Name: Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dellepitelio pigmentato retinico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Scopri la dissezione dell'occhio di topo per ottenere un monte intero dell'epitelio pigmentato retinico. Questa tecnica è fondamentale per studiare lo sviluppo retinico e le malattie oculari in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Environmental Health Sciences [K22ES012264 a AJRB] e un American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] pilota projectaward [a AJRB]. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Vescovo per la lettura critica del manoscritto e commenti sul video e Adam Brown in particolare, per l&#39;esempio di cosa non fare. Ringraziamo il Dr. Donald McEwen del Cancro Greehey per bambini Istituto di Ricerca per averci permesso l&#39;uso della sua portata dissezione / videocamera set-up per le riprese del video dissezione. Ringraziamo Daron Brown Corte strumenti per l&#39;affilatura e la riparazione dei nostri strumenti di microdissezione.

1. Rimuovere il tessuto estranea dalla parte esterna dell'occhio <ol><li> Versare 1X PBS nel coperchio di un piatto da 35 mm. Il livello dovrebbe essere appena sotto il bordo del coperchio. </li><li> Utilizzando pinze dritto, occhio di trasferimento (s) dal tubo di stoccaggio per il piatto da 35 mm. Gli occhi sono immersi in PBS per due motivi: 1. I tessuti estranei si "galleggiare" lontano dagli occhi in modo da poter vedere e rimuovere facilmente, e 2. Durante la dissezione, l'occhio naturalmente mantenere la sua forma sferica, mentre in sospensione, che consente di lavorare con questa forma, piuttosto che contro di essa. </li><li> Utilizzando entrambe le coppie di pinze ad angolo (45 ° e 15 °), rimuovere delicatamente il muscolo e del tessuto connettivo più possibile, tirando il tessuto contro il grano (cioè verso la cornea). Alcuni tessuto connettivo rimarrà. Sforzo dovrebbe essere fatto per spremere il bulbo oculare il meno possibile. </li><li> Commercio tuoi 15 ° per le forbici pinze a molla. Mentre si tiene l'occhio fisso con 45 pinze °, usare le forbici per tagliare via primavera muscolare residua e del tessuto connettivo, così come il nervo ottico. * Suggerimento: utilizzare il bordo esterno delle forbici per spingere il tessuto contro il grano (verso il Corneo-sclerale divisione) e poi tagliare. Continuare fino a tutto il tessuto estraneo è stata rimossa dall'occhio. </li></ol> 2. Togliere la cornea e la lente <ol><li> Con la cornea rivolta verso l'alto, usare il forcipe 45 ° a pizzicare una piega piccola al centro della cornea. </li><li> Utilizzando le forbici primavera, fare una piccola incisione alla base del lembo. Lascia andare il lembo. </li><li> Tenendo gli occhi ancora con il forcipe, inserire la lama inferiore a forbice e in perpendicolare l'incisione ed effettuare un taglio verso il Corneo-sclerale dividere. Cercate di mantenere la vostra lama inferiore sotto l'iride così sia la cornea e iride sono tagliati. Non tagliare fino al Corneo-sclerale dividere. Tenere le forbici inserito negli occhi. </li><li> Utilizzando il forcipe 45 °, con attenzione ruotare l'occhio in modo che le forbici siano parallele al Corneo-sclerale dividere e fare un piccolo taglio. Ruotare lentamente I ° occhio 360, facendo piccole incisioni tutto intorno. Ancora una volta, cercare di mantenere la lama inferiore del forbici primavera sotto l'iride in modo che sia l'iride e la cornea vengono tagliati. Sollevare l'iride e la cornea lontano dal resto dell'occhio e disfarsene. </li><li> Inclinare l'occhio su un lato e premere leggermente sulla metà posteriore dell'occhio, costringendo la lente fuori. Eliminare l'obiettivo. L'interno della conchiglia oculare rimanente è rivestita dalla retina neurale, che dovrebbe apparire liscio e opaco. </li></ol> 3. Quarto l'oculare con conseguente, risultando in un 4 - "petali", fiore-come la struttura <ol><li> L'occhio deve essere posizionato in modo tale che l'apertura della conchiglia oculare è perpendicolare al vostro corpo. Usa la tua pinza 45 ° posizione stabile e il paraocchi. </li><li> Tenendo le forbici primavera di fronte a voi in modo che siano perpendicolari al vostro corpo, inserire la lama inferiore del forbici molla nel bordo superiore della coppa occhio aperto. Utilizzando il forcipe 45 °, con attenzione allineare l'oculare in modo che un unico taglio dritto può essere fatta dal Corneo-sclerale dividere verso la testa del nervo ottico. Tutti i tagli devono essere perpendicolari alla Corneo-sclerale dividono e se non specificato, dovrebbe andare il più vicino alla testa del nervo ottico possibile senza il taglio in esso. </li><li> Ruotare di 180 ° oculare, mantenendo la sua perpendicolarità con il tuo corpo. Usare la tecnica al punto 3.2 per fare un secondo taglio perpendicolare. </li><li> Ruotare l'oculare e ripetere la tecnica descritta al punto 3.2 per fare due tagli più. Tutti e quattro i tagli dovrebbero essere il più vicino a 90 ° di distanza possibile. Tenete a mente che l'occhio non è perfettamente sferica quindi non ci sarà una certa variabilità. </li></ol> 4. Tagliare ciascuno dei quattro "petali" a metà, con un conseguente otto petali di fiori come la struttura <ol><li> Trasferire il oculare squartato dal piatto 35mm a un vetrino pulito. Con l'oculare rivolto verso l'alto, scoop sotto di essa a pinze a 45 °. Delicatamente sollevare il liquido e metterlo su un vetrino pulito. </li><li> Utilizzando entrambe le coppie di pinze ad angolo, con delicatezza si aprono gli occhi, con la retina neurale verso l'alto. NON RIMUOVERE LA RETINA-NEURALI aiuta l'occhio mantenere alcune delle sue forma sferica in modo che non sta lavorando contro di essa. Inoltre protegge il RPE di essere accidentalmente danneggiato nelle seguenti procedure. </li><li> Ruotare la diapositiva fino a quando uno dei petali è perpendicolare al vostro corpo. </li><li> Usa la tua pinza 15 °, con delicatezza afferrare l'angolo del petalo. L'angolo del petalo dovrebbe essere cornea, non retina neurale o RPE. Sollevare l'angolo dolcemente, permettendo così di mantenere la sua curvatura. </li><li> Inserire la lama inferiore della forbice molla tra il petalo e la diapositiva. Allineare le forbici in modo che un singolo, dritto, perpendicolare taglio può essere fatto dal Corneo-sclerale dividere verso la testa del nervo ottico. Tagliati il ​​più vicino alla testa del nervo ottico come withou possibilet taglio in esso. Lascia andare il petalo, permettendo così di mentire sulla diapositiva. </li><li> Ruotare la diapositiva 90 °, in modo che il petalo successivo è perpendicolare al vostro corpo. Ripetere il punto 4.5. </li><li> Ripetere i passi 4.5 e 4.6 volte di più. La struttura risultante dovrebbe essere simile a un otto petali di fiore. </li></ol> 5. Rimuovere la retina neurale <ol><li> Pipetta 100-200 ml di PBS 1X sul campione. Questo consentirà di evitare la retina neurale di attaccarsi come staccatelo della RPE. </li><li> Di solito la retina neurale è vagamente collegato al RPE. Tuttavia, ci vuole pratica e abilità per rimuovere solo la retina neurale e non l'RPE. Afferrare un petalo della retina neurale con un paio di pinze ad angolo, mentre la stabilizzazione (tenendo premuto) il resto degli occhi con l'altra coppia di pinze ad angolo. Tirare la retina neurale lontano dal resto dell'occhio. Continuare questa procedura fino a quando l'intera retina neurale è stato rimosso. * Suggerimento: bastone la punta delle pinze 15 ° nella testa del nervo ottico per ancorare l'occhio. Quindi utilizzare le pinze 45 ° a spazzare sotto la retina neurale e sollevarlo e via. Di solito è meglio per sollevare la retina neurale dalla testa del nervo ottico verso la Corneo-sclerale dividere. Assicurati di tirare fuori ogni residuo sciolto dell'iride. L'iride è molto appiccicosa e può altrimenti si blocca al RPE. </li><li> Lavare il campione con PBS 1X. Pipetta 100-200 ml di PBS 1X nel campione e succhiare il backup. Gettare la PBS. Ripetere se necessario per rimuovere la polvere e detriti. </li></ol> 6. Mount che si provino (s) su un vetrino <ol><li> Pipettare 80-90 ml di glicerolo al 90% su un vetrino nuovo in una forma rettangolare. Utilizzare la parte del puntale per fare un pari, striscio rettangolare di glicerolo. (Questa è la procedura per il montaggio di due RPE su una diapositiva.) </li><li> Inserire il braccio inferiore di 15 ° sotto forcipe il campione. Sollevare delicatamente il campione dal vetrino dissezione. </li><li> Abbassare lentamente il campione in glicerolo. Muovere delicatamente la pinza come li tira fuori da sotto il provino. </li><li> Ripetere i passaggi 6,1-6,3 per il campione di altri. </li><li> Ruotare la diapositiva in modo che il lato lungo è perpendicolare al vostro corpo. Tenere il vetro di copertura ad un angolo di 45 ° alla diapositiva in modo che tocca la diapositiva. Spostarlo verso il glicerolo striscio fino a quando non toccano. Mantenendo il contatto tra il vetro di copertura e far scorrere, spostare lentamente il vetro coperchio dalla macchia, verso il bordo della diapositiva. Allineare i lati lunghi della diapositiva e il vetro di copertura in modo che siano paralleli. Afferrare gli angoli del vetro di copertura tra il pollice e l'indice. </li><li> Raccogliete i 15 ° in pinza l'altra mano. Culla in alto (gratuito) bordi del vetro di copertura nell'incavo del braccio. Molto lentamente, abbassare il vetro di copertura. Quando avviene il contatto tra il vetro di copertura e il glicerolo, fermarsi e attendere che il glicerolo a migrare. Ripetere questo abbassamento e in attesa fino a quando i monti RPE suo complesso sono completamente coperti. Questo per evitare che il glicerolo altamente viscosi dalla cattura bolle d'aria. NON spingere il vetrino - il glicerolo si spremere fuori da sotto, rendendo l'adesione molto povera. </li><li> Con chiaro smalto, vernice intorno al perimetro in cui il vetro di copertura e far scorrere incontrano. </li><li> Mettere il vetrino in cima di un rack vuoto ad asciugare. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Il risultato di questa procedura dovrebbe essere una struttura che sembra un fiore e dovrebbe essere abbastanza simmetrico. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Tutto RPE montare da un mouse tipo selvatico C67Bl/6J. RPE da nero o agouti animali devono essere di colore bruno scuro e dovrebbe avere una superficie liscia. E 'normale notare ondulazioni nella topografia dei petali. La pigmentazione su qualsiasi campione danno può essere un po 'variabile, a causa della densità variabile di pigmentazione sia del RPE e la coroide sottostante. Frecce bianche indicano ipopigmentate "canali" - questo è normale ed è dovuto alla vascolarizzazione di fondo dell'occhio. Freccia blu per danni fisici sia per l'EPR e la coroide sottostante. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Tutto RPE montare da un topo diluito. I campioni raccolti da animali diluite può variare di colore dal quasi trasparente al café au lait e qualunque esemplare è come avere variabilità al suo interno, indicato in cerchi neri qui. In generale, RPE raccolti da animali più giovani sono più leggeri e quelli raccolti da animali più vecchi sono più scuri. Frecce nere indicano alcuni dei vasi sottostanti, che appare ipopigmentate. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Falloidina colorazione può essere utilizzato per rilevare i danni fisici al RPE. Colorazione falloidina delinea chiaramente le membrane cellulari, che mostra la forma esagonale dell'epitelio. (A) Esempio di un topo nero. (B) Esempio di un topo diluito. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Un RPE poco sezionato da un topo diluito. (A) Le parentesi indicano i margini di cornea che sono troppo larghi, che possono causare deformazioni e / o pieghevoli. All'interno del cerchio nero si possono vedere una quantità eccessiva di tessuto estraneo che non sono stati rimossi dalla parte posteriore dell'occhio. Sono particolarmente evidenti perché il campione è da un animale diluita. Il petalo in basso a sinistra è parzialmente ripiegato. (B) Questa montare tutto ha l'aspetto di una girandola. Frecce nere indicano alcuni dei tagli che sono state fatte. Molti dei tagli dal Corneo-sclerale dividere verso la testa del nervo ottico non sono in linea con il diametro. (C), le frecce nere indicano come i tagli avrebbero dovuto essere effettuati, in linea con il diametro e perpendicolare alla tangente.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La RPE è il sito delle Nazioni Unite p test, un test in vivo di omologia-diretto di riparazione. Il saggio p ONU è stata usata per studiare gli effetti dei danni del DNA diverso 1,2 e segnalazione danni del DNA e geni di riparazione 3,4,5 sulla frequenza di omologia-diretto di riparazione. Questo test è molto sensibile, rileva cella singola eventi sulla RPE 1. Si può anche rilevare le differenze nei tempi di omologia-diretto eventi di ripa...

<table><tbody><tr><td>pinze dritte</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>punta: 0,08 x 0,04 mm materiale: INOX</td></tr><tr><td>pinze a 45&amp;#x00B0;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>punta: 0,05 x 0,01 mm materiale: INOX</td></tr><tr><td>pinze a 15&amp;#x00B0; &quot;verso l'alto&quot;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>punta: 0,1 x 0,06 mm materiale: INOX</td></tr><tr><td>forbici a molla</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>larghezza della punta a pettine 0,3 mm, lunghezza del bordo tagliente 3 mm, materiale: acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>microscopio stereoscopico binoculare</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>utilizzare sorgente di luce riflessa</td></tr><tr><td>falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

L&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova nella parte posteriore dell&#39;occhio dei mammiferi, appena sotto la retina neurale, che contiene i fotorecettori (coni e bastoncelli). La RPE è un monostrato di cellule pigmentate cuboidali e associa a stretto contatto con la retina neurale sopra di esso. Questa associazione fa la RPE di grande interesse per i ricercatori che studiano le malattie della retina. La RPE è anche il luogo di un test in vivo di omologia-diretto di riparazione del DNA, il test p Nazioni Unite. L&#39;occhio del mouse è particolarmente difficile da analizzare per le sue ridotte dimensioni (circa 3,5 millimetri di diametro) e la sua forma sferica. Questo articolo illustra in dettaglio una procedura per la dissezione degli occhi con conseguente montare tutta la RPE. In questa procedura, si mostra come lavorare con e non contro, la struttura sferica dell&#39;occhio. In breve, il tessuto connettivo, muscolare e del nervo ottico vengono rimossi dalla parte posteriore dell&#39;occhio. Poi, la cornea e la lente sono stati rimossi. Successivamente, tagli strategici sono realizzati che si traducono in appiattimento significativa del tessuto residuo. Infine, la retina neurale è leggermente sollevato, rivelando una RPE intatto, che è ancora collegato al sottostante coroide e sclera. Questo monte intera può essere utilizzato per eseguire il test p Nazioni Unite o per la valutazione immunoistochimica o immunofluorescenza del tessuto RPE.

Una dimostrazione formale della dissezione di un occhio del mouse, per un monte di tutto l&#39;epitelio pigmentato retinico.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova nella parte posteriore dell'occhio dei mammiferi, appena sotto la retina neurale, che contiene i fotorecettori (bastoncelli e ...

Il mio nome è Allison Clavon. Sono assistente di ricerca per il dottor Alex Bishop presso l'Istituto di Ricerca sul Cancro Pediatrico Gree dell'UT Health Science Center di San Antonio, in Texas. Oggi illustrerò come dissezionare l'occhio di un roditore per ottenere l'intero strato dell'epitelio pigmentato della retina.Questo tessuto è di interesse per lo studio dello sviluppo e delle malattie della retina ed è anche il sito di un saggio di riparazione del DNA mediata da omologia in vivo. Cominciamo dunque. Ecco un occhio pronto per essere dissezionato.Prima di tutto, esaminiamo le strutture anatomiche che utilizzerai come punti di riferimento durante tutta la procedura. Questi sono gli occhi di un animale diluito. Ecco il nervo ottico nella parte posteriore dell'occhio opposto.Questa è la cornea. L'iride è visibile attraverso la cornea. L'area biancastra nella parte posteriore dell'occhio è la sclera.Pertanto, questa regione è chiamata divisione tra cornea e sclera. Il primo passo della dissezione consiste nel rimuovere i tessuti estranei come il tessuto connettivo muscolare e il nervo ottico. Successivamente, è necessario rimuovere la cornea, effettuando un taglio circolare.A questo punto, la lente può essere rimossa, ottenendo una coppa oculare cava. Successivamente vengono effettuate quattro incisioni dal limite corneo-sclerale verso la testa del nervo ottico. La struttura risultante assomiglia a un fiore a quattro petali.Ognuno di questi quattro petali viene quindi tagliato a metà, ottenendo una struttura che assomiglia a un fiore con otto petali. A questo stadio, l'I potrebbe presentare delle pieghe in alcune zone a causa della sua natura sferica. Per contrastare questo fenomeno e ottenere un foro più piatto, è possibile effettuare otto tagli più corti appena oltre le pieghe.Saranno necessari diversi materiali facilmente accessibili al posto di lavoro, tra cui una pipetta da 100 o 200 p e relative punte, una piastra X-P-B-S-A da 35 millimetri con vetrino e coprioggetto, glicerolo al 90% e smalto trasparente per la preparazione dei vetrini, un portavetrini per l'essiccazione, una scatola di salviette Kim e un contenitore per lo smaltimento dei rifiuti. Oltre a questi materiali comuni, sarà inoltre necessaria una serie di strumenti specializzati per la microdissezione, tra cui pinzette dritte e pinzette angolate a 45 gradi, utilizzate per tenere, ruotare e manipolare in generale l'occhio durante tutta la dissezione. Queste pinzette con angolo di 15 gradi sono rivolte verso l'alto e vengono utilizzate anche per la manipolazione e la gestione dell'occhio.Infine, avrete bisogno di un paio di forbici a molla. È molto importante utilizzare forbici a molla piuttosto che forbici di stile tradizionale. Per questa dissezione, prima di iniziare, assicuratevi che l'altezza della sedia sia regolata in modo che, quando siete seduti diritti, i vostri occhi siano all'altezza degli oculari.Stare curvi al microscopio provoca dolore alle spalle e alla schiena e compromette la qualità delle dissezioni. Per iniziare, versare un XPBS nel coperchio della piastra da 35 millimetri. Successivamente, trasferire gli occhi che si intende dissezionare nella piastra.Questo è un occhio di un topo selvatico C57 nero. Si può notare che è molto piccolo, con un diametro di circa tre millimetri e mezzo. L'opacità della sclera gli conferisce una tinta bluastra.Il primo passo nella dissezione consiste nel rimuovere tutti i tessuti estranei attorno all'occhio, come il tessuto connettivo muscolare e il nervo ottico. Qui tengo le pinzette a 45 gradi nella mano sinistra e le pinzette a 15 gradi nella mano destra. È possibile utilizzare una coppia di pinzette per stabilizzare l'occhio mentre si estrae il tessuto con l'altra.Quando un grosso pezzo di tessuto si stacca, pulire con cura la pinzetta su un fazzoletto Kim. Prestare attenzione a non schiacciare o perforare l'occhio. Uno dei vantaggi di eseguire questa dissezione in sospensione è che è possibile vedere facilmente il tessuto connettivo allontanarsi dall'occhio.Arriverai infine a un punto in cui non potrai rimuovere ulteriore tessuto utilizzando la pinzetta. Sostituisci la pinzetta con angolazione di 15 gradi con le forbici a molla. Usa le forbici a molla per recidere il nervo ottico.Utilizzare il bordo esterno della lama per spingere il tessuto in avanti verso il limite corneo-sclerale. Quindi tagliare e pulire delicatamente le forbici su un fazzoletto in tessuto non tessuto. Rivediamo nuovamente questo passaggio.Spingere il tessuto in avanti verso il limite corneo-sclerale con il bordo esterno delle forbici quando il tessuto è sollevato. Tagliare, continuare a spingere in avanti frammenti di tessuto con il bordo ottuso delle forbici e quindi rimuoverli mediante taglio, fino a quando tutto il tessuto estraneo non è stato eliminato. Di solito ci sono due bande di tessuto resistente sull'occhio.Il primo è attaccato al limite tra cornea e sclera, e il secondo viene mostrato mentre viene tagliato. Questa zona si trova all'incirca a metà strada tra il limite corneo-sclerale e la testa del nervo ottico. Il passo successivo nella dissezione consiste nel rimuovere la cornea e il cristallino.Utilizzare la pinza a 45 gradi per sollevare un lembo approssimativamente al centro della cornea. Quindi utilizzare le forbici a molla per praticare un piccolo taglio alla base del lembo. Inserire la lama inferiore delle forbici nel taglio, sotto l'iride.Eseguire un taglio verso, ma non all'interno, il limite corneo-sclerale. Ora ruotare lentamente l'occhio di 360 gradi, effettuando piccoli tagli lungo tutto il perimetro. Cercare di mantenere le forbici al di sotto dell'iride, tagliando contemporaneamente sia la cornea che l'iride.Richiede molta pratica eseguire questa procedura con la stessa facilit&agrave; con cui la mostro qui. Una volta rimossa la cornea, ruotare l'occhio lateralmente e premere delicatamente sull'esterno dell'occhio per far uscire la lente. La struttura rimanente avr&agrave; quindi una forma simile a una coppa.L'occhio deve essere diviso in quarti. A tale scopo, ruotare l'occhio su un lato e inserire la lama inferiore delle forbici a molla. Eseguire un taglio longitudinale verso, ma non fino a raggiungere, la testa del nervo ottico.Per fare ciò, tenere le braccia lungo i fianchi e le forbici davanti a sé, approssimativamente perpendicolari al corpo e al taglio oculare. Eseguire il secondo taglio direttamente opposto al primo. Prendersi del tempo per allineare correttamente in modo da poter effettuare un taglio uniforme.Eseguire più tagli può causare irregolarità, ma se allineati con attenzione non sono evidenti; osservate come riesca a lavorare con questa forma sferica dell'occhio anziché contrastarla, poiché l'occhio mantiene la sua forma normale. Quando sospeso in PBS, il resto della dissezione avverrà su un vetrino. Sostenete l'occhio con pinzette angolate a 45 gradi e sollevatelo dal PBS.Posizionare l'occhio su un nuovo vetrino. Utilizzando entrambe le paia di pinzette angolate, aprire con cura l'occhio. Si noti che esiste un piccolo margine di cornea e iride lungo il perimetro dell'occhio, utile per la manipolazione.Successivamente, è necessario tagliare ciascuno dei quattro petali a metà. Ruotare l'occhio in modo che uno dei petali sia perpendicolare rispetto al proprio corpo. Afferrare l'angolo del petalo con pinze angolate a 15 gradi.Sollevare leggermente e quindi effettuare un taglio dal limite tra cornea e sclera verso la testa del nervo ottico. Questi tagli devono essere perpendicolari a una tangente. Una tangente è una linea perpendicolare al diametro.Pertanto, i tagli devono essere allineati con il diametro dell'occhio. Ora ruotare il vetrino in modo che il prossimo petalo sia perpendicolare al proprio corpo e ripetere l'operazione. Afferrare l'angolo del petalo.Sollevare leggermente e tagliare. Ripetere fino a quando ciascuno dei quattro grandi pedali è stato diviso a metà. La sostanza biancastra è la retina neurale, che si trova direttamente al di sopra dell'epitelio pigmentato della retina (RPE).La retina neurale può proteggere l'epitelio pigmentato retinico, quindi lasciarla intatta fino a quando tutti i tagli non sono stati effettuati. Osservare come i petali siano leggermente curvi. Non opporsi a questa curvatura.Prendi il tempo necessario per allineare correttamente in modo da eseguire un unico taglio preciso. Poiché l'occhio è rotondo, tende a cedere; per prevenire questo cedimento, puoi eseguire otto tagli brevi.Uno su ciascun petalo. Utilizzare la stessa strategia di base del precedente ciclo di quattro tagli. Sollevare l'angolo del petalo ed effettuare il taglio, ma in questo caso, tagliare solo per circa metà della lunghezza del petalo.Dopo aver effettuato tutti i tagli, è possibile rimuovere la retina neurale. Qui sto aggiungendo alcune gocce di XPBS al campione. Non si deve permettere all'epitelio pigmentato della retina di seccarsi.La retina neurale dovrebbe essere solo debolmente associata all'epitelio pigmentato retinico sottostante. Si può notare che si stacca con facilità. Tuttavia, di solito rimane attaccata alla divisione corneosclerale, che all'interno dell'occhio corrisponde a una cresta irregolare chiamata corpo ciliare.È possibile inserire la punta delle pinzette a 15 gradi nella testa del nervo ottico per ancorare il campione mentre si stacca la retina neurale. Il corpo ciliare indica il margine dell'epitelio pigmentato della retina (RPE), il tessuto fortemente pigmentato che si è staccato. Questa è l'iride, non l'RPE.Consiglio di rimuovere la maggior quantità possibile dell'iride perché è molto appiccicosa e può ripiegarsi e aderire all'epitelio pigmentato retinico (RPE) se la retina neurale è fragile o se residui di essa rimangono attaccati all'RPE. Probabilmente si è verificato uno dei due errori: o gli occhi non sono stati fissati correttamente, ad esempio per un periodo troppo lungo o troppo breve, oppure sono stati conservati troppo a lungo prima della dissezione.Il pedale che sto scoprendo qui non ha ancora un collegamento da tastiera. Si può notare come il pedale si trovi a circa un terzo del percorso a partire dal bordo dell'epitelio pigmentato retinico. Per questo motivo si consigliano gli otto collegamenti da tastiera.Dopo aver scartato tutta la retina neurale, utilizzare una pipetta per risciacquare più volte l'epitelio pigmentato della retina (RPE) con 100-200 microlitri di PBS fino a rimuovere completamente polvere e detriti. Pipettare da 80 a 90 microlitri di glicerolo al 90% su un vetrino pulito, formando una figura rettangolare. Si noti che questo è il volume ottimale di glicerolo per un coprioggetto di 22 per 50 millimetri e andrebbe regolato di conseguenza.Per dimensioni diverse di vetrino coprioggetto, utilizzare la punta della pipetta per stendere il glicerolo. Avere cura di non introdurre bolle d'aria nel glicerolo. Se si forma una bolla, spostarla verso il bordo dove scoppierà.Fare scivolare il braccio inferiore delle pinze a 15 gradi sotto l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e sollevarlo con attenzione, abbassando lentamente l'RPE nel glicerolo. L'RPE galleggerà sulla superficie del glicerolo e potrebbe arrotolarsi o torcersi leggermente. Utilizzare le pinze per raddrizzare l'RPE e trascinare il glicerolo sulla sua superficie.Se si formano bolle d'aria, spostarle verso il bordo, dove scoppianno, tenendo il vetrino a copertura a circa 45 gradi. Appoggiarlo al bordo della glicerina.Quindi spostatelo verso il bordo del vetrino. Tenete la parte inferiore del coprioggetto tra pollice e indice e sorreggete il bordo opposto con pinzette a 15 gradi. Abbassate molto lentamente il coprioggetto verso il vetrino non appena si verifica il contatto.Con l'epitelio pigmentato retinico, smetti di abbassare, permettendo al glicerolo di migrare, continuando ad abbassare lentamente il tuo vetrino coprioggetto. Se abbassi il vetrino coprioggetto troppo velocemente, delle bolle d'aria si formeranno in questo punto sul tuo preparato. Abbasserò lentamente il vetrino coprioggetto quando tocca l'epitelio pigmentato retinico e permetterò al glicerolo di migrare.Si può notare che quando lascio andare rapidamente il vetrino coprioggetto, si formano bolle d'aria. Utilizzare una quantità generosa di smalto trasparente per fissare il bordo del vetrino coprioggetto al vetrino portaoggetto lungo tutto il perimetro.Questo è un tipico epitelio pigmentato retinico (RPE) di un topo nero C57. È normale osservare la vascolarizzazione sottostante, come indicato in questo caso. È inoltre normale notare alcune variazioni nella pigmentazione, come ad esempio aree che appaiono meno pigmentate.Tuttavia, macchie chiare come questa sono probabilmente dovute a danni fisici all'epitelio pigmentato retinico (RPE) e al coroide sottostante. Poiché anche il coroide dell'occhio è pigmentato, è possibile che un danno a un RPE nero passi inosservato se il coroide rimane integro.Questo è un RPE tipico di un topo diluito. Come indicato, sarà possibile osservare la vascolarizzazione e si noteranno alcune variazioni nella pigmentazione, come aree più scure e aree più chiare. Tuttavia, è quasi impossibile rilevare danni su un RPE diluito.Queste piccole macchie sono danni o rappresentano una normale variazione della pigmentazione? Suggerisco di utilizzare la piegatura e la colorazione per affrontare questa domanda. Ti darà un'idea se stai manipolando l'I due in modo troppo brusco.Il colorante delinea chiaramente le membrane cellulari, rendendo evidenti le aree danneggiate, ma in realtà l'epitelio pigmentato retinico è abbastanza resistente e, se si maneggia l'occhio attraverso la cornea, è improbabile causare danni. Ecco un preparato in montatura intera con numerosi problemi, tra cui il meno grave è un margine di cornea troppo ampio, che può causare increspature e piegature del materiale ondulato. Si può notare la presenza di un'ampia quantità di tessuto residuo sulla parte posteriore dell'occhio.Questo pedale è parzialmente ripiegato, e qui si può osservare che l'epitelio pigmentato retinico è stato parzialmente lacerato. Un altro problema è che questo occhio presenta l'aspetto di una ruota a palette. Qui ho indicato gli angoli delle incisioni.Tuttavia, è così che avrebbero dovuto essere. Ricordate, i vostri tagli devono essere perpendicolari alla tangente e allineati con il diametro. Ho appena dimostrato come dissezionare l'occhio di un topo per un preparato completo del pigmento retinico.L'epitelio, la cosa più importante è mantenere una buona postura, ma cercate di rimanere rilassati. Spero che questo video vi sia stato utile e vi auguro il meglio per i vostri futuri esperimenti.

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