Name: Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Impara a isolare e coltivare cellule progenitrici dalla zona nefrogena del rene embrionale di topo. Questo metodo consente di studiare le vie di segnalazione che regolano lo sviluppo renale e le applicazioni rigenerative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto da R01 DK078161 da NIDDK (LO), borse di studio post-dottorato da American Heart Association (AB), il Wenner-Gren Fondazioni di Svezia e Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Svezia (UB). Ulteriore supporto è stato fornito dal Maine Medical Center Research Institute strutture di base per Istopatologia, Bioinformatica e FACS (supportato da 2P20RR18789-06) e il Fondo per animali MMCRI.

1. Reagenti per la preparazione digestione del rene <ol><li> 1,5 ml di 0,25% Collagenasi A (w / v) e soluzione 1% Pancreatina digerire (w / v) saranno necessari per l'estrazione di cellule zona nefrogenica (NZCs) da 8 E17.5 reni. Perché Pancreatina dura circa 2 ore per sciogliere a temperatura ambiente, basta digerire soluzione per il maggior numero di rene embrionale attesi dovrebbero essere fatte prima dell'esperimento. Preparare digerire soluzione in primo luogo l'aggiunta di 25 mg di Collagenasi A fosfato 10 ml Soluzione salina tamponata Dulbecco (DPBS) in modo chiaro da 15 ml, provetta sterile. E 'fondamentale che il DPBS non contiene calcio e magnesio in quanto interferiscono con la digestione enzimatica. Mescolare soluzione su un nutator per 10 minuti per sciogliere Collagenasi A. Aggiungere 100 mg di pancreatina a Collagenasi sciolto Una soluzione e mescolare su un nutator per almeno 2 ore. In alternativa, Collagenasi A / Pancreatina soluzione di analisi possono essere mescolati in un nutator notte a 4 ° C. Si consiglia di indossare una maschera, come Collagenasi A e Pancreatina disperdono facilmente in atmosfera durante la pesatura e può causare irritazione delle vie nasali. </li><li> Preparare un 5% di siero fetale bovino (FBS) (v / v) in soluzione salina tamponata di Hank (HBSS). Miscelare. 1 ml per ogni tubo di 8 reni sarà necessario. </li><li> Preparare un terreno di coltura, completandola cheratinociti medio siero libero con 1% glutamina (v / v) e 1% penicillina-streptomicina (PenStrep) (v / v). </li><li> Cappotto sterile fondo piatto in polistirolo tessuto piastre di coltura (96, 48, 24 o 6 così) con la soluzione fibronectina umana ad una concentrazione di 5 mg per cm 2 di superficie di crescita. 5 mg di polvere di fibronectina è risospeso in 5 ml di soluzione sterile H 2 O. Questo è diluito 1:25 in DPBS sterile senza calcio o di magnesio e 250 ml sono aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra ben 24. Le piastre sono poi incubate con una soluzione fibronectina a temperatura ambiente per 1 ora seguita da 1 ora a 4 ° C. In alternativa, le piastre possono essere incubate overnight a 4 ° C. La soluzione viene poi aspirato in una cappa a flusso laminare prima dell'aggiunta di medio / cellule. </li></ol> 2. Reni dissezione e rimozione di capsule (Fatto a temperatura ambiente) <ol><li> A E17.5, il sacrificio della madre con una procedura approvata dal vostro Cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, rimuovere l'utero, e metterlo in una capsula di Petri contenente DPBS con calcio e magnesio. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare orologiai 'forcipe per rimuovere ogni embrione dall'utero e decapitare ogni embrione. Una volta che l'intera cucciolata è fuori dell'utero, trasferire gli embrioni per un piatto pulito Petri contenenti DPBS basta con il calcio e magnesio per coprire interamente gli embrioni lasciando dietro di sé come molto sangue e frammenti di tessuto possibile. </li><li> Utilizzando pinze, fare una incisione circonferenziale della parete addominale dell'embrione a livello dell'ombelico. Poi posto l'embrione sul dorso, perno verso il basso alle spalle con un set di pinze, e rimuovere gli organi interni dai polmoni fino alla vescica con l'altro set di pinze. Con la pratica questo può essere fatto in un unico movimento. I reni devono essere allegati alla parte posteriore della massa di organi. Se i reni non rimangono attaccati agli organi eviscerati, possono essere accuratamente rimosso dalla parete dorsale del corpo. Reni che sono stati danneggiati nel corso di questo processo di dissezione deve essere eliminata in quanto saranno contaminare la cultura finale con tipi di cellule inappropriate. </li><li> Delicatamente stuzzicare via i reni dal resto degli organi, avendo cura di mantenere i reni collegati tra loro. Tenere il tessuto tra i reni con un set di pinze e prendete la ghiandola surrenale collegato a uno dei reni con le pinze altri. La ghiandola surrenale deve essere collegato alla capsula renale. Buccia delicatamente la ghiandola surrenale e dalla capsula intorno alla parte esterna del rene, simile a sbucciare una banana. Fare attenzione a non dividere il rene a metà mentre peeling, ed essere sicuri di non danneggiare il tessuto renale al di sotto della capsula. Rimuovere con cura ogni capsula rimanente, come pure l'uretere se è ancora attaccato. Ripetere con il rene residuo. </li><li> Utilizzare una pipetta trasferire taglio di inserire i reni in una provetta di polistirolo 5 ml di HBSS. Ripetere i passaggi 2,2-2,4 per ogni embrione. Reni possono essere raggruppati 8 per tubo. Con rimozione pratica, la dissezione e la capsula si terrà 2-3 minuti per ogni embrione. </li></ol> 3. La digestione enzimatica di Reni (tutti i passaggi a temperatura ambiente salvo diversa indicazione) <ol><li> Rimuovere la soluzione HBSS da provette da 5 ml contenente reni con una pipetta, mentre con cura evitando il contatto con i reni. Immediatamente aggiungere 1,5 ml di Collagenasi A Pancreatina / soluzione di analisi per il tubo 5 ml contenente reni prima di passare al campione successivo. Ripetere per ogni tubo di reni. </li><li> Tubi posto con l'enzima / reni digerisce su un nutator in un pre-riscaldato a 37 ° C incubatore per 15 minuti. 2 minuti primacompletamento del digest, aggiungere 3 ml di DNasi (1 U / ml) a un dolce in polistirene 5 ml per ogni digerire in corso. </li><li> Rimuovere rapidamente digerisce da incubatore, aggiungere 75 ml di FBS e capovolgere 3 volte per mescolare. Lasciate riposare in panchina per 2 minuti. </li><li> Trasferire 1,4 ml di sospensione cellulare al tubo di polistirene da 5 ml contenente DNasi (1 U / ml), lasciando il restante 0,2 ml di sospensione cellulare e reni dietro. L'extra 0,2 mL di soluzione lasciato conterrà impurità come matrice extracellulare. </li><li> Mix sospensione cellulare / DNase su un nutator in un pre-riscaldato a 37 ° C incubatore per 10 minuti. </li><li> Rimuovere rapidamente sospensioni cellulari da incubatore e trasferire ciascuna in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. Spin sospensioni cellulari in microcentrifuga a 325 g per 5 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante dal pellet e risospendere pellet in 1 ml di 5% di FBS / HBSS, pipettando su e giù 5 o 6 volte. Cap ciascun tubo prima di passare al campione successivo. </li><li> Spin sospensioni cellulari in una microcentrifuga a 325 g per 5 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,5 ml di cheratinociti media i livelli di free (KSFM) con additivi per ogni tubo e tubo tappo prima di passare al campione successivo. Dopo medio è stato aggiunto a tutti i tubi, risospendere delicatamente ogni cella pellet pipettando su e giù 5 o 6 volte con una micropipetta 1ml. Combina tutte le sospensioni di cella in una fresca 5 ml di tubo in polistirolo. </li><li> Pre-umido due da 40 micron cellule tappi filtro collocato su una provetta da 5 ml in polistirolo fondo rotondo con KSFM per campione. Passano sospensioni cellulari attraverso un tappo cellula filtro trasferendo con una micropipetta 1 ml. Evitare di toccare il filtro con la punta della pipetta. Raccogliere flow-through e ripetere filtrazione attraverso il tappo filtro secondo. Togliere il tappo filtro cellulare e sostituirlo con un nuovo tappo di un tubo normale 5 ml in polistirolo. </li><li> Contare le celle con un emocitometro o il conteggio delle cellule di altri dispositivi e le cellule trasferimento in pozzetti di una piastra fibronectina cultura patinata ad una densità di 100.000-200.000 cellule per cm 2, diluendo se necessario con KSFM con additivi. In generale, si recupera circa 4.5x10 6 celle per 10 cucciolata embrione. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2. </li><li> Consentono alle cellule di recuperare e fissare per 2-4 ore in media prima della stimolazione con reagenti aggiuntivi. Stimolano le cellule con il composto di interesse da 1 a 48 ore. Purificare l'RNA per analisi PCR utilizzando il Qiagen RNeasy Micro Kit seguendo le istruzioni del produttore o seguire le istruzioni qui sotto per immunostain fluorescenti le cellule. </li></ol> 4. Reagenti per la preparazione di fissazione delle cellule e immunocolorazione <ol><li> Preparare 4% PFA: sciogliere 4% paraformaldeide in PBS (v / v) a 55 ° C con agitazione regolari. Raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso. Questa soluzione è tossico e deve essere eliminata in contenitori per residui designato. </li><li> Preparare la soluzione di permeabilizzazione con l'aggiunta di Triton X-100 di PBS per ottenere una soluzione allo 0,3% (v / v). </li><li> Preparare una soluzione al 5% di blocco in PBS con siero della stessa specie, come è stato utilizzato per sollevare l'anticorpo secondario da utilizzare. Per esempio, se si rileverà un anticorpo di coniglio contro il vostro antigene bersaglio con un asino anti-coniglio Alexa Fluor 568, preparare una soluzione bloccante contenente siero asino 5%. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione primaria di anticorpi aggiungendo la giusta concentrazione di anticorpi al 5% di soluzione di blocco. </li><li> Preparare la soluzione secondaria di anticorpi immediatamente prima dell'uso. Aggiungi fluoroforo anticorpo coniugato a una concentrazione consigliata dal costruttore, insieme con il nucleare di contrasto DAPI e altri marcatori di organelli come falloidina di soluzione al 5% di blocco. Se lo stoccaggio è necessario, conservare la soluzione al buio a 4 ° C fino all'utilizzo. </li><li> Preparare il 50% glicerolo / PBS soluzione (v / v) per la conservazione di cellule immunostained. In alternativa, Vectashield può essere utilizzato. </li></ol> 5. Fissazione delle cellule e immunocolorazione <ol><li> Il protocollo seguito è progettato per la fissazione e la colorazione di NZCs in un piatto ben 24. I volumi indicati sono per un singolo pozzo. Reagenti devono essere delicatamente pipettati durante tutte le fasi per evitare il distacco delle cellule, e piastra di agitazione non è raccomandato nelle fasi di incubazione. </li><li> Rimuovere delicatamente con una media da 1 ml micropipetta e aggiungere 0,5 ml di PFA 4% per attaccati cellule in coltura. Incubare per 15 minuti indisturbati a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il 4% PFA e aggiungere 0,5 ml per pozzetto di soluzione permeabilizzazione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e risciacquare delicatamente due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione di blocco e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti. </li><li> Rimuovere soluzione di saturazione e aggiungere 0,225 ml di soluzione di anticorpo primario. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 2 ore o una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e delicatamente riNSE due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare. </li><li> Aggiungere 0,225 ml di soluzione di anticorpo secondario. Incubare piastra al buio a temperatura ambiente per 60 minuti. </li><li> Rimuovere la soluzione secondaria di anticorpi e delicatamente lavare due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare. </li><li> Aggiungere 0,3 ml di 50% glicerolo / PBS soluzione (v / v) o Vectashield sufficiente per coprire parte inferiore della superficie bene. </li><li> Celle di immagine con microscopio a epifluorescenza o conservare avvolto in un foglio a 4 ° C. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. NZCs sono stati purificati da E17.5 embrioni, placcato a 200.000 cellule per cm 2 e incubate a 37 ° C per un totale di 24 ore. Le cellule sono state ripreso dal contrasto di fase con un microscopio Leica DM IRB invertita prima della colorazione immunofluorescenza. (A) 20X contrasto vista fase di NZCs dopo 24 ore di cultura. (B) Le cellule sono state fissate e colorate con un anticorpo anti-PAX2 coniglio specifici per le cellule progenitrici nefrone (rosso) e uno secondario Alexa Fluor 568 coniugato asino anti-coniglio. Nota nuclei blu di contrasto con DAPI. (C) 40X contrasto fase di vista di un gruppo di progenitori nefrone (centrato) dopo 24 ore di cultura. (D) l'immagine di 40X NZCs LacZ + isolate da embrioni del ceppo Foxd1 LacZ, che esprime la β-galattosidasi sotto il controllo del promotore Foxd1. Foxd1 si esprime nella popolazione di cellule stromali all'interno della zona nefrogenico del rene di sviluppo. Le cellule sono state colorate con la F-actina marcatore falloidina (Oregon verde primario coniugato), il nucleare macchia DAPI (blu) e di coniglio anti-β-galattosidasi (secondaria - Alexa Fluor asino anti-coniglio 568) per il rilevamento di Foxd1 + cellule stromali ( rosso).

<ol><li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li>
<li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li>
<li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li>
<li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li>
<li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li>
<li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo si descrive un metodo per isolare le cellule e la cultura dalla zona nefrogenico del rene embrionale. E &#39;lo sviluppo di un metodo inizialmente pubblicato come parte di uno studio degli effetti del trattamento BMP7 sulle cellule della zona nefrogenica (Blank et al., 2009). Nello studio iniziale, una serie di esperimenti per caratterizzare i tipi di cellule rappresentate all&#39;interno della popolazione NZC sono stati condotti. In breve, la purificazione della NZCs dei giornalisti geneti...

<table><tbody><tr><td>Orafo&amp;rsquo;pinze chirurgiche n. 5</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4905</td><td>2 coppie richieste</td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td>Gruppo Roche</td><td>10 103 578 001</td><td>Indossare la maschera</td></tr><tr><td>Pancreatina suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8096</td><td>Indossare la maschera</td></tr><tr><td>DPBS con Ca, Mg</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-513F</td><td>Con Mg &amp;e Ca</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>14-901E</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>KSFM</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>10724-011</td><td>senza fattori di crescita aggiunti</td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Usare al 1% v/v</td></tr><tr><td>PenStrep 10.000 U di penicillina/ml, 10 mg di streptomicina/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Usare al 1% v/v</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td>Fornito in polvere</td></tr><tr><td>Piastra per colture a 24 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>142485</td><td>Nunclon</td></tr><tr><td>DPBS senza Mg &amp;& Ca</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>tubi in polistirene da 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DNasi (1 U/&amp;mu;l)</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td>4 &amp;#x03BC;l per 1,5 ml</td></tr><tr><td>filtro per cellule da 40 micron </td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>con tappo e tubo</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Usare al 4 % p/v</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>VWR international</td><td>VW3929-2</td><td>Usare al 0,3 % v/v</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>Fornito in polvere</td></tr><tr><td>Siero di asino</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td> Usare al 5 % v/v</td></tr><tr><td>Rabbit anti-PAX2 </td><td>Invitrogen</td><td>71-6000</td><td>Diluire 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coniglio&amp;#946;-gal</td><td>MP Biomedicals</td><td>559762</td><td>Diluire 1:200</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>O7466</td><td>Diluire 1:200</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Diluire 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Diluire 1:5000</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td>Mescolare il 50 % con H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Utilizzare &quot;DNasi in colonna&quot; protocollo</td></tr><tr><td>Pipette trasferibili, 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357575</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di cellule dalla zona nefrogenica del rene embrionali di topo

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Sviluppo embrionale del rene è stato ampiamente studiato sia come modello per l&#39;interazione epitelio-mesenchimale in organogenesi e per guadagnare la comprensione delle origini della malattia renale congenita. Più recentemente, la possibilità di sterzo ingenuo cellule staminali embrionali verso destini nefrogenico è stato esplorato nel campo emergente della medicina rigenerativa. Studi genetici nel topo hanno identificato diversi percorsi necessari per lo sviluppo del rene, e un catalogo globale di trascrizione del gene nell&#39;organo è stata recentemente generato <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> , fornendo regolatori candidato numerose funzioni essenziali dello sviluppo. Organogenesi del rene roditori possono essere studiati in coltura d&#39;organo, e le relazioni molti hanno utilizzato questo metodo per analizzare i risultati delle due proteine ​​applicare candidato o abbattere l&#39;espressione di geni candidati utilizzando siRNA o Morpholinos. Tuttavia, l&#39;applicabilità della cultura d&#39;organo allo studio di segnalazione che regola staminali / differenziazione delle cellule progenitrici verso il rinnovo nel rene di sviluppo è limitato come organi colto contenere una diffusione compatto matrice extracellulare limitazione delle macromolecole e particelle virali. Per studiare la cellula di segnalazione eventi che influenzano le staminali / progenitrici di cellule di nicchia nel rene abbiamo sviluppato un sistema primario cella che stabilisce la zona nefrogenico o cellule progenitrici di nicchia del rene sviluppo ex vivo in isolamento dal induttore di differenziazione epiteliale. Utilizzando limitato digestione enzimatica, le cellule della zona nefrogenica può essere selettivamente liberato dallo sviluppo di reni a E17.5. A seguito di filtrazione, queste cellule possono essere coltivate come un monostrato irregolari con condizioni ottimizzate. Gene marcatore analisi dimostra che queste culture contengono una distribuzione dei tipi di cellule caratteristico della zona nefrogenico in vivo, e che dispongono di idonee espressione del gene marcatore durante il periodo di coltura. Queste cellule sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che facilita enormemente lo studio degli effetti delle cellule staminali candidato / progenitrici regolatore. Parametri cellula base biologici quali proliferazione e morte cellulare così come i cambiamenti nell&#39;espressione di marcatori molecolari caratteristici della nefrone cellule staminali / progenitrici in vivo può essere usato con successo come risultati sperimentali. I lavori in corso nel nostro laboratorio utilizzando questa nuova tecnica cellula primaria mira a scoprire i meccanismi di base che regolano la regolamentazione di auto-rinnovamento contro nefrone differenziazione in cellule staminali / progenitrici.

In questo rapporto si descrive un metodo per l&#39;isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione efficiente di percorsi candidato.

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Lo sviluppo embrionale del rene è stato ampiamente studiato sia come modello di interazione epitelio-mesenchimale nell'organogenesi, sia per acquisire...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una coltura primaria di cellule della zona nefrogenica dal rene in via di sviluppo. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando i reni da embrioni del giorno 17,5. Il passaggio successivo della procedura consiste nell'asportare le capsule renali.Viene quindi eseguita una digestione enzimatica limitata degli organi per staccare le cellule del mesenchima della calotta e dello stroma corticale dalla zona nefrogenica. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'allestire le cellule su fibronectina e coltivarle in un mezzo privo di siero. Alla fine, è possibile ottenere risultati che dimostrano una popolazione cellulare purificata della zona nefrogenica mediante immunomarcatura di marcatori specifici.Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per studiare la trasduzione del segnale cellulare, può anche essere applicato per comprendere i requisiti del substrato necessari all'espansione cellulare. Ad esempio, per le tecniche di innesto, la procedura sarà dimostrata da Derek Adams, tecnico del mio laboratorio, e da Aaron Brown, ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Dopo aver preparato le soluzioni necessarie e aver

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video descrive il metodo per isolare i glomeruli intatti dai reni di topo. I glomeruli incapsulati e decapsulati così ottenuti possono essere ulteriormente utilizzati per la coltura di escrescenze di cellule epiteliali parietali dal rene murino.

Isolamento dei glomeruli: una tecnica per ottenere glomeruli intatti dal rene murino

In questo video, dimostriamo i passaggi per isolare e purificare le cellule epiteliali tubulari renali per un'ampia gamma di studi di biologia molecolare e colture cellulari.

Isolamento di cellule renali mure: una tecnica per isolare e generare colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali

Questo protocollo descrive un metodo per isolare e coltivare rudimenti metanufricani da embrioni di topo.

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

Qui presentiamo un metodo di isolamento e coltura di romanzo grado clinico per rene perivascolare di cellule stromali (kPSCs) basato sulla perfusione d'organo intero con gli enzimi digestivi e arricchimento NG2-cella. Con questo metodo, è possibile acquisire il numero di celle sufficiente per una terapia cellulare.

Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali

Questo protocollo fornisce un approccio conveniente per isolare e caratterizzare del mouse primario cellule tubolari renali che possono successivamente essere sub-coltivate per valutare funzioni biologiche renale ex vivo, tra cui bioenergetiche mitocondriali.

Isolamento, caratterizzazione e Throughput elevato flusso extracellulare analisi di cellule epiteliali tubolari renali primari del Mouse

L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di isolare in modo efficiente culture vitale primaria glomeruli con contaminanti minimale per l'uso in una varietà di applicazioni a valle. Glomeruli isolati mantengono relazioni strutturali tra tipi di componenti delle cellule e possono essere coltivate ex vivo per un breve periodo.

Un metodo efficiente di setacciatura per isolare i Glomeruli intatti dal rene di ratto adulto.

Questo articolo descrive un metodo per coltivare e analizzare le escrescenze glomeriane delle cellule epiteliali glomeriali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i percorsi coinvolti nella proliferazione e migrazione delle cellule epiteliali parietali.

Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali

Qui, presentiamo un protocollo per isolare nuclei di alta qualità da reni di topo congelati che migliorano la rappresentazione dei tipi di cellule renali midollari ed evitano gli artefatti di espressione genica dalla dissociazione enzimatica del tessuto.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

Questo studio ha sviluppato un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule mesangiali murine (MC) e la loro coltura cellulare ex vivo . Queste cellule possono essere fatte passare più volte, congelate, rianimate e coltivate senza compromettere la crescita cellulare o l'espressione proteica.

Ottimizzazione dell'isolamento e della purificazione delle cellule mesangiali glomerulari murine

È stato sviluppato un approccio robusto e riproducibile per stabilire colture primarie 2D di cellule arricchite di zona glomerulosa e zona fascicolata, per la corteccia surrenale del muro. Questo sistema preserva le caratteristiche molecolari e funzionali chiave di ciascuna zona, consentendo un'indagine mirata delle vie di segnalazione, della produzione ormonale e del comportamento delle cellule corticali surrenali ex vivo.

Stabilimento di colture primarie arricchite in zona dalla corteccia surrenale del topo

Impara a isolare e coltivare cellule progenitrici dalla zona nefrogena del rene embrionale di topo. Questo metodo consente di studiare le vie di segnalazione che regolano lo sviluppo renale e le applicazioni rigenerative.

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Esplora altri video