Name: Imaging bioluminescenza per la valutazione delle risposte immunitarie A seguito di impianto di tessuto cardiaco Composti (EHT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri l'imaging bioluminescente in vivo per valutare le risposte immunitarie dopo l'impianto di tessuto cardiaco ingegnerizzato (EHT) nei ratti. Questo metodo non invasivo consente il monitoraggio longitudinale della sopravvivenza del trapianto.

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Sonja Schrepfer, Lenard Conradi e Arne Hansen ha ricevuto un finanziamento dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1). Il lavoro è stato sostenuto anche da finanziamenti dell&#39;Unione europea di Thomas Eschenhagen (EUGeneHeart e Angioscaff).

1. EHT Generation e la cultura Condizioni Fabbricazione di prodotti a base di fibrina EHT è stata eseguita come descritto altrove 4. In breve, per generare fibrina basato EHT per scopi impianto, una master mix è stato preparato contenente cellule isolate da neonatale ROSA / luciferasi-LEW cuori di ratto transgenico, fibrinogeno bovina e Matrigel. Agarosio stampi sono stati preparati con distanziali in teflon posto in ben 6 piatti della cultura. Dopo la solidificazione di agarosio, distanziatori sono stati rimossi e rastrelliere messaggio silicone sono stati messi sui piatti della cultura con messaggi raggiungendo negli stampi. Per generare EHT, il Mastermix fu brevemente mescolato con un importo calcolato della trombina e pipettati nello stampo. Dopo la polimerizzazione del fibrinogeno, rack in silicone con EHTs aderendo alla posti sono stati delicatamente rimossi dalla stampi l'agarosio, trasferito al nuovo cambio a 6 e piatti di coltura cellulare e mantenuto a 37 ° C, 7% di CO 2 colture cellulari incubatore usando su misura terreno di coltura delle cellule. EHT sono stati tenuti in condizioni di coltura delle cellule fino a dieci giorni. Durante questo lasso di tempo, neonatale cellule del cuore di ratto cominciò a forma allungata, di interconnessione e allineare lungo linee di forza tra i messaggi di silicone. Al momento dell'impianto, spontanea coerente contrazioni sono state osservate, deviando i messaggi di silicone. 2. EHT impianto EHT impianto è stato eseguito in entrambi i immunocompetenti Brown Norway (BN), ratti o topi immunodeficienti nudo per studiare la risposta immunitaria allogenico. Ratti BN e nudo peso di 100 - 150 g sono stati acquistati dalla Charles River Germania (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) e alloggiati in condizioni convenzionali, alimentati standard di ratto chow e libidum ad acqua. Topi immunodeficienti sono ospitati, in camera sterile, gabbie, e viene utilizzata acqua sterilizzata. Il comitato etico tedesco ha esaminato e approvato le procedure animali. Tutti gli strumenti chirurgici vengono sterilizzati prima dell'uso. La procedura di impianto vengono effettuate come segue: Rat sono anesthesized con isoflurano (2,5-3%) con una camera di induzione. L'esposizione umana a isoflurano può essere ridotto di lavoro in una tabella rovesciati o non ricircolo cappuccio. La temperatura corporea è mantenuta durante la procedura chirurgica. <ol><li> Shave zona addominale e applicare una pomata oculare per evitare che gli occhi si secchi durante l'anestesia. </li><li> Posizionare il topo sul dorso e posto una maschera sul suo naso e la bocca per mantenere l'anestesia. </li><li> Disinfettare la zona addominale con Betadine e poi a 80% di etanolo. Tampone pulito da sporcare, dal centro dell'area rasata in movimento verso l'esterno verso l'area dai capelli. </li><li> Controllare riflessi pizzicare i piedi posteriori per essere sicuri che il topo è sufficientemente anestetizzati. </li><li> Drape l'animale ed effettuare una incisione addominale mediana che separa la pelle ei muscoli in due fasi per aprire l'addome. Sterilizzazione a caldo tallone viene utilizzato tra la pelle e l'apertura del muscolo. </li><li> Posto l'intestino in un guanto salina riscaldata idratata in polvere libera. Piegare il guanto intorno l'intestino per prevenire la perdita di umidità. </li><li> Rimuovere il tessuto adiposo ed esporre la milza. </li><li> Visualizzare e maggiore diffusione omento con una pinza. </li><li> Accuratamente tagliato EHT di sospendere i messaggi in silicone e di trasferimento nel omento maggiore. </li><li> Avvolgere maggiore è la omentus intorno al EHT e fissare con due singoli 7-0 suture prolene (Ethicon, Norderstedt) </li><li> Avanti spostare l'intestino nuovamente dentro l'addome. </li><li> Lavare l'addome preriscaldata con soluzione salina sterile. </li><li> Chiudere lo strato muscolare della parete addominale con suture 6-0 prolene esecuzione (Ethicon, Norderstedt, Germania). </li><li> Utilizzare 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt) in esecuzione suture per chiudere la pelle. </li><li> Mentre il topo è ancora in anestesia, iniettare 5 mg / kg per via sottocutanea Carprofen. </li><li> Per fornire l'analgesia sufficiente per questo tipo di procedura, un analgesico (come Metamizol) viene aggiunto all'acqua potabile (50 mg Metamizol per 100 ml) per farmaci antidolorifici per 3 giorni post-trapianto. </li></ol> 3. Imaging bioluminescenza di EHT impianto seguito La piattaforma di bioimmagini IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA) è usato per imaging non invasiva bioluminescenza in vivo ei risultati sono analizzati utilizzando l'immagine vivente IVIS (Xenogen), pacchetto software. Imaging viene effettuata ogni giorno dalle 2 ore dopo l'intervento. Anestetizzare ratto con isoflurano (2,5 - 3%) con una camera di induzione. <ol><li> Disinfettare la zona addominale e toracica utilizzando ampiamente Provo-Iodio, utilizzare prossimi 80% di etanolo, ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Iniettare d-Luciferin (Xenogen; 375 mg / kg di peso corporeo) ip </li><li> Luogo in topi anestetizzati l'imaging IVIS camera (fino a 4 ratti possono essere analizzati allo stesso tempo). </li><li> Valutare l'intensità del segnale di luc + cellule all'interno EHT in unità di fotoni / sec / cm 2 / steridianin la regione di interesse (ROI) al basale (120 minuti dopo l'impianto) e nei giorni 1, 2, 3, 5, 7, 10, e alle settimane 2, 3 e 4. Si noti il ​​picco del segnale (sembra circa 20 minuti dopo il d-Luciferin iniezione). </li></ol> Creare un grafico (Excel) che mostra l'intensità del segnale nel tempo. 4. Correlazione dei risultati BLI e ELISPOT Le risposte immunitarie cellulari in-vivo in BN immunocompetenti e immunodeficienti topi nudi sono stati studiati dopo EHT trapianto. La milza di animali destinatario è stato raccolto 5 giorni dopo il trapianto EHT di isolare splenociti destinatario. ELISPOT con mitomicina-inibito EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) come stimolatore e 5 x10 6 splenociti destinatario come cellule responder sono stati eseguiti secondo il protocollo del produttore (BD Biosciences) con IFN-γ e IL-4 rivestiti piastre di indagare TH1-, e la risposta TH2, rispettivamente. IFN-γ e IL-4 punti erano significativamente più alti nel immunocompetenti, modello rispetto al modello immunodeficienti (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; Student t-test). 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Correlazione dei risultati BLI e ELISPOT a) Il cellulare in vivo delle risposte immunitarie in immunocompetenti Brown Norvegia e topi immunodeficienti nudi sono stati studiati dopo l'impianto EHT. Splenociti destinatario sono state raccolte 5 giorni dopo l'impianto EHT. IFN? e IL-4 l'espressione è stata valutata mediante ELISPOT mitomicina inibito EHT come stimolatori e 5x106 splenociti destinatario come cellule responder. Risposte Th1 e Th2 sono risultati significativamente più elevati nel modello immunocompetenti rispetto al modello immunodeficienti come evidenziato da IFNγ e IL-4 produzione rispettivamente. b) Luc EHTs + sono state trapiantate in maggiore è la omentus delle due ratti BN immunocompetenti o immunodeficienti topi nudi. Sopravvivenza delle cellule in senso longitudinale è stata seguita da BLI. La percentuale di animali che ha respinto il EHTs trapiantato è presentato. Tutti i ratti BN rapidamente respinto l'trapianti EHT, mentre le cellule sopravvissute nei topi cellule T carente.

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Prima applicazione clinica della tecnologia EHT per la riparazione cardiaca, questioni fondamentali come l&#39;immunogenicità di entrambi i componenti cellulari e la matrice o la sopravvivenza del trapianto dopo l&#39;impianto devono essere valutati in modelli sperimentali. In-vivo di imaging bioluminescenza rappresenta una tecnica nuova e utile per la sopravvivenza delle cellule di monitoraggio dopo il trapianto . Siamo riusciti a base di fibrina generato EHT contenente luciferasi positivo (luc +) le cellule d...

<ul><li> LEW-Tg (Gt (ROSA) 26Sor-luc) 11Jmsk ratti (numero ratto NBPR 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) </li><li> Fibrinogeno bovina (soluzione madre: 200 mg / ml aprotinina, più 5 mcg / ml fibrinogeno in NaCl 0,9%, Sigma F4753) </li><li> Matrigel (BD Bioscience 356235) </li><li> DMEM (Biochrome F0415) </li><li> Siero di cavallo (Gibco 26050) </li><li> Penicillina / streptomicina (Gibco 15140) </li><li> Insulina (Sigma-Aldrich I9278) </li><li> Aprotinina (Sigma Aldrich A1153) </li><li> d-Luciferin (Biosynth L-8220) </li><li> Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) piastre di test (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99) </li></ul>

imaging bioluminescenza per la valutazione delle risposte immunitarie a seguito di impianto di tessuto cardiaco composti (eht)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Varie tecniche di ingegneria tissutale cardiaco sono stati perseguiti negli ultimi decenni anche le strategie di impalcature utilizzando nativi o bioartificiale materiali patibolo, intrappolamento dei miociti cardiaci in idrogel come la fibrina o collagene e di sovrapposizione dei monostrati miociti 1. Questi concetti mirano al recupero della compromissione della funzione cardiaca (ad esempio dopo infarto miocardico) o come modelli sperimentali (es. tossicologia predittiva e screening sostanza o modelli di malattia). Monitoraggio preciso della sopravvivenza cellulare dopo l&#39;impianto del tessuto cardiaco ingegnerizzati (EHT) è ora diventato possibile usare in vivo bioluminescenza imaging (BLI) Tecniche 2. Qui si descrive la generazione di fibrina a base di EHT da un ceppo di topo transgenico con espressione ubiquitaria luciferasi di lucciola (ROSA / luciferasi-LEW Tg, 3). L&#39;impianto viene eseguito nel omento maggiore di ceppi di topo diversi per valutare le risposte immunitarie dell&#39;organismo ricevente dopo l&#39;impianto EHT. Confronto dei risultati generati dal BLI e la Enzyme Linked Immuno Tecnica Spot (ELISPOT) confermano l&#39;utilizzabilità del BLI per la valutazione delle risposte immunitarie.

Questo video dimostra l&#39;uso di<em&gt; In vivo</em&gt; Immagini bioluminescenza per studiare le risposte immunitarie dopo l&#39;impianto di tessuto cardiaco Composti (EHT) nei ratti.

Imaging bioluminescenza per la valutazione delle risposte immunitarie A seguito di impianto di tessuto cardiaco Composti (EHT)

Negli ultimi decenni sono state perseguite diverse tecniche di ingegneria del tessuto cardiaco, incluse strategie di scaffolding che utilizzano supporti sia nativi che...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare l'imaging bioluminescente in vivo per studiare le risposte immunitarie dopo l'impianto di tessuto cardiaco ingegnerizzato o EHT in ratti. Questo viene ottenuto innanzitutto generando EHS positivi per la luciferasi. Successivamente, gli EHS che esprimono stabilmente la luciferasi vengono trapiantati nel grande omento dei ratti riceventi.Successivamente, è possibile eseguire un'analisi di imaging bioluminescente in vivo sugli animali riceventi per monitorare in modo non invasivo la sopravvivenza e il rigetto dell'EHT nel tempo. Utilizzando questo modello, l'intensità e la cinetica del rigetto acuto, ad esempio, possono essere correlate alla riduzione dell'intensità del segnale bioluminescente osservato nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'istologia, è che misurazioni giornaliere consentono una valutazione non invasiva e longitudinale della sopravvivenza del trapianto.Questo metodo può fornire informazioni sulla sopravvivenza e sul rigetto dei tessuti cardiaci ingegnerizzati, ma può anche essere applicato ad altre domande di ricerca. Ad esempio, il metabolismo di ehs. La tecnica bili sarà dimostrata da Christiana Parman, che esegue questa tecnica quotidianamente.Nel mio laboratorio, le cellule cardiache transgeniche vengono inizialmente isolate da ratti neonati transgenici Luciferase Lu per generare DHT a base di fibrina ai fini dell'innesto; preparare un mix maestro contenente cellule isolate da cuori di ratti transgenici neonati Luciferase Lu, fibrinogeno bovino e matrigel in X-D-M-E-M e NKM. Preparare stampi in aros aggiungendo nove millilitri di aros al 2% in PBS in ogni pozzetto di piastre da coltura a sei pozzetti, quindi inserendo distanziatori in teflon nei pozzetti. Dopo che l'aros si è solidificato, rimuovere i distanziatori e posizionare delle rastrelliere in silicone con perni sulle piastre da coltura, facendo sì che i perni penetrino negli stampi.Per generare EHT, mescolare delicatamente il master mix, quindi aggiungere una quantità calcolata di trombina nel master mix e mescolare brevemente. Successivamente, pipettare rapidamente 1100 microlitri di master mix in ciascuno stampo. Dopo la polimerizzazione del fibrinogeno, rimuovere delicatamente le staffe con i perni sui quali si sono formati gli EHT aderenti dagli stampi in agarosio e trasferire le staffe in nuove piastre per colture cellulari a sei pozzetti contenenti otto millilitri di mezzo personalizzato per pozzetto.I cuori tessutali ingegnerizzati (EHT) vengono mantenuti per 10 giorni in un'incubatrice per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 7% di anidride carbonica. Il mezzo viene sostituito tre volte alla settimana. Durante questo periodo di coltura, le cellule cardiache di ratto neonato inizieranno ad allungarsi, a interconnettersi e ad allinearsi lungo le linee di forza tra i pali di silicone.Nel momento dell'impianto, si osserveranno contrazioni spontanee e coerenti. Sterilizzare gli strumenti per l'intervento chirurgico mediante autoclave prima dell'uso e riscaldare 30 millilitri di soluzione salina sterile. I ratti destinati all'impianto dovrebbero pesare tra 100 e 150 grammi e essere allevati in condizioni convenzionali, con cibo standard per ratti e acqua ad libitum.In questo video, vengono utilizzati ratti brown Norway dopo anestesia; sedare i ratti prima dell'intervento chirurgico e confermare la sedazione assicurandosi dell'assenza di risposta alla compressione delle dita dei piedi mentre il ratto è sotto anestesia. Iniettare cinque milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di carens per via sottocutanea nel fianco, rasare l'area addominale e applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccamento degli occhi dell'animale. Durante l'anestesia, disinfettare l'area addominale utilizzando Betadine, seguito da strofinamento con etanolo al 80% procedendo da pulito a sporco. Ripetere questa disinfezione.Eseguire tre passaggi, coprire l'animale ed effettuare un'incisione addominale mediana, separando cute e muscolo in due fasi per aprire l'addome. Utilizzare la sterilizzazione a perle calde sugli strumenti tra un taglio e l'altro. Inumidire un guanto senza polvere con soluzione fisiologica.Posizionare gli intestini all'interno del guanto. Piegare il guanto attorno agli intestini per prevenire la perdita di umidità. Allargare l'incisione ed esporre la milza.Identificare e distendere il maggior aponeurosi con pinzette. Tagliare con attenzione l'EHT dai supporti in silicone ai quali è sospeso e trasferirlo sul maggior aponeurosi. Avvolgere il maggior aponeurosi intorno all'EHT e fissarlo chiudendolo con due suture singole in polipropilene da sette-oh.Successivamente, riposizionare l'intestino all'interno dell'addome. Lavare l'addome con un millilitro di soluzione salina sterile preriscaldata. Chiudere lo strato muscolare della parete addominale utilizzando sei punti continui in prolene 6-0.Utilizzare cinque punti di sutura running in polipropilene per chiudere la cute, al fine di garantire un'adeguata analgesia per questo tipo di procedura. Somministrare 50 milligrammi ogni 100 millilitri di olio nell'acqua da bere per tre giorni dopo l'impianto. La piattaforma IVUS Bioimaging viene utilizzata per l’imaging bioluminescente non invasivo in vivo e i risultati vengono analizzati mediante il software IVUS Living Image.L'imaging del campione viene eseguito quotidianamente, a partire da due ore dopo l'intervento chirurgico. Prima di visualizzare la bioluminescenza del tessuto cardiaco ingegnerizzato (EHT), anestetizzare il ratto e confermare la sedazione mediante pinzatura del dito del piede. Disinfettare l'area addominale.Somministrare Lucifer inizialmente alla dose di 375 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo e posizionare il ratto anestetizzato nella camera di imaging ivu. È possibile analizzare fino a quattro ratti contemporaneamente. Utilizzare il software di imaging in tempo reale IVUS per osservare e registrare il segnale massimo, che appare circa 20 minuti dopo l'iniezione di Lucifer.Quindi stabilire l'intensità del segnale di base delle cellule positive per la luciferasi all'interno del tessuto cardiaco ingegnerizzato in unità di fotoni al secondo per centimetro quadrato per Ceridian nella regione di interesse, 120 minuti dopo l'innesto e ai giorni 1, 2, 3, 5, 7, 10 e alle settimane due, tre e quattro. I dati possono essere espressi in forma grafica, mostrando l'intensità del segnale nel tempo. Le risposte immunitarie cellulari in vivo in topi Brown Norway immunocompetenti e immunodeficienti.Dei ratti nudi sono stati studiati dopo il prelievo delle cellule SP del ricevente a cinque giorni dall'impianto dell'EHT. L'espressione di interferone, gamma e IL-4 è stata valutata mediante saggi lispa utilizzando l'EHT inibito con mitomicina come stimolatore e 5 × 10⁶ cellule del ricevente come cellule risponditrici. Le risposte TH1 e TH2 sono risultate significativamente più elevate nel modello immunocompetente rispetto al modello immunodeficiente, come dimostrato rispettivamente dalla produzione di interferone, gamma e IL-4.EHS positivi per la LUCIFERASI sono stati trapiantati nel grande omento di ratti PN immunocompetenti o di ratti nudi immunodeficienti. La sopravvivenza cellulare &egrave; stata monitorata longitudinalmente mediante imaging a bioluminescenza (BLI). &Egrave; riportata la percentuale di animali che hanno rigettato gli EHS trapiantati.Tutti i ratti BN hanno rigettato rapidamente i trapianti di EHT, mentre le cellule sono sopravvissute nei ratti carenti di linfociti T. Una volta acquisita padronanza, le chirurgie possono essere eseguite in pochi minuti se la tecnica viene eseguita correttamente dopo l'intervento. Altri metodi, come saggi immunologici e l'istologia, possono essere effettuati per rispondere ad altre domande riguardanti l'infiltrazione cellulare e la risposta umorale.

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