Name: Modificato annessina V / propidio ioduro Apoptosis analisi di valutazione accurata di morte cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per valutare l'apoptosi cellulare con Annexin V/PI che riduce i falsi positivi fino al 40%. Questo metodo utilizza fissazione e degradazione dell'RNA per migliorare l'accuratezza nella citometria a flusso.

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Questo studio è stato supportato da una scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC) e un assegno di ricerca Alberta Agricoltura Finanziamento Consorzio concedere al DRB. AMR è supportata tramite una borsa di studio Vanier NSERC canadese Graduate, una Università di assistentato insegnamento Alberta e la regina Elisabetta II borsa di studio universitari.

Questa procedura può essere eseguita in 500 microlitri tubi siliconato o 6 ml in polistirolo a fondo rotondo tubi FACS. Quest'ultimo è normalmente utilizzati nello svolgimento di analisi di fattibilità in collaborazione con altre procedure. Tutti i volumi indicati sono per 6 ml di polistirolo a fondo rotondo tubi FACS. Per 500 microlitri tubi di silicone e ridurre tutti i volumi da 1 / 5. La concentrazione ottimale per l'analisi di citometria a flusso è di 2-4 x 10 6 cellule per volume di 200 microlitri. Perdita di cellule possono derivare da questa procedura, e quindi si consiglia di ogni campione è composto da 4 x 10 6 cellule all'inizio della procedura. 1. Preparazione delle cellule <ol><li> Celle di raccolta - si riferiscono a procedure specifiche per le linee di cellule corrispondente o isolamenti cellula primaria. </li><li> Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 2 ml 1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) - / - (senza calcio, senza magnesio). </li><li> Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di buffer di 1 x annessina V vincolanti. </li><li> Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ul buffer di 1 x annessina V vincolanti. </li></ol> 2. Applicazione di annessina V / PI Stain <ol><li> Aggiungi annessina V in base alle raccomandazioni del fabbricante [ad esempio 5 microlitri annessina V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. </li><li> Incubare le provette al buio per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 100 ml di buffer di 1 x annessina V vincolante per ciascun tubo di reazione. Ci dovrebbe essere di circa 200 l in ciascun tubo. </li><li> Aggiungere 4 ml di PI (Sigma, Cat # P-4864-10ML) che è stato diluito 1:10 in 1 tampone x annessina V vincolante (cioè 1 PI microlitri con 9 microlitri buffer di 1 x annessina V vincolante). Questo produrrà una concentrazione finale PI di 2 mg / ml in ciascun campione. </li><li> Incubare le provette al buio per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di buffer 1 x annessina V vincolante per lavare le cellule. </li><li> Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 500 microlitri buffer di 1 x annessina V vincolante e 500 microlitri di formaldeide al 2% per creare una soluzione all'1% di formaldeide (fissativo). Mescolare tubi da sfogliando gentile. </li><li> Fissare i campioni in ghiaccio per 10 minuti. In alternativa, i campioni possono essere conservati notte a 4 ° C al buio. Se il metodo di quest'ultimo è scelto, assicuratevi di essere coerente in tutti i tubi etichettati con annessina V / PI (compresi i controlli di compensazione). </li><li> Aggiungere 1 ml 1 x PBS - / - per ogni campione e miscelare delicatamente sfogliando. </li><li> Centrifugare i tubi a 425 x g per otto minuti e decantare il surnatante. </li><li> Ripetere i passaggi 2.10 e 2.11. </li><li> Risospendere le sfere muovendo il tubo. </li><li> Aggiungere 16 ml di diluito 1:100 RNAsi A (Sigma, R4642) per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Incubare per 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml 1 x PBS - / - e mescolare delicatamente dal sfogliando. </li><li> Centrifugare i tubi a 425 x g per otto minuti. </li><li> I campioni sono ora pronti per essere analizzati. In alternativa, i campioni possono essere utilizzati per la colorazione passi successivi se annessina / PI colorazione viene eseguita in parallelo con altre procedure. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: Esempi di tipi di cellule e linee cellulari che presentano diversi gradi di falsi positivi colorazione PI sono mostrati in Figura 1. Per spiegare il falso-positivi gli eventi, le cellule sono state fissate e poi trattati con RNasi A. Questo si traduce in una diminuzione significativa del numero di falsi positivi eventi, rispetto alle cellule che non siano sottoposti a trattamento RNasi (Figura 2B). Figura 2C mostra immagini rappresentative di cellule che sottoposti a trattamento RNAsi, rispetto alle cellule che non ha avuto un trattamento RNAsi. La Figura 3 mostra come la modifica annessina V / PI protocollo, con la fissazione e fasi di trattamento RNase, migliora protocolli convenzionali, limitando il numero di falsi positivi eventi di colorazione. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Protocolli di colorazione convenzionale propidio ioduro di portare ad un significativo numero di falsi eventi positivi. Abbiamo già valutato estensione della colorazione falsa positiva attraverso le cellule primarie attraverso una vasta gamma di modelli animali e in una varietà di linee cellulari 10. Immagini rappresentative mostrano estensione della colorazione falsa positiva in tre popolazioni di cellule unico (una linea cellulare di uso comune - macrofagi RAW e due cellule primarie - murino macrofagi del midollo osseo (BMM) e macrofagi reni pesci rossi primaria (PKM)). La vera eventi positivi visualizzare l'atteso co-localizzazione tra PI e DRAQ5 all'interno del compartimento nucleare (aree giallo raffigurano colocalizzazione tra PI e DRAQ5). DRAQ5 è altamente membranene permeabile colorante che con precisione le macchie vano nucleare in cellule vive e morte 10,11,12. Per facilitare la determinazione visiva della colocalizzazione DRAQ5 macchia è stata data una pseudocolour verde. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Migliorare l'accuratezza della colorazione PI nucleare. (A) hanno valutato l'accuratezza della colorazione PI nucleare basato sul grado di similarità di una serie di ben caratterizzato macchie nucleare (BrdU, 7-AAD e DAPI) per DRAQ5. BrdU è un nucleoside sintetico che viene incorporato nel DNA delle cellule proliferanti, e come tale sarà unica macchia all'interno del compartimento nucleare. 7-AAD ha un'alta affinità per il DNA e, simile a PI, non può attraversare una membrana plasmatica intatto. DAPI ha anche una forte affinità per il DNA nucleare ed è il più comunemente usato macchia nella microscopia a fluorescenza. Il grado di somiglianza era&gt; 99% tra BrdU, 7-AAD, DAPI e DRAQ5, evidenziando la loro capacità di macchiare con precisione il nucleo della cellula in macrofagi RAW 264.7. Al contrario, la colorazione citoplasmatica PI sulla base di protocolli convenzionali porta ad una diminuzione marcata somiglianza per cento della colorazione rispetto al DRAQ5. (B) Risultati simili sono stati osservati in due cellule primarie testate: murino macrofagi del midollo osseo (BMM) e macrofagi reni pesci rossi primaria (PKM). L'incorporazione di 50 mg / ml RNasi A in fase di specifici all'interno della procedura di colorazione rimuove non nucleari colorazione PI e aumenta in modo significativo il grado di somiglianza rispetto alla DRAQ5 colorazione. (C) immagini Rappresentante dei macrofagi renali primari mostrano il grado di somiglianza per celle con e senza trattamento RNAsi. Per facilitare la determinazione visiva delle differenze tra i trattamenti, DRAQ5 è stata data una verde. Aree giallo raffigurano colocalizzazione tra BrdU e DRAQ5 e PI e DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Modificato annessina V / PI riduce significativamente l'apoptosi false / eventi necrotico. Macrofagi primari reni pesci rossi (PKM) sono state colorate con convenzionali e modificato annessina V / PI protocolli. Scatterplot raffigurano l'annessina V / PI macchia in PKM pesci rossi. La dispersione a sinistra mostra convenzionale annessina V / PI colorazione (non RNasi) di cellule PKM. La dispersione a destra mostra PKM cellule colorate con il annessina V modificato / PI protocollo (con RNasi). L'aggiunta di risultati RNase in una marcata riduzione della colorazione PI a causa della rimozione di macchie di falsi positivi. PKM cellule sono state poi analizzate in base a distinte popolazioni all'interno delle culture e l'inizio progenitori (PE), monociti (Mono) e macrofagi maturi (Mat mac). La riduzione del numero di eventi PI positivo, dovuto alla rimozione del falso eventi positivi è più pronunciata nelle grandi cellule macrofagi maturi che in piccole cellule progenitrici presto. Conclusioni basate su protocolli convenzionali avrebbe erroneamente suggerito una correlazione positiva con la morte cellulare per i sottoinsiemi dei macrofagi più maturi.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;annessina V / PI protocollo qui presentato è una versione modificata di protocolli convenzionali e tiene conto della presenza di RNA nel citoplasma che ha anche affinità per PI. Introduzione di RNase A (50 mg / ml) a seguito di un passo di formaldeide 1% fissazione ritardo nella procedura di colorazione migliora sensibilmente la precisione di colorazione nucleare PI. Effetti negativi sono stati osservati in colorazione nucleare PI o membrana plasmatica annessina V colorazione. Senza RNAsi Un trattamento, fino al 40% dei risultati PI macchia può portare a falsi eventi positivi, che porta ad un impatto potenzialmente significativo e negativo sulle conclusioni a valle 10. La nostra modificato annessina V / PI protocollo di colorazione è semplice ed è stato utilizzato in modo efficace in un&#39;ampia gamma di tipi di cellule (cellule primarie: murino macrofagi del midollo osseo e splenociti; suina cellule residenti del polmone, i macrofagi alveolari dei polmoni, isola dei linfonodi mesenterici, leucociti del sangue periferico , splenociti; cellule Blastoderm pollo; macrofagi reni pesci rossi primaria; leucociti del sangue periferico carpa; linee cellulari: RAW 264,7 macrofagi, le cellule T Jurkat, suina 3D4/31 macrofagi, CCL-71 fibroblasti pinna pesce rosso, pesce gatto 3B11 cellule B 10). E &#39;importante notare che le cellule sono colpite in modo differenziato da falsi colorazione PI positivo, con pile in genere hanno un maggior numero di falsi eventi positivi 10. La colorazione falsa PI differenze positive tra queste popolazioni cellulari può essere parzialmente attribuito a differenze di dimensioni delle cellule, ma può anche derivare da differenze nel contenuto di RNA. Come tale, l&#39;incorporazione di questa procedura è particolarmente rilevante per i sistemi sperimentali che utilizzano, tra gli altri, cellule che subiscono lo stress genotossico, cellule trattate con farmaci arresto del ciclo cellulare come la timidina o idrossiurea, cellule infettate infettati, e gli studi sulle cellule embrionali in cui la progressione evolutiva è caratterizzato da variazioni discrete cellulari sintesi dell&#39;RNA.

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x Buffer di legame per Annexina V</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Annexina V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formaldeide al 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A da pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td>Diluire 1:60 in 1 x PBS-/-</td></tr></tbody></table>

modificato annessina v / propidio ioduro apoptosis analisi di valutazione accurata di morte cellulare

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studi di apoptosi cellulare sono stati significativamente influenzati dall&#39;introduzione della citometria a flusso basato su metodi. Ioduro di propidio (PI) è ampiamente utilizzato in combinazione con annessina V per determinare se le cellule sono vitali, apoptotiche o necrotiche attraverso differenze di integrità della membrana plasmatica e 1,2 permeabilità. Il V / PI annessina protocollo è un metodo comunemente usato per lo studio delle cellule apoptotiche 3. PI è usato più spesso di altre macchie nucleare perché è economica, stabile e un buon indicatore della vitalità cellulare, basato sulla sua capacità di escludere la tintura in cellule viventi 4,5. La capacità di PI di inserire una cella dipende dalla permeabilità della membrana; PI non macchia cellule apoptotiche dal vivo o inizio a causa della presenza di una membrana plasmatica intatto 1,2,6. Alla fine di cellule apoptotiche e necrotiche, l&#39;integrità delle membrane plasmatiche e nucleari diminuisce 7,8, permettendo PI di passare attraverso le membrane, intercalate in acidi nucleici, e visualizzare fluorescenza rossa 1,2,9. Purtroppo, ci accorgiamo che convenzionale annessina V / PI protocolli di portare ad un significativo numero di falsi eventi positivi (fino al 40%), che sono associati con colorazione PI di RNA all&#39;interno del compartimento citoplasmatico 10. Cellule primarie e linee cellulari in una vasta gamma di modelli animali sono colpiti, con celle di grandi dimensioni (nucleare: i rapporti citoplasmatica &lt;0,5) che mostra la più alta presenza 10. Qui, si dimostra una versione modificata annessina V / PI metodo che fornisce un significativo miglioramento per la valutazione della morte cellulare rispetto ai metodi tradizionali. Questo protocollo si avvale delle variazioni di permeabilità cellulare durante la divisione cellulare di fissaggio per promuovere ingresso di RNase A nelle cellule dopo la colorazione. Sia i tempi e la concentrazione di RNase A sono state ottimizzate per la rimozione di RNA citoplasmatici. Il risultato è un miglioramento significativo rispetto ai tradizionali annessina V / PI protocolli (&lt;5% di eventi con colorazione citoplasmatica PI).

Un metodo accurato per la valutazione della morte cellulare è descritto. Il protocollo migliora convenzionale annessina V / propidio ioduro (PI), i protocolli, che mostra fino al 40% di falsi positivi eventi in linee cellulari e cellule primarie da una vasta gamma di modelli animali.

Modificato annessina V / propidio ioduro Apoptosis analisi di valutazione accurata di morte cellulare

Gli studi sull'apoptosi cellulare hanno subito un impatto significativo a partire dall'introduzione dei metodi basati sulla citometria a flusso. Lo ioduro di propidio (PI) è ampiamente...

L'obiettivo generale dell'esperimento è superare i problemi attuali associati alle tecniche convenzionali di colorazione con Annexin five e Propidium iodide per la valutazione della morte cellulare per apoptosi e/o necrosi. Abbiamo scoperto che gli approcci convenzionali di colorazione su un'ampia gamma di linee cellulari e cellule primarie producono fino al 40% di eventi falsi positivi. Questi eventi falsi positivi sono dovuti alla colorazione dell'RNA citoplasmatico.Al contrario, il nostro protocollo riduce drasticamente il numero di falsi positivi introducendo fasi di fissazione e degradazione dell'RNA in specifici stadi della procedura di colorazione. Inizialmente, le cellule vengono colorate con X in five e ioduro di propidio per rilevare la morte cellulare secondo procedure convenzionali. Successivamente, le cellule vengono fissate con formaldeide al 1%, che aumenta la permeabilità della membrana plasmatica. Infine, le cellule fissate vengono trattate con RNAsa al fine di degradare l'RNA citoplasmatico, eliminando così la colorazione con ioduro di propidio responsabile dei falsi positivi.Come molti biologi cellulari, abbiamo utilizzato metodi convenzionali di citometria a flusso con nexina V e ioduro di propidio per rilevare la morte cellulare apoptotica e necrotica. Purtroppo, abbiamo recentemente scoperto che questo metodo porta a un numero significativo di eventi falsi positivi, fino al 40%, in una serie di linee cellulari e cellule primarie. Questo metodo aggiornato supera tali limitazioni.Il nostro approccio sfrutta la fissazione delle cellule e la digestione dell'RNA in fasi specifiche della procedura per rimuovere in modo selettivo l'RNA citoplasmatico, la cui colorazione porta direttamente a questi eventi falsamente positivi. Raccogliere le cellule da analizzare per l'esperimento. In questo video, utilizziamo macrofagi grezzi come esempio. Centrifugare i campioni a 335 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, decantare il soprannatante e risospendere le cellule in due millilitri di 1 XPBS.Quindi lavare nuovamente le cellule nelle stesse condizioni. Questa volta, risospendere le cellule in un millilitro di buffer di legame 1X NX e cinque. Dopo la centrifugazione dei campioni e la decantazione del soprannatante, risospendere nuovamente le cellule in un volume finale di 100 microlitri di buffer di legame 1X NX e cinque.Aggiungere un Xin five a ogni campione cellulare seguendo le raccomandazioni del produttore. Ad esempio, in questo video, 2,5 µL di an Xin five zi vengono aggiunti a ogni tubo in polistirene con fondo rotondo. Incubare i tubi al buio per 15 minuti a temperatura ambiente.Quindi aggiungere 100 microlitri di un X NX in cinque di buffer di legame in ogni provetta di reazione. Ora dovrebbe esserci un volume di soluzione di circa 200 microlitri in ogni provetta. Successivamente, preparare una diluizione 1:10 di propidio ioduro o PI in un X NX in cinque di buffer di legame; aggiungere quattro microlitri di PI diluito in ogni provetta, ottenendo una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro di PI in ogni campione.Incubare i tubi al buio per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine del periodo di incubazione, lavare le cellule con 500 microlitri di buffer di legame 1x e x e 5 e centrifugare i campioni a 335 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi decantare il surnatante. Risospendere le cellule in altri 500 microlitri di buffer di legame 1X NX e 5 contenenti 500 microlitri di formaldeide al 2%.Per preparare una soluzione al 1% di formaldeide, mescolare i tubi con un leggero movimento rotatorio. Fissare i campioni sul ghiaccio per 10 minuti dopo la fissazione. Aggiungere un millilitro di PBS 1X a ciascun campione e mescolare delicatamente con un leggero movimento rotatorio; centrifugare le cellule a 425 ×g per otto minuti a quattro gradi Celsius, ripetendo il lavaggio per tre volte.Preparare una diluizione da uno a 100 di RNA A in 1x PBS, risospendere il pellet agitando delicatamente i tubi e aggiungere 16 microlitri della soluzione di RNA A diluita per ottenere una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Incubare quindi i campioni per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare le cellule con un millilitro di 1x PBS e mescolare delicatamente agitando i tubi, quindi centrifugare i tubi a 425 ×g per otto minuti a quattro gradi Celsius.I campioni sono ora pronti per essere analizzati. In alternativa, i campioni possono essere utilizzati per passaggi successivi di colorazione se la colorazione N-X-M-P-I viene eseguita in parallelo con altre procedure. Le immagini rappresentative ottenute con il citometro a flusso a flusso di immagini mostrano l'entità della colorazione falsamente positiva in tre popolazioni cellulari distinte.Una linea cellulare comunemente utilizzata comprende macrofagi grezzi e due linee cellulari primarie che rispecchiano rispettivamente i macrofagi del midollo osseo e i macrofagi primari del rene del pesce rosso. L'uso di macrofagi primari del pesce rosso evidenzia l'applicabilità di questa tecnica su una varietà di piattaforme cellulari. Gli eventi veri positivi mostrano la prevista codistribuzione all'interno del compartimento nucleare tra PI e drac.Cinque, un colorante altamente permeabile alle membrane che colora con precisione il compartimento nucleare di cellule vive e morte, come dimostrato dalla colorazione gialla. Qui, l'accuratezza della colorazione nucleare con PI è stata valutata in base al grado di somiglianza con D dr five BRDU seven A.A D DPI, e DRAC five ha mostrato una somiglianza superiore al 99% nella capacità di colorare con precisione il nucleo nella linea cellulare di macrofagi raw 2 64 0.7. Al contrario, la colorazione citoplasmatica di PI che si verifica utilizzando protocolli convenzionali ha portato a una marcata riduzione della percentuale di somiglianza della colorazione nucleare rispetto a d dr five.In questa figura, si può osservare che l'incorporazione di 50 microgrammi per millilitro di RNAse A elimina la colorazione con PI non nucleare e aumenta significativamente il grado di somiglianza rispetto alla colorazione con d dr cinque in cellule di macrofagi del midollo osseo murino, macrofagi primari del rene di pesce rosso. Le immagini rappresentative dei macrofagi primari del rene mostrano la perdita della colorazione per l'RNA nel compartimento citoplasmatico dopo il trattamento con RNAse A. Questi grafici a dispersione di macrofagi primari del rene di pesce rosso mostrano una riduzione significativa degli eventi apoptotici/necrotici falsi nelle cellule preparate con il protocollo modificato di Nexin PI.Il nuovo protocollo mostra che l'84,9% delle cellule è vitale. I gate sono stati impostati in base a campioni paralleli di image stream che valutano caratteristiche fluorescenti e morfologiche. In un esempio, progenitori precoci, monociti e macrofagi maturi sono stati colorati mediante il metodo NX modificato nel protocollo PI in cinque passaggi descritto in questo video, oppure con il metodo convenzionale; per questa figura, le cellule colorate con il protocollo modificato hanno mostrato una riduzione visiva del numero di eventi PI positivi, dovuta all'eliminazione degli eventi falsi positivi tramite il trattamento con RNAsi.Inoltre, questo effetto era più pronunciato nelle grandi cellule macrofagiche mature rispetto alle cellule progenitrici più piccole ed immature. Conclusioni basate su protocolli convenzionali avrebbero erroneamente suggerito una correlazione positiva tra morte cellulare e i sottoinsiemi di macrofagi più maturi. Dopo questa procedura di colorazione, è possibile eseguire ulteriori passaggi, come la colorazione intracellulare o di superficie, per rispondere a domande specifiche riguardanti le sottopopolazioni presenti nel tuo isolato cellulare. L'importanza di questa tecnica va oltre le domande legate all'immunità; ad esempio, è rilevante anche in sistemi sperimentali che utilizzano cellule sottoposte a stress genotossico, cellule trattate con arresto del ciclo cellulare, farmaci come la timidina o l'idrossiurea, e studi su cellule embrionali in cui il progresso dello sviluppo è caratterizzato da cambiamenti discreti nella sintesi dell'RNA cellulare.

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Live-cell imaging di caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti colture cellulari usando...

Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Questo video dimostra un metodo di colorazione nucleare per rilevare l'effetto citotossico del mitocan su cellule tumorali sensibili ai farmaci e varianti sane. La doppia colorazione con coloranti leganti il DNA come lo ioduro di propidio e il colorante di Hoechst fornisce una chiara distinzione tra le cellule morte e quelle vive, aiutando così a valutare la citotossicità del farmaco.

Saggio di colorazione nucleare differenziale: un test per determinare la citotossicità del mitocan mediante ioduro di propidio e doppia colorazione di Hoechst

In questo video, dimostriamo il test di legame dell'annessina V per misurare il grado di eriptosi, la morte cellulare programmata degli eritrociti, utilizzando la colorazione fluorescente con annessina V. Gli eritrociti apoptotici dimostrano la traslocazione della fosfatidilserina dal lembo interno a quello esterno della membrana cellulare, facendo sì che l'annessina V marcata con fluoroforo si leghi alla fosfatidilserina traslocata, emettendo così un segnale fluorescente.

Saggio di legame dell'annessina V: una tecnica basata sulla fluorescenza per identificare gli eritrociti apoptotici tramite marcatura della fosfatidilserina

Composti terapeutici sono spesso prima esaminate in vitro con saggi di vitalità. Conta delle cellule cieche da un osservatore umano può essere molto sensibile alle piccole variazioni di numero di cellulare, ma non valutare la funzione. Test di vitalità computerizzati, come qui descritto, in grado di valutare sia la struttura e la funzione in modo obiettivo.

I saggi di redditività per le cellule in coltura

Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Un flusso di lavoro utilizzando una centrifuga di flusso cytometry o differenziale è stato sviluppato per individuare, quantificare e isolare i corpi apoptotici da un campione di apoptotic di elevata purezza.

Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza

Il protocollo descrive un saggio rapido, ad alta produttività, affidabile, economico e imparziale per determinare in modo efficiente la vitalità cellulare. Questo saggio è particolarmente utile quando i mitocondri delle cellule sono stati danneggiati, il che interferisce con altri saggi. Il saggio utilizza il conteggio automatizzato delle celle macchiate con due coloranti nucleari: Hoechst 33342 e propidium ioduro.

Un saggio di colorazione nucleare differenziale automatizzato per una determinazione accurata della citotossicità mitocana

L'apoptosi può essere caratterizzata dall'analisi citometrica a flusso di biomarcatori apoptotici precoci e tardivi. La linea cellulare del cancro cervicale, SiHa, è stata analizzata per i biomarcatori dell'apoptosi dopo il trattamento con actinomicina D utilizzando un citometro a flusso da banco.

Analisi citometrica a flusso di biomarcatori apoptotici in cellule di cancro cervicale SiHa trattate con attinomicina D

Pirosequenziamento (R) è uno dei metodi più approfondita ma semplice fino ad oggi utilizzato per analizzare polimorfismi. Questo metodo ha portato a un rapido ed efficiente a singolo nucleotide valutazione polimorfismo tra cui molti polimorfismi clinicamente rilevanti. La tecnica e la metodologia della Pyrosequencing è spiegato.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Scopri un protocollo ottimizzato per valutare l'apoptosi cellulare con Annexin V/PI che riduce i falsi positivi fino al 40%. Questo metodo utilizza fissazione e degradazione dell'RNA per migliorare l'accuratezza nella citometria a flusso.

Modificato annessina V / propidio ioduro Apoptosis analisi di valutazione accurata di morte cellulare

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