Modificato annessina V / propidio ioduro Apoptosis analisi di valutazione accurata di morte cellulare

Un metodo accurato per la valutazione della morte cellulare è descritto. Il protocollo migliora convenzionale annessina V / propidio ioduro (PI), i protocolli, che mostra fino al 40% di falsi positivi eventi in linee cellulari e cellule primarie da una vasta gamma di modelli animali.

L'obiettivo generale dell'esperimento è quello di superare gli attuali problemi con le tecniche convenzionali di colorazione con annessina cinque e ioduro di propidio per la valutazione della morte cellulare per apoptosi e/o necrosi. Abbiamo scoperto che gli approcci convenzionali di colorazione di un'ampia gamma di linee cellulari e cellule primarie producono fino al 40% di eventi falsi positivi. Questi eventi falsi positivi sono dovuti alla colorazione dell'RNA citoplasmatico.

Al contrario, il nostro protocollo riduce drasticamente il numero di incidenze di falsi positivi introducendo fasi di fissazione e degradazione dell'RNA in fasi specifiche Nella procedura di colorazione, le prime cellule vengono colorate con una X su cinque e con ioduro di peridio per rilevare la morte cellulare secondo le procedure convenzionali. Successivamente, le cellule vengono fissate con l'1% di formaldeide, che aumenta la permeabilità della membrana plasmatica. Infine, le cellule fissate vengono trattate con RNA A al fine di degradare l'RNA citoplasmatico, eliminando i falsi positivi che causano la colorazione dello ioduro di propidio.

Come molti biologi cellulari, abbiamo utilizzato metodi convenzionali di citometria a flusso di nexina cinque e ioduro di propidio per rilevare la morte cellulare apoptotica e necrotica. Purtroppo, abbiamo recentemente scoperto che questo metodo porta a un numero significativo di eventi falsi positivi, fino al 40%, in una serie di linee cellulari e cellule primarie. Questo metodo aggiornato supera questi avvertimenti.

Il nostro approccio sfrutta la fissazione cellulare e la digestione dell'RNA in fasi specifiche durante la procedura per rimuovere selettivamente l'RNA plasmico cyop, la colorazione che porta direttamente a questi eventi falsi positivi, raccogliendo le cellule da analizzare per l'esperimento. In questo video, utilizziamo macrofagi grezzi. Ad esempio, centrifugare i campioni a 335 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius, decantare il surnatante e risospendere le cellule in due millilitri di XPBS.

Quindi lavare nuovamente le celle nelle stesse condizioni. Questa volta, resus sospendendo le cellule in un millilitro di un X NX e cinque tampone di legame. Dopo aver centrifugato i campioni e decantato il surnatante, risospendere nuovamente le cellule in un volume finale di 100 microlitri di un tampone legante X NX Xin five.

Aggiungere un Xin cinque a ciascun campione di cella secondo le raccomandazioni del produttore. Ad esempio, in questo video, 2,5 microlitri di Xin five zi vengono aggiunti a ciascun tubo a fondo tondo in polistirene. Incubare le provette al buio per 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere 100 microlitri di un X NX in cinque tampone legante a ciascuna provetta di reazione. Ora dovrebbero esserci circa 200 microlitri di soluzione in ogni provetta. Successivamente, preparare una diluizione da uno a 10 di propidio, ioduro o PI in un X NX.In cinque tamponi leganti, aggiungere quattro microlitri di PI diluito a ciascuna provetta, ottenendo una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro pi greco in ciascun campione.

Incubare nuovamente le provette al buio per 15 minuti a temperatura ambiente. Trascorso questo periodo di incubazione, lavare le cellule con 500 microlitri di un tampone legante x e x e cinque e centrifugare i campioni a 335 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius e decantare lo snat. Risospendere le cellule in altri 500 microlitri di un X NX e cinque tampone legante con 500 microlitri di formaldeide al 2%.

Per creare una soluzione di formaldeide all'1%, mescolare i tubi con un leggero colpo. Fissare i campioni sul ghiaccio per 10 minuti dopo il fissaggio. Aggiungere un millilitro di XPBS a ciascun campione e mescolare delicatamente centrifugando le celle a 425 Gs per otto minuti a quattro gradi Celsius tre volte durante il lavaggio.

Preparare una diluizione da uno a 100 di RNA A in un XPBS, risospendere il pellet muovendo le provette e aggiungere 16 microlitri di RNA diluiti, una soluzione per ottenere una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Quindi incubare i campioni per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, lavare le celle in un millilitro di XPBS e mescolare delicatamente mescolando, quindi centrifugare le provette a 425 GS per otto minuti a quattro gradi Celsius.

I campioni sono ora pronti per essere analizzati. In alternativa, i campioni possono essere utilizzati per le successive fasi di colorazione se la colorazione N-X-M-P-I viene eseguita in parallelo con altre procedure. Le immagini rappresentative del citometro a flusso mostrano l'entità della colorazione dei falsi positivi in tre popolazioni cellulari uniche.

Una linea cellulare comunemente usata macrofagi grezzi e due linee cellulari primarie che rispecchiano i macrofagi del midollo osseo e i macrofagi primari del rene dei pesci rossi. L'uso di macrofagi primari di pesci rossi evidenzia l'applicabilità di questa tecnica su una varietà di piattaforme cellulari. Gli eventi veri positivi mostrano la colocalizzazione attesa all'interno del compartimento nucleare tra PI e drac.

Five, un colorante altamente permeabile alla membrana che colora accuratamente il compartimento nucleare delle cellule vive e morte, come evidenziato dalla colorazione gialla. Qui, l'accuratezza della colorazione nucleare PI è stata valutata in base al suo grado di somiglianza con D, dr cinque, BRDU, sette, A.A, DPI, DPI, e DRAC cinque, ha mostrato una somiglianza superiore al 99% nella loro capacità di colorare accuratamente il nucleo nella linea cellulare di macrofagi grezza 2, 64, 0,7. Al contrario, la colorazione PI citoplasmatica che si verifica quando si utilizzano protocolli convenzionali ha portato a una marcata diminuzione della somiglianza percentuale della colorazione nucleare rispetto a d dr cinque.

In questa figura, si può vedere che l'incorporazione di 50 microgrammi per millilitro di RNA A rimuove la colorazione PI non nucleare e aumenta significativamente il grado di somiglianza rispetto alla colorazione d dr cinque nelle cellule macrofagiche primarie del rene murn, del midollo osseo e del rene rosso. Le immagini rappresentative dei macrofagi renali primari in questa figura mostrano la perdita di colorazione dell'RNA nel compartimento citoplasmatico con il trattamento di RN a. Questi grafici a dispersione dei macrofagi renali primari dei pesci rossi mostrano una significativa riduzione dei falsi eventi necrotici apoptotici nelle cellule preparate con il protocollo PI nexina modificato.

Il nuovo protocollo mostra che l'84,9% delle cellule è vitale. I gate sono stati disegnati sulla base di campioni di flussi di immagini paralleli che valutano le caratteristiche fluorescenti e morfologiche. In un esempio, i monociti progenitori precoci e i macrofagi maturi sono stati colorati con il protocollo NX modificato in cinque PI descritto in questo video, o con il metodo convenzionale per questa figura, le cellule colorate con il protocollo modificato hanno mostrato una riduzione visiva del numero di eventi PI positivi a causa della rimozione di eventi falsi positivi da parte del trattamento con RNA.

Inoltre, questo effetto era più pronunciato nelle grandi cellule macrofagiche mature rispetto alle cellule progenitrici precoci più piccole. Le conclusioni basate sui protocolli convenzionali avrebbero erroneamente suggerito una correlazione positiva nella morte cellulare per i sottogruppi di macrofagi più maturi Dopo questa procedura di colorazione, è possibile eseguire ulteriori passaggi come la colorazione intracellulare o superficiale per rispondere a domande specifiche sulle sottopopolazioni all'interno dell'isolato cellulare. La rilevanza di questa tecnica va oltre le questioni basate sull'immunità, ad esempio, è rilevante anche per i sistemi sperimentali che utilizzano cellule sottoposte a stress genotossico, cellule trattate con arresto del ciclo cellulare, farmaci come la timidina o l'idrossiurea e studi su cellule embrionali in cui la progressione dello sviluppo è caratterizzata da cambiamenti discreti nella sintesi cellulare dell'RNA.