Name: Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Scopri come generare colture organotipiche cerebellari e analizzare gli effetti del fast ligand sull'apoptosi cellulare in topi wild type e mutanti. Questo metodo consente studi dettagliati sulla sopravvivenza neuronale.

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Questo studio è stato finanziato in parte dalla Fondazione Ipsen. IMV è un americano Cancer Society Professore di Biologia Molecolare, ed è titolare della cattedra e Joan Irwin Jacobs in Scienze della vita esemplare. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH, Fondazione Leducq, Meriaux Fondazione, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, e la HN e Frances C. Berger Foundation. PAS è finanziato dal Fondo per McKnight Endowment Neuroscienze e il National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Gli autori desiderano ringraziare Mark Schmitt. Grafica è stato progettato da Jamie T. Simon. Sponsorizzazione è stato gentilmente fornito da Invitrogen.

1. Organotipica Culture cerebellare: <ol><li> Per generare con successo organotipica culture cerebellare uso topi tra P0-P3 o P8-P12. Per il nostro esperimento abbiamo usato topi nel P8-P12 gamma perché questo stadio di sviluppo è stato più appropriato per il nostro studio. </li><li> Preparare la dissezione e terreno di coltura: <ol><li> Dissezione del cervello e la preparazione fetta sono svolte in condizioni di scarsa artificiale di sodio liquido cerebrospinale (ACSF) contenente cloruro di calcio 1 mm, 10mM di D-glucosio, 4mm cloruro di potassio, cloruro di magnesio 5mm, 26mm bicarbonato di sodio, saccarosio e 246 mm rosso fenolo soluzione (1:1000) , pH 7.3. Per sterilizzare la soluzione, filtrare su filtro a 0,22 micron e conservare a 4 ° C. </li><li> Fette cerebellari sono coltivate nel 75% minimo essenziale mezzo di Eagle (MEM), il 25% di siero siero di cavallo, HEPES 25mm, 1 mM glutammina, 5 mg / ml di glucosio, la penicillina (100 U / ml) e streptomicina (100 U / mL). Filtrare il mezzo attraverso un filtro a 0,22 micron e conservare a 4 ° C per un massimo di due settimane. </li></ol></li><li> Sezionare il cervello in gelide medio ACSF precedentemente bollito con Carbogen (95% di ossigeno e anidride carbonica del 5%) Si noti, che la saturazione con Carbogen cambierà il pH della soluzione in modo che si sposterà da rosso ad arancione. La dissezione deve essere eseguita nel minor tempo possibile facendo attenzione a non danneggiare la struttura del cervello. </li><li> Tagliate il cervello in sezioni sagittali di 400 micron utilizzando un vibratome. <ol><li> Fare un taglio sagittale con una lametta in un emisfero, cercando di tagliare il meno possibile del cervelletto, ciò fornirà una superficie piana per affettare. La corteccia viene utilizzato solo per il supporto per rendere il taglio più facile, ma perché il tempo è una questione importante che è più conveniente tagliare la parte rostrale della corteccia con una lametta. </li><li> Usa cianoacrilato (supercolla) per fissare la posizione del cervello sul piatto vibratome metallo. E 'importante per raffreddare la piastra sul ghiaccio prima di aggiungere la colla e di diffondere bene usando la punta del tubo per formare un sottile strato adesivo. Se c'è un eccesso di colla, si staccano dalla piastra quando viene a contatto con il ACSF e il campione sarà perso. </li><li> Una volta che il cervello è attaccato alla piastra vibratome, aggiungere i media ACSF abbastanza per coprire il cervello e mettere il ghiaccio sotto la piastra per mantenerlo freddo. </li><li> Tagliate le fette 400 micron e trasferirli con una pipetta Pasteur di plastica (tagliare la punta di ampliare ed evitare danni al fette) per un 6-pozzetti di coltura cellulare contenente ACSF sul ghiaccio. </li><li> Separare il cervelletto dal resto del cervello con l'aiuto di due siringhe da insulina (siringhe di piccolo diametro 28-gauge aghi) sotto il microscopio da dissezione. Alcune fette avrà supercolla attaccato ai bordi: questo è il momento di provare a rimuoverlo in quanto può influenzare la vitalità della fetta. E 'importante farlo con cura, senza danneggiare la struttura del cervelletto. </li></ol></li><li> Trasferire le fettine cerebellare a 6-pozzetti contenenti inserti di 30 millimetri piastra di coltura con 0,4 micron pori. Aggiungere 1 ml di terreni di coltura per pozzetto, che è stato condizionato dalla pre-incubazione per almeno 2 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 (in colture cellulari incubatore). Posizionare gli inserti sulla parte superiore del supporto assicurandosi che non ci siano bolle d'aria intrappolate sotto e poi posto le fette cerebellare (1-3 per inserto) sulla parte superiore del inserti assicurandosi che siano completamente estesi e che nessun liquido li copre. Aspirare l'eccesso di mezzi di comunicazione, se necessario. Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 modifica del mezzo di coltura ogni 2 o 3 giorni. È meglio sostituire solo una porzione del mezzo (ad esempio il volume ½) in una sola volta, dal momento che contiene mezzo utilizzato fetta derivati ​​fattori trofici che sono importanti per la sopravvivenza delle cellule. </li></ol> 2. Fas trattamento e colorazione di sezioni cerebellare: <ol><li> Per l'esperimento sfida apoptotico, abbiamo prima cultura le fette per 5 giorni la sostituzione del supporto il giorno in vitro 3 (DIV3). Su DIV5 culture sono trattati con 0,5 mg / mL di anticorpi Jo2 Fas agonista aggiungendolo direttamente sul supporto in modo da avere uno sfondo pulito di morte cellulare in quanto i cambiamenti dei media possono indurre alcuni mortalità nelle culture. La metà dei pozzi sono lasciati non trattati come controlli. </li><li> Dopo 24 ore togliere la carta sotto gli inserti di aspirazione. Per risolvere le fette, aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo PFA 4% e 1 mL sotto sopra l'inserto. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo 10 minuti togliere il PFA e lavare brevemente con PBS freddo. </li><li> Avanti rimuovere il PBS e aggiungere 1 sotto mL e 1 mL sopra l'inserto del 20% ghiacciata metanolo in PBS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare nuovamente con PBS e aggiungere 1 mL e 1 mL sotto sopra l'inserto del 0,5% Triton X-100 in PBS per permeabilizzazione. Incubare per un minimo di 12 ore a 4 ° C. </li><li> Dopo permeabilizzazione, blocco con il 20% di BSA in PBS per un minimo di4 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. In questa fase le fette può essere conservato in soluzione di blocco per almeno 3 giorni a 4 ° C. </li><li> Al fine di macchiare le fette tagliate con cura la parte della membrana inserto allegato alla fetta cerebellare e trasferirlo a 24-pozzetti contenenti PBS. </li><li> L'immunocolorazione è fatta in modo sequenziale, prima con reagente TUNEL per un'ora e poi con l'anticorpo Calbidin durante la notte. <ol><li> Aspirare il PBS e aggiungere 250 microlitri off reagente TUNEL in ciascun pozzetto facendo attenzione che copre l'intera superficie della fetta. Incubare a 37 ° C per un'ora al buio. </li><li> Dopo un'ora rimuovere il mix TUNEL e lavare con PBS per tre volte per 10 minuti. </li><li> Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il PBS e aggiungere 250 microlitri di una diluizione 1 / 1000 della dell'anticorpo calbindin in PBS e incubare una notte a 4 ° C al buio. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e lavare con PBS per tre volte per 10 minuti. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di anticorpo secondario diluito 1 / 500 in PBS e incubare per almeno tre ore a temperatura ambiente al buio. Il kit TUNEL che abbiamo usato è etichettato con TMR rosso, quindi il nostro anticorpo secondario per calbindin è coniugato con Alexa-488. </li><li> Lavare tre volte per 10 minuti con PBS e montare le fette su un vetrino di vetro con un altro supporto di montaggio che contiene DAPI. </li><li> Immagine le fette con un microscopio confocale utilizzando il 488 nm e 561 nm lunghezza d'onda di eccitazione per calbindin e TUNEL, rispettivamente. </li></ol></li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: La sfida principale di questo protocollo è quello di essere in grado di generare sano culture fetta cerebellare, soprattutto perché la nostra lettura finale sarà la morte delle cellule. Una sana cultura appare come quella in cui lo strato corpo cellulare è trasparente e permette di vedere la struttura lamellare del cervelletto al microscopio (Figura 1). Dopo pochi giorni di cultura le fette inizio alle cellule sottili e non-neuronali possono essere osservati migrare lontano dai margini della fetta. Le cellule tondo scuro (macrofagi più probabile) che coprono le fette dopo pochi giorni di cultura, alla fine diminuzione del numero dopo 10-14 giorni in vitro (Figura 2) 5. La prova finale per la vitalità delle fette è a macchia di differenti marcatori cellulari, come calbindin per le cellule di Purkinje. La figura 3 mostra un'immagine rappresentativa microscopio confocale dello strato di cellule di Purkinje con diversi nuclei TUNEL positivi. E 'importante considerare che, anche se alcune fette ricevuto uno stimolo apoptotico, sono stati esposti solo per 24 ore. Questo ha permesso il tempo sufficiente per osservare la frammentazione del DNA nelle cellule morenti con la colorazione TUNEL, ma un determinato strato di cellule di Purkinje era ancora presente. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Sana fetta cerebellare a DIV2. Questa immagine mostra il corpo traslucido strato di cellule e la struttura lamellare cerebellare in una fetta sano. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Sana fetta cerebellare a DIV 7. In questa immagine possiamo ancora osservare la struttura lamellare del cervelletto e la comparsa di corpi cellulari buio. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immagine rappresentativa di una fetta Fas trattati cerebellare. Confocale Questa immagine mostra le cellule di Purkinje colorate con calbindin (verde) e le cellule apoptotiche positivo per la colorazione TUNEL (rosso). Cellule di Purkinje non appaiono in una singola riga, ma sono raggruppati formando una struttura simile folium.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

Tutto il lavoro svolto animale è stato fatto in accordo con le politiche stabilite dal IACUC. L&#39;Istituto Salk è una struttura AAALAC accreditati.

Questo metodo descrive una delle molte applicazioni possibili di culture neuronali organotipica e ci ha permesso di studiare l&#39;effetto degli stimoli apoptotici nel wild-type e mutanti fette cerebellare. La parte più critica di questo esperimento è quello di essere in grado di generare costantemente sano culture fetta cerebellare. I fattori chiave sono la dissezione e la tecnica di taglio e la capacità di eseguire il protocollo nel minor tempo possibile, ma allo stesso tempo facendo attenzione a non danneggiare le fette. Un altro fattore cruciale è la preparazione e la composizione dei terreni di coltura, queste culture sono molto sensibili, quindi abbiamo dovuto provare diverse ricette e marche di supporti. Anche diversi lotti di siero o di altri componenti dei mass media possono influenzare la vitalità delle fette. Abbiamo ottenuto i migliori risultati con il siero di cavallo da Lot Invitrogen # 480116. Una volta che le fette cerebellare si generano si può studiare lo sviluppo del cervelletto, elettrofisiologia, la sopravvivenza delle cellule da soli o in risposta a stimoli apoptotici, eccitotossicità o mancanza di ossigeno. Studi comparativi con wild-type e mutanti fette cerebellare sono stati molto perspicace in molti aspetti della funzione cerebellare e sviluppo.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Siero equino</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture cellulari a 6 pozzetti / 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per piastre di coltura da 30 mm (0,4-&amp;mu;m poro</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>NA/LE purificato da criceto anti-topo CD95 (Jo2)</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; kit per il rilevamento della morte cellulare, TMR rosso</td><td>Gruppo Roche</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Calbindina D-28k da coniglio</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secondario Alexa 488 anti-coniglio IgG capra</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Medium di montaggio Vectashield con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotipica culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Culture organotipica del tessuto neuronale sono stati introdotti da Hogue nel 1947 1,2 e hanno costituito un importante passo avanti nel campo delle neuroscienze. Da allora, la tecnica è stata sviluppata ulteriormente e attualmente ci sono molti modi diversi per preparare culture organotipica. Il metodo presentato qui è stato adattato da quello descritto da Stoppini et al. Per la preparazione delle fette e da Gogolla et al. Per la procedura di colorazione 3,4. Una caratteristica unica di questa tecnica è che permette di studiare diverse parti del cervello come l&#39;ippocampo e cervelletto nella loro struttura originale, garantendo un grande vantaggio rispetto culture dissociato in cui sono sconvolto tutta l&#39;organizzazione cellulare e reti neuronali. Nel caso del cervelletto è ancora più vantaggiosa perché consente lo studio delle cellule di Purkinje, estremamente difficili da ottenere come dissociata coltura principale. Questo metodo può essere utilizzato per studiare alcune caratteristiche dello sviluppo del cervelletto in vitro, come pure per studi elettrofisiologici e farmacologici, sia wild-type e topi mutanti. Il metodo qui descritto è stato progettato per studiare l&#39;effetto degli stimoli apoptotici, come ligando Fas nel cervelletto di sviluppo, utilizzando colorazione TUNEL per misurare la morte cellulare. Se la colorazione TUNEL è combinato con marcatori tipo di cellule specifiche, come calbindin per le cellule di Purkinje, è possibile valutare la morte cellulare in maniera specifica popolazione di cellule. La colorazione calbindin ha inoltre lo scopo di valutare la qualità delle culture del cervelletto.

Questo metodo descrive la generazione di organotipica culture cerebellare e l&#39;effetto di alcuni stimoli apoptotici sulla vitalità dei diversi tipi di cellule del cervelletto.

Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

Le colture organotipiche di tessuto neuronale sono state introdotte per la prima volta da Hogue nel 1947 1,2 e hanno rappresentato una svolta fondamentale nel campo delle neuroscienze. ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'effetto dello stimolo apoptotico fast ligand nel cervelletto in via di sviluppo di topi di tipo selvaggio e mutanti. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando il cervello di topi di tipo selvaggio e di topi knock-out tra il giorno postnatale otto e il giorno dodici. Il secondo passaggio consiste nel tagliare i cervelli in fette spesse 400 micrometri e nell'isolare il cervelletto da ciascuna fetta.Il terzo passaggio consiste nel coltivare le fette cerebellari per cinque giorni, per assicurarsi che siano sane prima di indurre la morte cellulare con il ligando rapido. L'ultimo passo della procedura è analizzare l'effetto del ligando rapido sulle diverse popolazioni cellulari cerebellari di topi di tipo selvaggio e knockout, basandosi sulla colorazione immunofluorescente per il marcatore apoptotico TUNEL, combinata con marcatori specifici per tipo cellulare come la calbindina per le cellule di Purkinje. Il principale vantaggio delle colture vitali cerebellari è che permettono il mantenimento della struttura regionale cerebellare, a differenza delle colture primarie dissociate in cui le reti neuronali e l'organizzazione multicellulare vengono interrotte.Questo approccio permetterà di rispondere ad alcune domande fondamentali nelle neuroscienze, soprattutto perché si dispone del topo wild type e del topo mutante. È quindi possibile studiare lo sviluppo comparativo, la fisiologia, nonché l'elettrofisiologia e la farmacologia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione del ligando rapido nella sopravvivenza cellulare o nel cervelletto, può essere utilizzato anche per analizzare gli effetti del ligando rapido nella corteccia e nell'ippocampo.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché, per ottenere una lisi cerebellare sana, è fondamentale inserirle in coltura nel più breve tempo possibile senza comprometterne l'integrità. È quindi importante possedere buone capacità di dissezione e di taglio prima di tentare l'intero processo. Ove possibile.I passaggi della seguente procedura devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare prima della dissezione. Preparare un mezzo CSF per la dissezione cerebrale e la preparazione delle sezioni, nonché il mezzo per la coltura delle sezioni, seguendo il protocollo scritto, e conservarli a quattro gradi Celsius nel giorno della dissezione. Preparare le piastre per colture cellulari per la coltivazione delle sezioni cerebellari.Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura per fette in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Quindi utilizzare pinze sterili per posizionare gli inserti della piastra di coltura in ciascun pozzetto, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria intrappolate sotto l'inserito.Posizionare la piastra di coltura in un incubatore per colture cellulari impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno due ore per precondizionare il mezzo. Successivamente, saturare con gas carbogeno il mezzo ACSF freddo ghiacciato. La saturazione del mezzo con carbogeno ne altera il pH e provoca un cambiamento di colore da rosso a arancione.Versare un po' del mezzo A CSF ghiacciato e gassato in una piastra di Petri sterile e in una piastra a sei pozzetti. Posizionare questi contenitori sul ghiaccio insieme alla piastra del vibratomo che verrà utilizzata per sezionare il cervello. La piastra di Petri contenente il mezzo A CSF ghiacciato e gassato sarà utilizzata per dissezionare il cervello di un topo neonato da P8 a P12 dopo la dissezione.Utilizzare una lametta per effettuare un taglio sagittale in un emisfero al fine di ottenere una superficie piana per il montaggio sulla piastra di vibrazione. Anche la parte rostrale della corteccia può essere tagliata. Asciugare la piastra di vibrazione fredda con un tovagliolo di carta.Quindi aggiungere un po' di colla istantanea sulla piattaforma e spargerla in modo a zigzag con la punta del tubetto di colla istantanea. Per formare uno strato adesivo sottile, utilizzare una spatola per trasferire il cervello sulla piattaforma del vibratomo, con il lato appiattito a contatto con la colla istantanea. Una volta che il cervello è fissato alla piastra del vibratomo, aggiungere una quantità sufficiente di mezzo CSF per coprire il cervello e porre del ghiaccio sotto la piastra per mantenerlo freddo.Tagliare il cervello in fette di 400 micrometri. Quindi utilizzare una pipetta di plastica per pasta con l'estremità tagliata e allargata per trasferire le fette nella piastra a sei pozzetti contenente mezzo CSF su ghiaccio, operando sotto il microscopio stereoscopico.Utilizzare due siringhe per insulina con aghi di piccolo diametro da 28 gauge per separare il cervelletto dal resto del cervello. Se su uno dei tagli è presente colla istantanea sul bordo, utilizzare i due aghi delle siringhe per rimuovere la colla dal taglio. Utilizzare la pipetta di plastica per pasta con l'estremità tagliata e allargata per trasferire i tagli sulla parte superiore dei filtri.L'aggiunta di una a tre fette per inserto garantisce che le fette siano completamente estese e che nessun liquido le ricopra. Se necessario, aspirare l'eccesso di mezzo con la pipetta, quindi incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore. Dopo 48 ore, sostituire metà del volume del mezzo con mezzo fresco, assicurandosi che nessuna bolla d'aria rimanga intrappolata sotto l'inserto.Il mezzo originale rimanente contiene fattori trofici derivati da tagli che sono importanti per la sopravvivenza cellulare. La sfida apoptotica viene eseguita dopo cinque giorni di coltura. Aggiungere l'anticorpo agonista rapido JO due ai mezzi di coltura cellulare nei pozzetti da trattare.Lasciare metà dei pozzetti senza trattamento come controlli. Trascorse 24 ore, aspirare il mezzo dai pozzetti. Quindi fissare le sezioni aggiungendo tramite pipetta un millilitro di paraformaldeide al 4% fredda sotto l'inserto e un millilitro di PFA sopra l'inserto.Lasciare fissare le sezioni nel PFA per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il PFA e lavare brevemente con due millilitri di PBS freddo mediante pipettaggio: un millilitro sopra l'inserto e un millilitro sotto l'inserto.Successivamente, aspirare il PBS e pipettare un millilitro di metanolo al 20% ghiacciato in PBS al di sotto dell'inserto e un millilitro al di sopra dell'inserto. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare il metanolo al 20% dal pozzetto e lavare la sezione e il pozzetto D con PBS. Come in precedenza, pipettare un millilitro di Triton X-100 allo 0,5% in PBS sopra l'inserto e un altro millilitro al di sotto dell'inserto.Incubare per un minimo di 12 ore a quattro gradi Celsius per permeabilizzare le sezioni dopo la permeazione. Aspirare la soluzione di 0,5% Triton X-100 in PBS e aggiungere con la pipetta un millilitro di BSA al 20% in PBS sopra la sezione e un millilitro al di sotto della sezione. Bloccare le sezioni per un minimo di quattro ore a temperatura ambiente oppure durante la notte a quattro gradi Celsius.Al termine del blocco, utilizzare forbici pulite per tagliare con attenzione la membrana inserita nella fetta di cervelletto. Quindi, utilizzare pinze pulite per trasferire il pezzo di membrana in una piastra a 24 pozzetti contenente PBS; aspirare il PBS e aggiungere 250 microlitri di reagente tunnel in ogni pozzetto, assicurandosi che il reagente ricopra l'intera superficie della fetta.Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora al buio; trascorso questo tempo, aspirare il reagente dalle pozzette e sostituirlo con 500 microlitri di PBS. Proteggere la piastra dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per il lavaggio.Ripetere questo processo due volte dopo l'ultimo lavaggio. Aspirare il PBS e aggiungere 250 microlitri di una diluizione uno a 1000 dell'anticorpo anti-calbindina in PBS e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius al buio. Il giorno successivo.Aspirare la soluzione dell'anticorpo primario e lavare con PBS 3 volte per 10 minuti. Quindi aggiungere 250 microlitri di anticorpo secondario diluito uno a 500 in PBS. Coprire la piastra con pellicola di alluminio per proteggere dalla luce e incubare per almeno tre ore a temperatura ambiente dopo l'incubazione.Lavare le sezioni tre volte per 10 minuti con PBS, utilizzando un mezzo di montaggio contenente dappy. Montare le sezioni su un vetrino da microscopio di vetro e coprivetrino. Acquisire le immagini delle sezioni mediante microscopio confocale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nanometri e 561 nanometri per kale, bendin e tunnel, rispettivamente.Questa immagine mostra una sezione cerebellare sana. Dopo due giorni in vitro, lo strato dei corpi cellulari appare traslucido e la struttura foliata del cervelletto è chiaramente visibile al microscopio. Dopo sette giorni in vitro, la struttura foliata della sezione cerebellare sana è ancora visibile.Inoltre, corpi cellulari scuri, probabilmente macrofagi, coprono solitamente la sezione. L'immagine confocale mostrata qui è rappresentativa di una sezione cerebellare trattata rapidamente. Le cellule bikini appaiono verdi dopo la colorazione con un anticorpo primario, seguita da un anticorpo secondario coniugato con Alexa 488.Le cellule apoptotiche positive alla colorazione TUNEL appaiono rosse poiché il kit TUNEL utilizzato è marcato con TMR. Le cellule Bikini rosse non appaiono in una singola fila, ma in gruppi che formano una struttura simile a un agglomerato durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di lavorare nell'incubatore per colture cellulari ogni volta che possibile e di minimizzare il tempo di esposizione del tessuto cerebrale a possibili contaminanti come batteri o funghi.Utilizzando questa procedura, altri metodi possono essere applicati a queste sezioni, inclusi analisi biochimiche ed elettrofisiologiche per fornire informazioni aggiuntive sul contenuto proteico e sull'eccitabilità neuronale. Questa tecnica è stata sviluppata inizialmente per studiare l'effetto della morte cellulare mediata rapida in cellule di Perkin portatrici di mutazioni che influenzano la via rapida. Le cellule periali raramente sopravvivono in coltura primaria.Quindi, questa procedura è risultata l'approccio sperimentale migliore. Spero che, dopo aver visto questo video, abbiate ora una chiara idea su come preparare sezioni di barili cerebellari e su come si possano studiare gli stimoli apatici e i loro effetti su diversi tipi cellulari cerebrali.

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Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Questo protocollo descrive come misurare con precisione la vitalità neuronale utilizzando la doppia colorazione di Fluorescein diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) nei neuroni granulari cerebellari coltivati, una coltura neuronale primaria utilizzata come modello in vitro nella ricerca neuroscienza e neurofarmacologia.

Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Qui presentiamo un metodo per preparare organotipiche fetta culture dal cervelletto di topo e guaina mielinica colorazione da immunohistochemistry adatto per studiare i meccanismi della mielinizzazione e remyelination nel sistema nervoso centrale.

Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L'uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Le colture di fette organotipiche sono un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo o degenerativi/rigenerativi. Qui, descriviamo un protocollo che modella la morte del neurosviluppo delle cellule Purkinje nelle colture di fette di cerebellar di topo. Questo metodo può beneficiare la ricerca nella scoperta di farmaci neuroprotettivi.

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Le cellule cerebellari di Purkinje (PC) sono particolarmente sensibili alle carenze nella risposta al danno del DNA. Viene presentato un protocollo per la valutazione visiva della dinamica della risposta del PC al danno al DNA, che prevede la colorazione di catene poli(ADP-ribosio) legate alle proteine all'interno di colture organotipiche cerebellari.

Visualizzazione della risposta al danno al DNA nelle cellule di Purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari

Scopri come generare colture organotipiche cerebellari e analizzare gli effetti del fast ligand sull'apoptosi cellulare in topi wild type e mutanti. Questo metodo consente studi dettagliati sulla sopravvivenza neuronale.

Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

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