Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell'epitelio pigmentato retinico

Il mio nome è Allison Clavon. Sono assistente di ricerca per il dottor Alex Bishop presso l'Istituto di Ricerca sul Cancro Pediatrico Gree dell'UT Health Science Center di San Antonio, in Texas. Oggi illustrerò come dissezionare l'occhio di un roditore per ottenere l'intero strato dell'epitelio pigmentato della retina.

Questo tessuto è di interesse per lo studio dello sviluppo e delle malattie della retina ed è anche il sito di un saggio di riparazione del DNA mediata da omologia in vivo. Cominciamo dunque. Ecco un occhio pronto per essere dissezionato.

Prima di tutto, esaminiamo le strutture anatomiche che utilizzerai come punti di riferimento durante tutta la procedura. Questi sono gli occhi di un animale diluito. Ecco il nervo ottico nella parte posteriore dell'occhio opposto.

Questa è la cornea. L'iride è visibile attraverso la cornea. L'area biancastra nella parte posteriore dell'occhio è la sclera.

Pertanto, questa regione è chiamata divisione tra cornea e sclera. Il primo passo della dissezione consiste nel rimuovere i tessuti estranei come il tessuto connettivo muscolare e il nervo ottico. Successivamente, è necessario rimuovere la cornea, effettuando un taglio circolare.

A questo punto, la lente può essere rimossa, ottenendo una coppa oculare cava. Successivamente vengono effettuate quattro incisioni dal limite corneo-sclerale verso la testa del nervo ottico. La struttura risultante assomiglia a un fiore a quattro petali.

Ognuno di questi quattro petali viene quindi tagliato a metà, ottenendo una struttura che assomiglia a un fiore con otto petali. A questo stadio, l'I potrebbe presentare delle pieghe in alcune zone a causa della sua natura sferica. Per contrastare questo fenomeno e ottenere un foro più piatto, è possibile effettuare otto tagli più corti appena oltre le pieghe.

Saranno necessari diversi materiali facilmente accessibili al posto di lavoro, tra cui una pipetta da 100 o 200 p e relative punte, una piastra X-P-B-S-A da 35 millimetri con vetrino e coprioggetto, glicerolo al 90% e smalto trasparente per la preparazione dei vetrini, un portavetrini per l'essiccazione, una scatola di salviette Kim e un contenitore per lo smaltimento dei rifiuti. Oltre a questi materiali comuni, sarà inoltre necessaria una serie di strumenti specializzati per la microdissezione, tra cui pinzette dritte e pinzette angolate a 45 gradi, utilizzate per tenere, ruotare e manipolare in generale l'occhio durante tutta la dissezione. Queste pinzette con angolo di 15 gradi sono rivolte verso l'alto e vengono utilizzate anche per la manipolazione e la gestione dell'occhio.

Infine, avrete bisogno di un paio di forbici a molla. È molto importante utilizzare forbici a molla piuttosto che forbici di stile tradizionale. Per questa dissezione, prima di iniziare, assicuratevi che l'altezza della sedia sia regolata in modo che, quando siete seduti diritti, i vostri occhi siano all'altezza degli oculari.

Stare curvi al microscopio provoca dolore alle spalle e alla schiena e compromette la qualità delle dissezioni. Per iniziare, versare un XPBS nel coperchio della piastra da 35 millimetri. Successivamente, trasferire gli occhi che si intende dissezionare nella piastra.

Questo è un occhio di un topo selvatico C57 nero. Si può notare che è molto piccolo, con un diametro di circa tre millimetri e mezzo. L'opacità della sclera gli conferisce una tinta bluastra.

Il primo passo nella dissezione consiste nel rimuovere tutti i tessuti estranei attorno all'occhio, come il tessuto connettivo muscolare e il nervo ottico. Qui tengo le pinzette a 45 gradi nella mano sinistra e le pinzette a 15 gradi nella mano destra. È possibile utilizzare una coppia di pinzette per stabilizzare l'occhio mentre si estrae il tessuto con l'altra.

Quando un grosso pezzo di tessuto si stacca, pulire con cura la pinzetta su un fazzoletto Kim. Prestare attenzione a non schiacciare o perforare l'occhio. Uno dei vantaggi di eseguire questa dissezione in sospensione è che è possibile vedere facilmente il tessuto connettivo allontanarsi dall'occhio.

Arriverai infine a un punto in cui non potrai rimuovere ulteriore tessuto utilizzando la pinzetta. Sostituisci la pinzetta con angolazione di 15 gradi con le forbici a molla. Usa le forbici a molla per recidere il nervo ottico.

Utilizzare il bordo esterno della lama per spingere il tessuto in avanti verso il limite corneo-sclerale. Quindi tagliare e pulire delicatamente le forbici su un fazzoletto in tessuto non tessuto. Rivediamo nuovamente questo passaggio.

Spingere il tessuto in avanti verso il limite corneo-sclerale con il bordo esterno delle forbici quando il tessuto è sollevato. Tagliare, continuare a spingere in avanti frammenti di tessuto con il bordo ottuso delle forbici e quindi rimuoverli mediante taglio, fino a quando tutto il tessuto estraneo non è stato eliminato. Di solito ci sono due bande di tessuto resistente sull'occhio.

Il primo è attaccato al limite tra cornea e sclera, e il secondo viene mostrato mentre viene tagliato. Questa zona si trova all'incirca a metà strada tra il limite corneo-sclerale e la testa del nervo ottico. Il passo successivo nella dissezione consiste nel rimuovere la cornea e il cristallino.

Utilizzare la pinza a 45 gradi per sollevare un lembo approssimativamente al centro della cornea. Quindi utilizzare le forbici a molla per praticare un piccolo taglio alla base del lembo. Inserire la lama inferiore delle forbici nel taglio, sotto l'iride.

Eseguire un taglio verso, ma non all'interno, il limite corneo-sclerale. Ora ruotare lentamente l'occhio di 360 gradi, effettuando piccoli tagli lungo tutto il perimetro. Cercare di mantenere le forbici al di sotto dell'iride, tagliando contemporaneamente sia la cornea che l'iride.

Richiede molta pratica eseguire questa procedura con la stessa facilità con cui la mostro qui. Una volta rimossa la cornea, ruotare l'occhio lateralmente e premere delicatamente sull'esterno dell'occhio per far uscire la lente. La struttura rimanente avrà quindi una forma simile a una coppa.

L'occhio deve essere diviso in quarti. A tale scopo, ruotare l'occhio su un lato e inserire la lama inferiore delle forbici a molla. Eseguire un taglio longitudinale verso, ma non fino a raggiungere, la testa del nervo ottico.

Per fare ciò, tenere le braccia lungo i fianchi e le forbici davanti a sé, approssimativamente perpendicolari al corpo e al taglio oculare. Eseguire il secondo taglio direttamente opposto al primo. Prendersi del tempo per allineare correttamente in modo da poter effettuare un taglio uniforme.

Eseguire più tagli può causare irregolarità, ma se allineati con attenzione non sono evidenti; osservate come riesca a lavorare con questa forma sferica dell'occhio anziché contrastarla, poiché l'occhio mantiene la sua forma normale. Quando sospeso in PBS, il resto della dissezione avverrà su un vetrino. Sostenete l'occhio con pinzette angolate a 45 gradi e sollevatelo dal PBS.

Posizionare l'occhio su un nuovo vetrino. Utilizzando entrambe le paia di pinzette angolate, aprire con cura l'occhio. Si noti che esiste un piccolo margine di cornea e iride lungo il perimetro dell'occhio, utile per la manipolazione.

Successivamente, è necessario tagliare ciascuno dei quattro petali a metà. Ruotare l'occhio in modo che uno dei petali sia perpendicolare rispetto al proprio corpo. Afferrare l'angolo del petalo con pinze angolate a 15 gradi.

Sollevare leggermente e quindi effettuare un taglio dal limite tra cornea e sclera verso la testa del nervo ottico. Questi tagli devono essere perpendicolari a una tangente. Una tangente è una linea perpendicolare al diametro.

Pertanto, i tagli devono essere allineati con il diametro dell'occhio. Ora ruotare il vetrino in modo che il prossimo petalo sia perpendicolare al proprio corpo e ripetere l'operazione. Afferrare l'angolo del petalo.

Sollevare leggermente e tagliare. Ripetere fino a quando ciascuno dei quattro grandi pedali è stato diviso a metà. La sostanza biancastra è la retina neurale, che si trova direttamente al di sopra dell'epitelio pigmentato della retina (RPE).

La retina neurale può proteggere l'epitelio pigmentato retinico, quindi lasciarla intatta fino a quando tutti i tagli non sono stati effettuati. Osservare come i petali siano leggermente curvi. Non opporsi a questa curvatura.

Prendi il tempo necessario per allineare correttamente in modo da eseguire un unico taglio preciso. Poiché l'occhio è rotondo, tende a cedere; per prevenire questo cedimento, puoi eseguire otto tagli brevi.

Uno su ciascun petalo. Utilizzare la stessa strategia di base del precedente ciclo di quattro tagli. Sollevare l'angolo del petalo ed effettuare il taglio, ma in questo caso, tagliare solo per circa metà della lunghezza del petalo.

Dopo aver effettuato tutti i tagli, è possibile rimuovere la retina neurale. Qui sto aggiungendo alcune gocce di XPBS al campione. Non si deve permettere all'epitelio pigmentato della retina di seccarsi.

La retina neurale dovrebbe essere solo debolmente associata all'epitelio pigmentato retinico sottostante. Si può notare che si stacca con facilità. Tuttavia, di solito rimane attaccata alla divisione corneosclerale, che all'interno dell'occhio corrisponde a una cresta irregolare chiamata corpo ciliare.

È possibile inserire la punta delle pinzette a 15 gradi nella testa del nervo ottico per ancorare il campione mentre si stacca la retina neurale. Il corpo ciliare indica il margine dell'epitelio pigmentato della retina (RPE), il tessuto fortemente pigmentato che si è staccato. Questa è l'iride, non l'RPE.

Consiglio di rimuovere la maggior quantità possibile dell'iride perché è molto appiccicosa e può ripiegarsi e aderire all'epitelio pigmentato retinico (RPE) se la retina neurale è fragile o se residui di essa rimangono attaccati all'RPE. Probabilmente si è verificato uno dei due errori: o gli occhi non sono stati fissati correttamente, ad esempio per un periodo troppo lungo o troppo breve, oppure sono stati conservati troppo a lungo prima della dissezione.

Il pedale che sto scoprendo qui non ha ancora un collegamento da tastiera. Si può notare come il pedale si trovi a circa un terzo del percorso a partire dal bordo dell'epitelio pigmentato retinico. Per questo motivo si consigliano gli otto collegamenti da tastiera.

Dopo aver scartato tutta la retina neurale, utilizzare una pipetta per risciacquare più volte l'epitelio pigmentato della retina (RPE) con 100-200 microlitri di PBS fino a rimuovere completamente polvere e detriti. Pipettare da 80 a 90 microlitri di glicerolo al 90% su un vetrino pulito, formando una figura rettangolare. Si noti che questo è il volume ottimale di glicerolo per un coprioggetto di 22 per 50 millimetri e andrebbe regolato di conseguenza.

Per dimensioni diverse di vetrino coprioggetto, utilizzare la punta della pipetta per stendere il glicerolo. Avere cura di non introdurre bolle d'aria nel glicerolo. Se si forma una bolla, spostarla verso il bordo dove scoppierà.

Fare scivolare il braccio inferiore delle pinze a 15 gradi sotto l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e sollevarlo con attenzione, abbassando lentamente l'RPE nel glicerolo. L'RPE galleggerà sulla superficie del glicerolo e potrebbe arrotolarsi o torcersi leggermente. Utilizzare le pinze per raddrizzare l'RPE e trascinare il glicerolo sulla sua superficie.

Se si formano bolle d'aria, spostarle verso il bordo, dove scoppianno, tenendo il vetrino a copertura a circa 45 gradi. Appoggiarlo al bordo della glicerina.

Quindi spostatelo verso il bordo del vetrino. Tenete la parte inferiore del coprioggetto tra pollice e indice e sorreggete il bordo opposto con pinzette a 15 gradi. Abbassate molto lentamente il coprioggetto verso il vetrino non appena si verifica il contatto.

Con l'epitelio pigmentato retinico, smetti di abbassare, permettendo al glicerolo di migrare, continuando ad abbassare lentamente il tuo vetrino coprioggetto. Se abbassi il vetrino coprioggetto troppo velocemente, delle bolle d'aria si formeranno in questo punto sul tuo preparato. Abbasserò lentamente il vetrino coprioggetto quando tocca l'epitelio pigmentato retinico e permetterò al glicerolo di migrare.

Si può notare che quando lascio andare rapidamente il vetrino coprioggetto, si formano bolle d'aria. Utilizzare una quantità generosa di smalto trasparente per fissare il bordo del vetrino coprioggetto al vetrino portaoggetto lungo tutto il perimetro.

Questo è un tipico epitelio pigmentato retinico (RPE) di un topo nero C57. È normale osservare la vascolarizzazione sottostante, come indicato in questo caso. È inoltre normale notare alcune variazioni nella pigmentazione, come ad esempio aree che appaiono meno pigmentate.

Tuttavia, macchie chiare come questa sono probabilmente dovute a danni fisici all'epitelio pigmentato retinico (RPE) e al coroide sottostante. Poiché anche il coroide dell'occhio è pigmentato, è possibile che un danno a un RPE nero passi inosservato se il coroide rimane integro.

Questo è un RPE tipico di un topo diluito. Come indicato, sarà possibile osservare la vascolarizzazione e si noteranno alcune variazioni nella pigmentazione, come aree più scure e aree più chiare. Tuttavia, è quasi impossibile rilevare danni su un RPE diluito.

Queste piccole macchie sono danni o rappresentano una normale variazione della pigmentazione? Suggerisco di utilizzare la piegatura e la colorazione per affrontare questa domanda. Ti darà un'idea se stai manipolando l'I due in modo troppo brusco.

Il colorante delinea chiaramente le membrane cellulari, rendendo evidenti le aree danneggiate, ma in realtà l'epitelio pigmentato retinico è abbastanza resistente e, se si maneggia l'occhio attraverso la cornea, è improbabile causare danni. Ecco un preparato in montatura intera con numerosi problemi, tra cui il meno grave è un margine di cornea troppo ampio, che può causare increspature e piegature del materiale ondulato. Si può notare la presenza di un'ampia quantità di tessuto residuo sulla parte posteriore dell'occhio.

Questo pedale è parzialmente ripiegato, e qui si può osservare che l'epitelio pigmentato retinico è stato parzialmente lacerato. Un altro problema è che questo occhio presenta l'aspetto di una ruota a palette. Qui ho indicato gli angoli delle incisioni.

Tuttavia, è così che avrebbero dovuto essere. Ricordate, i vostri tagli devono essere perpendicolari alla tangente e allineati con il diametro. Ho appena dimostrato come dissezionare l'occhio di un topo per un preparato completo del pigmento retinico.

L'epitelio, la cosa più importante è mantenere una buona postura, ma cercate di rimanere rilassati. Spero che questo video vi sia stato utile e vi auguro il meglio per i vostri futuri esperimenti.