Modificato ES / OP9 Co-Cultura Protocollo prevede Caratterizzazione avanzata di Progeny emopoietiche

L'obiettivo generale del seguente esperimento è differenziare cellule staminali embrionali murine in vari linfaggi ematopoietici primitivi e definitivi. E per caratterizzare tutti i discendenti delle cellule staminali, la differenziazione delle cellule ematopoietiche murine viene ottenuta posizionando le cellule staminali su uno strato confluito di cellule stromali OP9 M strawberry marcate con fluorescenza. Ogni giorno di differenziazione o di co-coltura rappresenta le diverse fasi dello sviluppo ematopoietico al momento appropriato del raccolto.

I progenitori di cellule ES differenziate possono essere separati dalla linea cellulare stromale M strawberry OP nine mediante sorting cellulare. Questo protocollo di differenziazione delle cellule ES riproduce l'emopoiesi primitiva e definitiva come osservata in vivo e può essere utilizzato per caratterizzare i difetti ematopoietici associati a linee cellulari ES knock-out senza l'uso di embrioni. Salve, benvenuti nel laboratorio della dottoressa Judith Gassen presso il Johnson Comprehensive Cancer Center dell'UCLA.

Il mio nome è Alicia Poz. Il vantaggio principale della tecnica che vi mostrerò oggi rispetto ai metodi di co-coltura ESO esistenti è che questa procedura consente il passaggio di tutte le cellule del giorno cinque e del giorno otto, nonché la completa separazione di tutta la progenie derivata dalle ES. Le cellule stromali OP9 M strawberry vengono coltivate in mezzo di coltura cellulare OP9, che deve essere sostituito ogni due giorni.

Le cellule OP nine devono essere sottocultivate tre giorni prima del momento in cui saranno necessarie per la cocoltura. È importante notare che durante la manutenzione, le cellule OP nine non devono mai essere mantenute a una densità superiore al 90% di confluenza. Lavare innanzitutto le cellule due volte con PBS, quindi aggiungere 0,1% di tripsina EDTA PRE-RISCALDATA per cinque minuti, quando le cellule si sono staccate. Aggiungere il mezzo di coltura per cellule OP nine e trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri.

Centrifugare le cellule in provetta a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente, scartare il soprannatante e risospendere le cellule in un mezzo fresco per colture cellulari M strawberry OP9. Piastrare le cellule a una densità minima di 10 alla quarta cellule per centimetro quadrato nel giorno in cui inizia l'esperimento di co-coltura. Le cellule OP9, passate in coltura tre giorni prima, devono essere confluenti. Le cellule ES devono essere coltivate seguendo il protocollo standard per la specifica linea cellulare utilizzata.

Lavare le cellule staminali embrionali due volte con PBS contenente tripsina al 0,25% ed EDTA e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere il mezzo di differenziamento in co-coltura alle cellule staminali embrionali e trasferirle in provette coniche da 15 millilitri. Centrifugare le cellule staminali embrionali a 400 ×g per cinque-sette minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso il soprannatante, risospendere le cellule ES nel mezzo di differenziamento per co-coltura. Utilizzare un ago da 21 gauge con estremità smussata per ottenere una sospensione di cellule singole. Contare le cellule utilizzando il blu di trian e un emocitometro.

Ora recuperare il matraccio di M fragola. OP nove cellule dall'incubatrice. Rimuovere il mezzo dalle cellule OP nove e aggiungere il mezzo di differenziazione in co-coltura al piatto del matraccio.

Un milione di cellule staminali embrionali per centimetro quadrato per ogni fiasca di cellule M strawberry OP nine; incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica con umidità. Questo è il giorno zero e la coltura co-coltivata deve apparire così. Tre giorni dopo l'inizio della co-coltura tra cellule staminali embrionali e M strawberry OP nine.

Si osservano principalmente grandi agglomerati piatti di progenie derivata da ES con bordi ben definiti, e alcune spirali di cellule avranno iniziato a formarsi. Rimuovere con attenzione il mezzo dalla co-coltura e sostituirlo con mezzo di differenziamento fresco cinque giorni dopo l'inizio della co-coltura. Un corretto differenziamento delle cellule ES su uno strato confluenziale di cellule M strawberry OP9 dovrebbe dare origine a emaoblasti, che appaiono come ammassi di cellule sovrapposte.

L'aspetto più critico di questa procedura consiste nell'assicurarsi un'adeguata differenziazione al quinto giorno di co-coltura. A questo punto, è possibile osservare le colonie di emablasti non solo al microscopio, ma anche macroscopicamente. Lavare attentamente la co-coltura due volte con PBS e trattare le cellule con tripsina ghiacciata al 0,25% EDTA, rimuovere le cellule dalla fiasca con il mezzo di differenziazione ES e trasferirle in un tubo; centrifugare le cellule a 400 ×g per sette minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e aggiungere un nuovo mezzo. Quindi utilizzare un ago da 21 gauge con estremità smussata per risospendere le cellule e garantire una sospensione monocellulare; contare le cellule usando un emocitometro. Si dovrebbe osservare un aumento da 100 a 150 volte del numero di cellule staminali embrionali rispetto al giorno zero. Riasseminare le cellule in co-coltura su un nuovo strato di cellule OP9 confluenti M strawberry al giorno otto o nove e al giorno 12 contare nuovamente le cellule. Rimuovere il mezzo contenente le cellule ematopoietiche e metterlo da parte.

Lavare il monostrato una volta con PBS per rimuovere le cellule ematopoietiche in sospensione e conservare. Aggiungere 0,25% tripsina-EDTA al flacone dopo l'adesione delle cellule alla tripsina, staccare le cellule dal flacone con il mezzo di differenziamento ES e aggiungerle alle cellule ematopoietiche presenti in sospensione. Centrifugare le cellule a 400 ×g per sette minuti a temperatura ambiente. Infine, risospendere le cellule utilizzando un ago da 21 gauge a estremità ottusa e contare le cellule. Le cellule sono ora pronte per essere ripiastrellate o utilizzate in saggi successivi.

Il sistema di co-coltura ES M fragola OP nove può essere utilizzato per modellare lo sviluppo ematopoietico descritto. Di seguito è riportata una panoramica dei giorni del corso temporale della co-coltura in cui i progenitori ES differenziati devono essere trasferiti a nuove cellule M fragola OP nove. Una corretta differenziazione delle cellule ES su uno strato confluenziale di cellule M fragola OP nove porterà alla produzione di flick uno positivo.

All'ottavo giorno di co-coltura, gli angioblasti ematici sono il precursore mesodermico comune per le linee endoteliale ed ematopoietica e dovrebbero apparire come ammassi compatti di cellule, come mostrato in questa immagine. Procedendo la co-coltura, a partire dal sesto o settimo giorno dovrebbero apparire aggregati di due o quattro cellule, che cresceranno formando ammassi cellulari più grandi. Entro l'ottavo o nono giorno sono presenti precursori ematopoietici, mentre le linee ematopoietiche completamente differenziate compaiono entro il giorno 14.

Al contrario, una coltura co-coltivata con una differenziazione ESL inadeguata produrrà progenie derivata da ES che non presenterà un modello a rosetta al quinto giorno. L'assenza di cellule disposte in un modello a rosetta indica una formazione inadeguata dei blasti GIO. Una coltura co-coltivata con una formazione inadeguata dei blasti eporterà infine a una differenziazione limitata della linea ematopoietica e dovrebbe essere scartata seguendo questo protocollo modificato di coltura co-coltivata ES OP9.

I derivati delle ES sono negativi per m strawberry e possono essere separati mediante citofluorimetria da M strawberry positivi. OP nove cellule in qualsiasi giorno di co-coltura per la valutazione. I risultati di un esperimento rappresentativo sono mostrati qui.

I protocolli di co-coltura ES OP nove pubblicati in precedenza si sono concentrati esclusivamente sul passaggio e sulla valutazione delle cellule non aderenti in sospensione. In questo protocollo modificato, tutte le cellule derivate da ES, sia quelle aderenti che non aderenti, vengono passate e possono essere valutate. Ciò porta a un aumento del rendimento di cellule ematopoietiche, consente l'identificazione di popolazioni cellulari rare e permette una caratterizzazione completa di tutti i discendenti delle cellule staminali embrionali, sia ematopoietici che non ematopoietici.