Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo
22 aprile 2011
In questo rapporto si descrive un metodo per l'isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione efficiente di percorsi candidato.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare una coltura primaria di cellule della zona nefrogenica dal rene in via di sviluppo. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando i reni da embrioni del giorno 17,5. Il passaggio successivo della procedura consiste nell'asportare le capsule renali.
Viene quindi eseguita una digestione enzimatica limitata degli organi per staccare le cellule del mesenchima della calotta e dello stroma corticale dalla zona nefrogenica. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'allestire le cellule su fibronectina e coltivarle in un mezzo privo di siero. Alla fine, è possibile ottenere risultati che dimostrano una popolazione cellulare purificata della zona nefrogenica mediante immunomarcatura di marcatori specifici.
Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per studiare la trasduzione del segnale cellulare, può anche essere applicato per comprendere i requisiti del substrato necessari all'espansione cellulare. Ad esempio, per le tecniche di innesto, la procedura sarà dimostrata da Derek Adams, tecnico del mio laboratorio, e da Aaron Brown, ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Dopo aver preparato le soluzioni necessarie e aver trattato le piastre per colture cellulari secondo il protocollo scritto, iniziare la dissezione del rene embrionale di topo sacrificando la madre al giorno E 17,5.
In base alle linee guida della vostra istituzione, rimuovere l'utero e collocarlo in una piastra di Petri contenente alcuni millilitri di docos sate, soluzione salina tamponata o DPVS con calcio e magnesio. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette da orologiaio per rimuovere ciascun embrione e un'altra coppia di pinzette per decapitarlo. Una volta che tutta la nidiata è stata rimossa dall'utero e decapitata, trasferire gli embrioni in una piastra di Petri pulita contenente una quantità sufficiente di DPBS con calcio e magnesio per coprire gli embrioni.
Lasciare il maggior quantitativo possibile di sangue e detriti tissutali per ogni embrione; praticare un'incisione circonferenziale nella parete addominale al livello degli ombelicali utilizzando pinzette. Successivamente, posizionare l'embrione in posizione supina e fissare le spalle con un paio di pinzette. Con un secondo paio di pinzette, rimuovere gli organi interni dai polmoni fino alla vescica.
I reni saranno attaccati alla parte posteriore del gruppo di organi interni. Successivamente, staccare delicatamente i reni dal resto degli organi. Prestare attenzione a mantenere i reni collegati tra loro.
Quindi tenere il tessuto tra i reni con un paio di pinzette e afferrare la ghiandola surrenale attaccata alla capsula su uno dei reni con l'altro paio di pinzette. Rimuovere delicatamente la capsula dal rene. Prestare attenzione a non danneggiare il rene.
Assicurarsi di rimuovere qualsiasi capsula residua dal rene, nonché l'utero se ancora attaccato. Ripetere l'operazione con il rene rimanente. Infine, tagliare una pipetta di trasferimento a un diametro appropriato e trasferire delicatamente i reni in un tubo di polistirene da cinque millilitri contenente HBSS.
Ripetere l'isolamento renale per ogni embrione e raccogliere i reni nel tubo, fino a otto reni per tubo, in un ambiente sterile. Iniziare il processo di digestione enzimatica rimuovendo prima la soluzione HBSS dal tubo da cinque millilitri contenente i reni mediante pipetta. Prestare attenzione a evitare il contatto con i reni e aggiungere immediatamente 1,5 millilitri di collaghenasi, una soluzione digestiva a base di pancreatina.
Ripetere per ogni provetta dei reni e chiudere le provette. Successivamente, posizionarle su un agitatore in un incubatore a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Poco prima del termine dell'incubazione, aggiungere tre microlitri di DNA ad una concentrazione di una unità per microlitro in una provetta di polistirene fresca da cinque millilitri per ogni digestione in corso.
Dopo l'incubazione, rimuovere rapidamente il digest dal termostato e aggiungere 75 microlitri di FBS, invertendo il contenitore tre volte per miscelare. Lasciare in piedi a temperatura ambiente per due minuti. Quindi trasferire 1,4 millilitri della sospensione cellulare in un tubo di polistirene da 5 millilitri contenente il Mix di DNA e posizionare su un agitatore in un termostato a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, trasferire ogni sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 325 ×g per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il soprannatante, centrifugare nuovamente le provette a 325 ×g per cinque minuti. Sospendere quindi il pellet in un millilitro di 5% FBS HBSS, aspirando e dispensando su e giù da cinque a sei volte.
Chiudere ogni provetta prima di passare al campione successivo. Dopo la centrifugazione, rimuovere il SNAT e aggiungere 500 microlitri di KSFM con additivi a ciascuna provetta dopo che il mezzo è stato aggiunto a tutte le provette. Ri-sospendere delicatamente ogni pellet cellulare pipettando su e giù da cinque a sei volte con una micropipetta da un millilitro. Combinare tutte le sospensioni cellulari in una nuova provetta in polistirene da cinque millilitri.
Ora filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron preventivamente inumidito e raccogliere il flusso in un nuovo tubo in polistirene. Evitare di toccare il filtro con la punta della pipetta una volta raccolto tutto il flusso. Filtrare nuovamente il flusso attraverso un secondo filtro cellulare nuovo e preventivamente inumidito.
Rimuovere il filtro e chiudere il tubo con un tappo sterile prelevato da un tubo nuovo. Contare le cellule e seminare a una densità di 100.000-200.000 cellule per centimetro quadrato in KSM con additivi, in una piastra per colture con codifica in fibra. Lasciare riposare le cellule della zona nefrogenica in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due-quattro ore prima di qualsiasi stimolazione sperimentale.
Qui è mostrato un contrasto di fase. Immagine a 20x di cellule della zona nefrogenica seminate a 200.000 cellule per centimetro quadrato e coltivate per 24 ore. In questa immagine, le cellule della zona nefrogenica sono state marcate con l'anticorpo anti-PAX2, specifico per le cellule progenitrici del nefrone, mostrato in rosso, mentre i nuclei in blu sono stati contrastati con DAPI.
Viene mostrata un'immagine in contrasto di fase di un gruppo di progenitori del nefrone a un ingrandimento di 40x. Per dimostrare ulteriormente la specificità, le cellule della zona nefrogenica sono state isolate da embrioni che esprimono lacy sotto il controllo del promotore di Fox D1, che è espresso nella popolazione di cellule stromali. All'interno della zona nefrogenica del rene in sviluppo, le cellule sono state quindi colorate con DAPI Titan fi per i nuclei in blu, foin per l'actina F in verde e anti beta galattosidasi in rosso.
Una volta acquisita padronanza, una coltura primaria in monoclo strato di cellule della zona nefrogenica può essere ottenuta in circa due ore. Queste colture permettono studi rapidi ad alto rendimento sui percorsi di segnalazione cellulare nello sviluppo dei progenitori del nefrone, risultando altamente adatte a trattamenti con trasduzione virale, proteine ricombinanti e molecole di piccole dimensioni. Inoltre, possono essere impiegate ulteriori procedure di sorting cellulare per isolare tipi cellulari specifici da queste colture.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo rapporto descrive un metodo per isolare e coltivare cellule progenitrici dal rene di topo embrionale. Le cellule coltivate sono adatte allo studio delle vie di segnalazione che regolano le cellule staminali/progenitrici nello sviluppo renale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nefrologia
- Biologia cellulare
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- La zona nefrogena è fondamentale per lo sviluppo del rene.
- La comprensione della segnalazione delle cellule progenitrici può fornire indicazioni per la medicina rigenerativa.
- Le colture primarie permettono una manipolazione dettagliata dei percorsi cellulari.
- La trasduzione virale migliora l'analisi dei percorsi.
Scopo dello studio
- Generare una coltura primaria di cellule della zona nefrogenica.
- Studiare le vie di segnalazione che regolano lo sviluppo renale.
- Facilitare trattamenti con molecole di piccole dimensioni e proteine.
Metodi Utilizzati
- Dissezione dei reni da embrioni al giorno 17,5.
- Rimozione delle capsule renali.
- Digestione enzimatica per isolare tipi cellulari specifici.
- Piastramento delle cellule su fibronectina e coltura in mezzo privo di siero.
Risultati principali
- Isolamento con successo di una popolazione purificata di cellule della zona nefrogenica.
- L'immunomarcatura ha confermato l'identità delle cellule in coltura.
- Le cellule sono suscettibili alla trasduzione virale per la manipolazione delle vie di segnalazione.
- I risultati supportano ulteriori studi sui segnali coinvolti nello sviluppo renale.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio affidabile per lo studio delle cellule progenitrici renali.
- Apre nuove prospettive per l'indagine di bersagli terapeutici nelle malattie renali.
- Studi futuri potranno sfruttare questo modello per applicazioni rigenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento e la coltura di cellule dalla zona nefrogenica del rene di topo embrionale permettono un'analisi diretta dei segnali nelle cellule staminali/progenitrici all'interno di un sistema controllato e accessibile. Questo approccio risolve la difficoltà di studiare i meccanismi di rinnovamento rispetto a quelli di differenziazione al di fuori dei vincoli della coltura di organi integri, offrendo un'elevata affidabilità predittiva nella validazione precoce dei bersagli e nella riduzione dei rischi associati ai percorsi molecolari. Il metodo si inserisce strategicamente a sostegno di team impegnati nello sviluppo di programmi di rigenerazione e modellizzazione delle malattie, fornendo letture cellulari quantitative e robuste.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la disamina meccanicistica delle vie di segnalazione che regolano l'auto-rinnovamento e la differenziazione dei progenitori del nefrone.
- Consente la validazione funzionale di regolatori candidati identificati mediante analisi genetiche o trascrittomiche.
- Facilita la riduzione del rischio biologico isolando gli effetti di proteine specifiche, molecole di piccole dimensioni o silenziamento genico.
- Fornisce una piattaforma per una selezione predittiva affidabile dei bersagli nelle pipeline per malattie renali e medicina rigenerativa.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un sistema riproducibile di cellule primarie validato mediante marcatori per lo sviluppo di saggi quantitativi.
- Consente una valutazione standardizzata degli effetti dei composti sulla proliferazione, sulla morte cellulare e sull'espressione dei marcatori.
- Permette la predisposizione a schermate ad alto rendimento grazie alla possibilità di trasduzione virale e trattamento con proteine ricombinanti.
- Consente la preparazione scalabile di popolazioni cellulari rilevanti per la patologia per applicazioni successive.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro alla biologia della zona nefrogenica in vivo per lo sviluppo traslazionale di biomarcatori.
- Garantisce continuità dalle indagini meccanicistiche nella fase di scoperta alla validazione in modelli preclinici.
- Permette l'avanzamento calibrato sul rischio di ipotesi terapeutiche rigenerative e modificanti la malattia.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica nei portafogli di ricerca su terapie cellulari e malattie renali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di coltura cellulare primaria collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, consentendo la manipolazione diretta e l'analisi quantitativa delle decisioni riguardanti il destino delle cellule progenitrici del nefrone.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla regolazione delle cellule staminali/progenitrici e il mappaggio dei percorsi metabolici.
- Screening: Fornisce un sistema validato e riproducibile per saggi di composti e perturbazioni genetiche.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi sulla proliferazione, sulla morte cellulare e sull'espressione dei marcatori per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei risultati ottenuti in vitro con i processi di sviluppo in vivo e con le strategie di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e adattabile per diversi programmi di ricerca renale e di sviluppo terapeutico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sullo sviluppo renale.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento e la coltura di cellule primarie per garantire riproducibilità e scalabilità tra diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di avanzamento o interruzione e un progresso efficiente nell'uso del capitale per progetti renali e rigenerativi.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione adeguata al rischio e il trasferimento di conoscenze tra programmi nei percorsi di malattie renali e medicina rigenerativa.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di dissezione embrionale, digestione enzimatica e coltura cellulare primaria.
- Necessita di accesso a infrastrutture per la coltura cellulare, strumenti per l'analisi dei marcatori e capacità di trasduzione virale.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di isolamento cellulare, densità di semina e validazione dei marcatori.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere un'ottimizzazione delle condizioni di digestione e di coltura.
- Le limitazioni includono la necessità di un tempismo e di una manipolazione precisi per preservare la vitalità e il fenotipo delle cellule progenitrici.
