi X. Per analizzare l'RNA ribosomiale, mescolare 190 microlitri di una soluzione di EDTA due millimolare preparata con acqua trattata al DPC, 200 microlitri di fenolo equilibrato con acqua e 10 microlitri di una sospensione di perline.

Mescolare la sospensione risultante mediante vortexaggio vigoroso. Separare la fase inorganica dalla fase organica mediante centrifugazione a 10.000 G per tre minuti. A temperatura ambiente, raccogliere il livello acquoso superiore in un nuovo microtubo, precipitare l'RNA dallo strato acquoso aggiungendo un decimo di volume di acetato di sodio tre molare a pH 5,21, un microlitro di soluzione di glicogeno da 20 milligrammi per millilitro e due volumi di etanolo ghiacciato. Risospendere l'RNA precipitato in 10 microlitri di acqua trattata con dpcr.

Verificare l'integrità degli RNA ribosomiali mediante elettroforesi su gel di nitrocellulosa. Solitamente, 50 microlitri di sospensione di batteri producono un microgrammo di RNA ribosomiale. Di seguito vengono presentati i risultati di una serie di analisi volte a valutare la qualità e la funzionalità dei ribosomi traduttivi isolati.

L'osservazione di una banda unica risolta in gel di poliacrilamide indica la presenza di polipeptidi legati agli mRNA marcati con biotina, associati al SMB. La purificazione degli RNA ribosomiali. L'uso di questa procedura conferma anche la presenza di ribosomi legati a questi mRNA marcati con biotina.

L'aggiunta di puromicina, un antibiotico che induce l'attività peptidil transferasica del ribosoma, provoca il distacco dei peptidil-tRNA nascenti. Questo fenomeno si osserva come uno spostamento nel profilo di migrazione del polipeptide isolato su gel di poliacrilamide. Nel complesso, questi dati indicano che gli mRNA marcati con biotina associati al SMB contengono ribosomi funzionali dotati di peptidil-tRNA.

L'isolamento di ribosomi in traduzione contenenti specifiche tRNA peptidiliche permette lo studio degli effetti degli antibiotici e di altre molecole sulle tRNA peptidiliche, sulla funzione ribosomiale e sulla struttura del ribosoma. Negli esempi presentati qui, l'antibiotico sparassamina e l'amminoacido triptofano inibiscono il taglio idrolitico della tRNA peptidilica nascente TNAC da parte del fattore di rilascio due nei ribosomi isolati.

L'interazione del triptofano o della sparsomicina con il ribosoma induce anche cambiamenti strutturali in alcuni nucleotidi che costituiscono il 23 S-R-R-N-A del ribosoma in traduzione. Una volta acquisita padronanza, la parte principale di questa tecnica può essere completata in cinque ore se eseguita correttamente seguendo queste procedure. Altri metodi, come la criomicroscopia elettronica, possono essere effettuati per analisi strutturali aggiuntive al fine di rispondere ad ulteriori domande sulla struttura del ribosoma contenente un particolare Pepin, RNA.