Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare l'effetto del ligando veloce dello stimolo apoptotico nel cervelletto in via di sviluppo di topi wild type e mutanti. Ciò si ottiene sezionando prima il cervello di topi wild type e knockout tra l'ottavo e il dodicesimo giorno postnatale. Il secondo passo consiste nel tagliare il cervello in fette spesse 400 micrometri e isolare il cervelletto da ciascuna fetta.

Il terzo passo consiste nel coltivare le fette cerebellari per cinque giorni per assicurarsi che siano sane prima di indurre la morte cellulare con il ligando veloce. La fase finale della procedura consiste nell'analizzare l'effetto del ligando veloce nelle diverse popolazioni di cellule cerebellari di topi wild type e knockout sulla base della colorazione immunofluorescente per il tunnel marcatore apoptotico, combinata con marcatori specifici del tipo di cellula come la calbindina per le cellule bikini. Il vantaggio principale delle culture di vita cerebellare è che consente lo stile della struttura regionale cerebellare e come le culture dissociate primarie in cui le reti neuronali e diverse organizzazioni sono interrotte.

Quindi questa questione permetterà di rispondere ad alcune domande chiave nelle neuroscienze, soprattutto perché si ha il tipo selvatico e il topo mutante. Quindi si può studiare lo sviluppo comparativo, si può studiare la fisiologia, e anche l'elettrofisiologia e la farmacologia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione del ligando veloce nella sopravvivenza cerebellare o cellulare, può anche essere utilizzato all'interno degli effetti del ligando veloce nella corteccia e nell'ippocampo.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché per ottenere una lisi cerebellare sana, è fondamentale metterli in coltura il più rapidamente possibile senza comprometterne l'integrità. Pertanto, è importante avere buone capacità di dissezione e affettatura prima di tentare l'intero processo. Ove possibile.

Le fasi della seguente procedura devono essere eseguite in una cappa di coltura tissutale prima della dissezione. Preparare un terreno di coltura CSF per la dissezione cerebrale e la preparazione della fetta, nonché il terreno di coltura della fetta secondo il protocollo scritto e conservarlo a quattro gradi Celsius il giorno della dissezione. Preparare le piastre di coltura tissutale per la coltura delle fette cerebellari.

Aggiungere un millilitro di terreno di coltura a fette a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Quindi utilizzare una pinza sterile per posizionare gli inserti della piastra di coltura in ciascuno. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate sotto l'inserto.

Posizionare la piastra di coltura in un incubatore per colture tissutali Impostare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno due ore per precondizionare il terreno. Quindi, fai bollire il ghiaccio freddo. Un terreno CSF con saturazione di gas carbogeno del mezzo con carbogeno altera il pH della soluzione e produce un cambiamento di colore dal rosso all'arancione.

Versare un po' del terreno A CSF ghiacciato in una capsula di Petri sterile e in una piastra a sei pozzetti. Mettetele sul ghiaccio insieme alla piastra del vibrato che servirà per affettare il cervello. La capsula di Petri contenente un terreno di liquido cerebrospinale ghiacciato a bolle sarà utilizzata per sezionare il cervello da un cucciolo di topo P 8 a un cucciolo di topo P 12 dopo la dissezione.

Utilizzare una lama di rasoio per eseguire un taglio sagittale in un emisfero per fornire una superficie piana per il montaggio sulla piastra vibram. Anche la parte rostrale della corteccia può essere tagliata. Asciugare la piastra vibram raffreddata con un tovagliolo di carta.

Quindi aggiungere un po' di super colla al tavolino e stenderla a zig-zag con la punta del tubo di super colla. Per formare un sottile strato adesivo, utilizzare una spatola per trasferire il cervello al palco del vibrato con il lato appiattito a contatto con la super colla. Una volta che il cervello è attaccato alla piastra vibram, aggiungi abbastanza terreno CSF per coprire il cervello e aggiungi del ghiaccio sotto la piastra per mantenerlo freddo.

Tagliare il cervello a fette di 400 micrometri. Quindi utilizzare una pipetta per pasta di plastica con un taglio. Estremità allargata per trasferire le fette sulla piastra a sei pozzetti contenente un terreno CSF su ghiaccio che lavora al microscopio da dissezione.

Utilizzare due siringhe da insulina con aghi di piccolo diametro da 28 gauge per separare il cervelletto dal resto del cervello. Se una delle fette ha una super colla sul bordo, usa i due aghi da siringa per rimuovere la colla dalla fetta. Utilizzare la pipetta per pasta di plastica con un'estremità tagliata e allargata per trasferire le fette sulla parte superiore dei filtri.

L'aggiunta di una o tre fette per inserto assicura che le fette siano completamente estese e che nessun liquido le ricopra. Se necessario, aspirare il terreno in eccesso con la pipetta incubata, 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore. Dopo 48 ore, sostituire metà del volume del supporto con un supporto nuovo, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria sotto l'inserto.

Il terreno originale rimanente contiene fattori trofici derivati affettati che sono importanti per la sopravvivenza cellulare. La sfida apoptotica viene eseguita dopo cinque giorni di cultura. Aggiungere l'anticorpo agonistico veloce JO two al terreno di coltura cellulare nei pozzetti da trattare.

Lasciare metà dei pozzetti non trattati come controlli. Trascorse 24 ore, aspirare il substrato da sotto i pozzetti. Quindi fissare le fette pipettando un millilitro di ghiaccio freddo, il 4% di paraldeide sotto l'inserto e un millilitro di PFA sopra l'inserto.

Lasciare che le fette si fissino nel PFA, i 10 minuti di temperatura ambiente dopo 10 minuti. Aspirare il PFA e lavare brevemente con due millilitri di pipettaggio PBS freddo. Un millilitro sopra l'inserto e un millilitro sotto l'inserto.

Quindi, aspirare il PBS e pipettare un millilitro di metanolo ghiacciato al 20% in PBS sotto l'inserto e un millilitro sopra l'inserto. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare il 20% di metanolo dal pozzetto e lavare la fetta e il pozzetto D con PBS. Come in precedenza, pipettare un millilitro di Triton X 100 allo 0,5% in PBS sulla parte superiore dell'inserto e un altro millilitro sotto l'inserto.

Incubare per un minimo di 12 ore a quattro gradi Celsius per permeare le fette dopo la permeazione. Aspirare il Triton X 100 allo 0,5% in PBS e pipettare un millilitro di BSA al 20% in PBS sopra la fetta e un millilitro sotto la fetta. Bloccare le fette per un minimo di quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius.

Quando il blocco è completo, usa le forbici pulite per tagliare con cura il pezzo di inserto della membrana attaccato alla fetta cerebellare. Quindi, utilizzare una pinza pulita per trasferire il pezzo di membrana in una piastra da 24 pozzetti contenente PBS, aspirare il PBS e aggiungere 250 microlitri di reagente tunnel in ciascun pozzetto. Assicurarsi che il reagente copra l'intera superficie della fetta.

Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora al buio quando è trascorsa l'ora. Aspirare il reagente del tunnel dai pozzetti e sostituirlo con 500 microlitri di PBS. Proteggere la piastra dalla luce e incubarla a temperatura ambiente per 10 minuti per lavarla.

Ripetere questo processo due volte dopo l'ultimo lavaggio. Aspirare il PBS e aggiungere 250 microlitri di una diluizione da uno a 1000 dell'anticorpo calbindina nel PBS e incubare per una notte a quattro gradi Celsius al buio. Il giorno dopo.

Aspirare la soluzione di anticorpi primari e lavare con PB S3 volte per 10 minuti. Quindi aggiungere 250 microlitri di anticorpo secondario diluito uno a 500 in PBS. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare per almeno tre ore a temperatura ambiente dopo l'incubazione.

Lavare le fette tre volte per 10 minuti con PBS e utilizzando un supporto di montaggio che contenga dappy. Montare le fette su un microscopio di vetro, su un vetrino e su un vetrino coprioggetti. Visualizzare le fette con un microscopio confocale utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nanometri e 561 nanometri rispettivamente per cavolo, bendina e tunnel.

Questa immagine mostra una fetta cerebellare sana. Dopo due giorni in vitro, lo strato del corpo cellulare appare traslucido e la struttura foliata del cervelletto è chiaramente visibile al microscopio. Dopo sette giorni in vitro, la struttura foliata della fetta cerebellare sana è ancora visibile.

Inoltre, i corpi cellulari scuri, probabilmente i macrofagi, di solito coprono la fetta. L'immagine confocale qui vista è rappresentativa di una fetta cerebellare trattata velocemente. Le cellule del bikini appaiono verdi dopo la colorazione con un anticorpo primario a, seguito da un anticorpo secondario coniugato Alexa 4 88.

Le cellule apoptotiche positive per la colorazione del tunnel appaiono rosse poiché il kit del tunnel utilizzato è etichettato con TMR. Le cellule rosse del bikini non appaiono in una singola riga, ma un raggruppamento che forma una struttura simile durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di lavorare in cappa di coltura tissutale quando possibile e di ridurre al minimo la quantità di tempo in cui il tessuto cerebrale è esposto a possibili contaminanti come batteri o funghi.

Utilizzando questa procedura, è possibile applicare a queste fette altri metodi, tra cui analisi biochimiche ed elettrofisiologiche per fornire ulteriori informazioni sul contenuto proteico e sull'eccitabilità neuronale. Questa tecnica è stata originariamente sviluppata per studiare l'effetto della morte cellulare mediata veloce nelle cellule di Perkin portatrici di mutazioni che influenzano il percorso veloce. Le cellule periali raramente sopravvivono nella coltura primaria.

Quindi questa procedura è stata il miglior approccio sperimentale. Quindi spero che dopo aver visto questo video, avrai una buona idea su come fare fette di cera e su come si possono studiare gli stimoli apatici e il loro effetto su diversi tipi di cellule cerebrali.