Name: Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Impara a ingegnerizzare innesti vascolari biologici utilizzando un bioreattore pulsatile con scaffold biodegradabili e cellule muscolari lisce. Questo metodo supporta la rigenerazione di vasi sanguigni per bypass arteriosi.

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Questo lavoro è finanziato dal National Institutes of Health di Grant R01-EB 008836 e R01 HL083895 (sia per LEN). Si potrebbe ringraziare Daryl Smith, il Vetraio Università, per rendere il bioreattori per la nostra ricerca.

Autoclave Assemblare e autoclave i tubi per il sistema di flusso e dei componenti bioreattore (bioreattore stesso e il coperchio tappo in silicone), come indicato in Figura 1 e Figura 2. Tubo di alimentazione ha un connettore maschio da un lato e una fine aperta sull'altro lato. Tre segmenti di tubo corto vengono inseriti attraverso un tappo in silicone per lo scambio di gas. 1. Cucire PGA Mesh <ol><li> Tagliare PGA mesh per 1,1 centimetri x ~ fogli da 8 cm (a seconda della dimensione bioreattore). </li><li> Tubi di silicone pulito (3 mm di diametro interno) con acqua distillata (dH20) e asciugare prima dell'uso. </li><li> Usa Dexon 6,0 sutura a cucire PGA mesh attorno al tubo di silicone pulito a partire da tre nodi chirurgica seguita da singoli punti di sutura. </li></ol> 2. PGA Ponteggi Trattamento delle superfici <ol><li> Dip ponteggi PGA in NaOH 1M per 1-2min e registrare il tempo di trattamento e l'uso stesso tempo per tutti i ponteggi PGA. </li><li> Sciacquare ponteggi PGA nei bagni dH2O per 2 minuti 3 volte. </li><li> Pat PGA ponteggi a secco con Kimwipes tra ogni tuffo nella dH O 2 bagni. </li><li> Secco PGA ponteggi sotto il cofano di coltura tissutale asciugare all'aria per 15 minuti con il ventilatore. </li></ol> 3. Braccia Dacron da cucire <ol><li> Usa Prolene sutura 4,0 a cucire piccoli pezzi di polsini Dacron (1 cm) su ogni estremità della rete PGA con una sovrapposizione di 2-3mm. Nota: non stare attento a forare tubi di silicone (Figura 3). </li><li> Utilizzare la sutura stessa a cucire tre punti verso la fine senza polsini Dacron. Assicurarsi di lasciare abbastanza suture alle estremità libera di sutura Prolene per la fase 5.1 (Figura 3). </li></ol> 4. Assemblea dei bioreattori (giorno prima dell'inizio della cultura bioreattore) <ol><li> Immergere maglia cucita e tubi in silicone, strumenti chirurgici, e un filo sottile in un bagno di etanolo al 70% per 20-30 minuti. </li><li> Aprire i sacchetti autoclave contenente il bioreattore e immergerlo in bagno etanolo al 70% per almeno 30 minuti prima del montaggio. Assicurarsi di lavare il bioreattore a fondo con l'etanolo. L'esposizione di tutti i componenti bioreattore al 70% di etanolo è un passo oltre la sterilizzazione. Questa operazione rimuove anche endotossina, che non viene rimosso in autoclave ed è nociva per le cellule vascolari. </li><li> Tirare tubo in silicone con bracci laterali con filo sottile di tirare fino in fondo. </li><li> Prendete bioreattore da bagno etanolo (tenere in rete sommersa in etanolo). Fissare il patibolo PGA all'interno del bioreattore serrando polsini Dacron sopra le labbra bicchiere svasato stringendo e legando le suture Prolene (Figura 3). </li><li> Collegare un lato di armi bianche bioreattore ai connettori tramite tubo in silicone. </li><li> Tirare dall'altra parte di tubo in silicone con tensione sufficiente e inserire i restanti due connettori in tubo in silicone. Mantenere il tubo in silicone strettamente quando si inseriscono i connettori! </li><li> Bioreattore reinserire in bagno a filo con etanolo e l'etanolo tirando delicatamente connettori fuori dei bracci laterali. </li><li> Capovolgere bioreattore più e consentono un ammollo per 10 minuti. </li><li> Bioreattore flip lato destro in alto e prendere per altri 10 minuti. </li><li> Scaricare tutto l'etanolo. </li><li> Creato tre grandi piatti di Petri (10 cm) in serie e bioreattori posto nel piatto centrale a tenere l'etanolo in eccesso gocciolava dalle estremità dei tubi. </li><li> Flush bioreattori e PGA rete con acqua di coltura con una pipetta da 5 ml o 10 ml. Anche a livello della cultura dell'acqua presente nei tessuti in tubo in silicone. </li><li> Accuratamente tutta l'acqua di scarico in eccesso in piastre Petri su entrambi i lati del bioreattore. </li><li> Bioreattore asciugare durante la notte in cappa con ventilatore acceso e spento UV. </li><li> Note aggiuntive: assicurarsi ancoretta sterile è in bioreattore. Fare attenzione a non "hover" sopra il bioreattore da questo punto in avanti, per evitare contaminazioni. Tagliare un sacco di strisce parafilm e ammollo in una piccola vasca etanolo al 70% (grandi Petri funziona bene). </li></ol> 5. Giorno 1: installazione Bioreattore <ol><li> Inserire una piastra di Petri sterile oltre all'apertura di ogni bioreattore per proteggere l'interno PGA patibolo da sostanze contaminanti. </li><li> Assemblare sistema a flusso di bioreattore come indicato in Figura 4 e parafilm tutti i giunti di collegamento. <ol><li> Pulire i connettori prima con cotone imbevuto di alcol. </li><li> Fissare porta di iniezione a terzi, braccio inutilizzati di bioreattore. </li><li> Rimuovere il tubo di tricheco e legare fine blu della diluizione salina impostato come vicino al raccordo a Y possibile. Tirare fascetta in atto per garantire l'assenza di trasferimento di liquidi a questa parte del tubo </li><li> Rimuovere borsa IV, e allegare tubi tricheco (rosso) di gran lunga fine di borsa IV. Assicurarsi di pulire porta di inserimento con batuffolo imbevuto di alcool prima. </li><li> Attaccare tricheco da un lato del sistema di flusso (tramite tubo estremità bianca). </li><li> Inserire 3-way rubinetto nel sistema di flusso. </li><li> Rimuovere trasduttore di pressione e la connessione a tre vie rubinetto. </li><li> Collegare altra estremità del trasduttore di pressione per l'apertura centrale nella borsa. </li></ol></li><li> Collegareil bioreattore al sistema che attraverso lo Y-giunzione. Utilizzare una siringa da 60 ml per aggiungere 350ml di 1 Fungizone% (5 ml Fungizone mescolare con 495ml di PBS) per borsa IV. </li><li> Spremere borsa IV per sciacquare il sistema che scorre regolando la rubinetti arresto per consentire il flusso di PBS. Nota: controllare all'interno bioreattore per assicurare che non si perde. </li><li> Risospendere 8 x10 6 SMC (circa un confluenti T75) in 1.25ml di medie e di semi su ogni scafffold PGA. Assicurarsi sospensione cellulare è stata uniformemente sgocciolava sul reticolo Dacron giunzione PGA così come sul lato inferiore del PGA mesh. </li><li> Pulire bordo del bioreattore con batuffolo imbevuto d'alcol attraverso la rotazione del bioreattore lateralmente evitare bilico. </li><li> Coperchio tappo in silicone di montaggio (Figura 2) <ol><li> Peel borsa autoclave indietro attentamente, facendo attenzione a non esporre fondo del coperchio. </li><li> Fissare porta di iniezione a tubo di alimentazione al connettore maschio. </li><li> Allega PTFE 0,20 micron filtri a ciascuna delle tre porte d'aria. </li><li> Fare attenzione a non esporre / toccare il fondo del coperchio durante questo processo. </li><li> Parafilm la porta di iniezione. </li></ol></li><li> Inserire il coperchio tappo in silicone in bioreattore in vetro e assicurarsi che il tubo di alimentazione all'interno del bioreattore non tocca la ponteggi PGA seminato. Parafilm tutto il coperchio. </li><li> Luogo bioreattore con il sistema di flusso all'interno dell'incubatore (su un lato) e ruotare il bioreattore ogni 5 minuti per 25-30 minuti. </li><li> Riempire la camera bioreattore con 400 ml del nostro 4-10 terreni di coltura, come descritto nella (Tabella 1). Questo terreno di coltura è "ottimizzato" per le arterie suina ingegnerizzati. </li></ol> 6. Giorno 6-7: Accensione della pompa, e prima alimentazione <ol><li> Crescono i ponteggi seminato staticamente senza pulsatile di pompaggio attraverso il tubo in silicone per 6-7 giorni. Non c'è bisogno di cambiare mezzo o la supplementazione di vitamina C durante questo periodo. </li><li> Assicurarsi che non vi siano perdite di PBS o attorcigliamento del tubo di flusso del sistema prima di attivare la pompa. </li><li> Accendere la pompa del sistema di flusso e assicurarsi di regolare le impostazioni della pompa in modo che la pressione si legge circa 270/-30mmHg. </li><li> Pressioni registrare ogni giorno in tutta la cultura e mantenere la pressione a 270/-30mmHg. Trasduttore di pressione può essere collegato a un computer per leggere e monitorare la pressione. </li></ol> Alimentazione prima <ol start="5"><li> Montare iniezione indiretta e PTFE filtro sulla alimentazione coperchi sia per il cambiamento medio e medio deposal scopi rifiuti. </li><li> Posizionare il tubo di alimentazione saldamente sulla pompa e inserirne l'estremità all'alimentazione porta del bioreattore e l'altra estremità al coperchio di alimentazione. Assicurarsi di pulire le porte di iniezione con salviette etanolo. </li><li> Utilizza un processore dual-direzionale pompa Masterflex per pompare fuori 200 ml di mezzo. Quindi utilizzare un nuovo tubo di alimentazione alla pompa 200 ml di terreno fresco di nuovo nel bioreattore. Iniziano sempre con una velocità molto lenta, soprattutto quando si pompano ritorno medio del bioreattore. </li><li> Cambiamenti a medio e acido ascorbico 2x/sett supplemento. Per aggiungere acido ascorbico, utilizzare una siringa 30ml per eliminare 25ml di media e riporla nel cappuccio di tessuto. Sciogliere 25 mg di acido ascorbico in 5 ml di PBS e filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron. In primo luogo iniettare l'acido ascorbico sterile nel tubo di alimentazione e aggiungere nuovamente il medium 25ml presi in precedenza. La ricetta di media è riportata nella Tabella 1. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. I tubi e connettori per l'assemblaggio del sistema di flusso è mostrato sopra. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Il tappo in silicone montaggio coperchio è mostrato sopra. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Schemi di montaggio bioreattore sono indicati sopra. All'interno del polsini Dacron bioreattore sono fissati sulle braccia di vetro con i nodi di sutura blu. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Sistema a flusso collegato a tubi e bioreattore è mostrato sopra. L/S18 tubi sarà pompata da una pompa Masterflex e quindi guida il flusso. Il trasduttore di pressione misura la pressione prima di entrare nel bioreattore a flusso superiore. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Immagine di raccolta nave progettata. Vasi Progettato apparirà opaco e raggiungere uno spessore di circa 250μm dopo 8 settimane di cultura in condizioni pulsatile. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Ematossilina ed eosina macchiato sezioni trasversali dei vasi ingegnerizzati. A e B sono di 8 settimane non-pulsato e pulsata navi, rispettivamente.C e D sono vasi non-pulsato e ad impulsi di 4 settimane, rispettivamente. L indica il lato del lume dei vasi. La barra di scala è 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Masson tricromica macchie per il collagene (blu) per le sezioni trasversali dei vasi ingegnerizzati. A e B sono 8 settimane di imbarcazioni non a impulsi e ad impulsi, rispettivamente. C e D sono vasi non-pulsato e ad impulsi di 4 settimane, rispettivamente. Si noti che le 4 settimane di nave pulsata mostra più collagene rispetto al suo non-pulsato controparte. Frecce bianche indicano ancora frammenti PGA nei vasi. La barra di scala è 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Colorazione immunochimica dei marcatori SMC nei bovini arterie artificiali. Muscolo liscio α-actina, calponina-1, e liscia la catena pesante della miosina muscolare (SMMHC) sono primi, intermedio e in ritardo marcatori SMC contrattile, rispettivamente. Entro la fine di 12 settimane di cultura, le cellule della parete dei vasi esprimere SM α-actina e moderate quantità di Calponin-1 e SMMHC. La barra di scala è 20μm. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> DMEM (DME / bassa modificato) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (siero fetale bovino) inattivato con il calore </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1,0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> Vitamina C (sciolto in PBS o DMEM) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glycine / Alanina 25 mg/25 mg/10 mg (sciolta in 5 ml di PBS) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1.5 mcg (sciolto in1 ml di PBS) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Penicillina G a 10.000 unità / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> PDGF-BB (derivato dalle piastrine fattore di crescita-BB) a 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti) a 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Componenti di media "4-10" sono riportati nella tabella sopra riportata. Con l'eccezione di PDGF-BB e bFGF, tutti gli altri componenti devono essere filtrate attraverso un filtro 0.2μm prima dell'uso.

<ol><li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li>
<li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li>
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<li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li>
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<li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors%2C+Intravital+Imaging%2C+and+Biomechanical+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La qualità delle navi ingegneria è in gran parte dettata dalla qualità della SMC utilizzati in coltura. Gli aspetti critici del fenotipo SMC comprendono morfologia contrattile, numero passaggio basso, e la capacità di proliferare all&#39;interno del bioreattore. Si raccomanda che il numero passaggio essere superiore a P3, al momento della semina di cellule sul patibolo polimero. Inoltre, è fondamentale per confermare che i sorgenti di SMC sono liberi micoplasma prima dell&#39;uso. Abbiamo osservato che il micoplasma con...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / materiale </th><th> Fornitore </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> FBS (Fetal Bovine Serum) inattivato per calore </td><td> Hyclone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-base </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td> Sigma </td><td> PENNA </td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato </td><td> Sigma </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> Sigma </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-Alanina </td><td> Sigma </td><td> A7469-25G </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma </td><td> P5607-25G </td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A4544-25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td></tr><tr><td> Silicone Stopper </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex tubi L / S </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex pompa </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Dacron bracciale </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA feltro </td><td> Concordia </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1,5 metrico Surgipro II sutura </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0,7 sutura Dexon metrico </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE filtri </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> Three Way rubinetto </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> Trasduttore di pressione </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV borse </td><td> Baxter </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> Diluizione di Saline </td><td> Freccia </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> Tubi di silicone </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

ingegneria biologica basata innesti vascolari utilizzando un bioreattore pulsatile

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Molti sforzi sono stati dedicati a sviluppare e far progredire la metodologia per la rigenerazione funzionale di piccolo diametro bypass arterioso. In ambiente fisiologico, sia la stimolazione meccanica e chimica sono tenuti a mantenere il corretto sviluppo e la funzionalità dei vasi arteriosi 1,2. Sistemi di coltura bioreattore sviluppato dal nostro gruppo sono stati progettati per sostenere la rigenerazione all&#39;interno di una nave controllata con precisione chemio-meccanico ambiente imitando quella dei vasi nativi. La nostra assemblea bioreattori e procedure di manutenzione sono abbastanza semplici e altamente ripetibili 3,4. Cellule muscolari lisce (SMC) sono seminate su un acido poliglicolico tubolare (PGA) maglia che viene infilato nel tubo in silicone compatibile e colta nel bioreattore, con o senza stimolazione pulsatile per un massimo di 12 settimane. Ci sono quattro caratteristiche principali che contraddistinguono la nostra bioreattore da alcuni predecessori. 1) A differenza di altri sistemi di coltura che simulano soltanto la biochimica dei vasi sanguigni circostanti nativi, il nostro bioreattore crea anche un ambiente fisiologico pulsatile applicando ciclica deformazione radiale dei vasi nella cultura. 2) Più imbarcazioni progettate possono essere coltivate simultaneamente in diverse condizioni meccaniche all&#39;interno di un ambiente chimiche controllate. 3) Il bioreattore permette una mono strato di cellule endoteliali (CE) per essere facilmente rivestiti sul lato luminale dei vasi progettato l&#39;impianto per i modelli animali. 4) Il nostro bioreattore può anche recipienti di coltura progettata con dimensioni di diverso diametro varia da 1 mm a 3 mm, risparmiando lo sforzo di adattare ogni singolo bioreattore per adattarsi a una dimensione specifica diametro. I vasi progettati colta nel nostro bioreattore assomigliano vasi sanguigni nativo istologicamente in una certa misura. Cellule nelle pareti dei vasi esprimere maturo marcatori SMC contrattili come catena pesante della miosina del muscolo liscio (SMMHC) 3. Una notevole quantità di collagene si deposita all&#39;interno della matrice extracellulare, che è responsabile per la massima resistenza meccanica dei vasi progettati 5. Analisi biochimica indica anche che il contenuto di collagene dei vasi ingegnerizzati è paragonabile a quella delle arterie native 6. È importante sottolineare che il bioreattore pulsatile ha costantemente rigenerato navi che presentano proprietà meccaniche che permettono l&#39;impianto esperimenti di successo in modelli animali 3,7. Inoltre, questo bioreattore può essere ulteriormente modificato per consentire in tempo reale valutazione e monitoraggio del rimodellamento del collagene nel corso del tempo, non invasivo, usando una non lineare microscopia ottica (NLOM) 8. Per concludere, questo bioreattore dovrebbe servire come una piattaforma eccellente per studiare i meccanismi fondamentali che regolano la rigenerazione funzionale di protesi vascolari di piccolo diametro.

Il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di coltura bioreattore che imita lo stress pulsatile fisiologica del sistema cardiovascolare per rigenerare impiantabili protesi vascolari di piccolo diametro.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

È stato dedicato un notevole sforzo allo sviluppo e al perfezionamento della metodologia per rigenerare bypass arteriosi funzionali di piccolo diametro. In condizioni fisiologiche...

L'obiettivo generale di questa procedura è progettare innesti vascolari di origine biologica utilizzando un sistema di bioreattore pulsatile. Questo risultato si ottiene preparando un impalcatura biodegradabile in rete di PGA sulla quale le cellule cresceranno in fila e assemblandola all'interno di una camera di bioreattore. Le impalcature vengono quindi seminate con cellule muscolari lisce e un coperchio dotato di tubo di ventilazione e alimentazione sigilla la camera del bioreattore.Il biorreattore viene quindi collegato a un sistema di flusso per fornire un flusso pulsatile ai vasi presenti nel biorreattore. All'interno del reattore, le cellule si sviluppano nei vasi, che superano test immunochemici, biochimici e meccanici. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia coronarica, poiché rappresenta un approccio promettente per la rigenerazione di innesti vascolari impiantabili di piccolo diametro destinati al bypass arterioso.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili nell'ingegneria vascolare, può essere applicato anche ad altri sistemi organici soggetti a forze fisiologiche cicliche. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontrerà difficoltà. Sarà necessario molto esercizio per padroneggiare completamente le competenze richieste.L'idea di questo approccio è nata quando abbiamo compreso l'importanza di applicare stimolazioni meccaniche fisiologiche per rigenerare costrutti ingegnerizzati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché il processo di utilizzo del bioreattore è difficile da apprendere, essendo composto da numerose fasi che possono essere acquisite solo attraverso una dimostrazione dettagliata. Per iniziare, utilizzare acqua distillata per pulire sezioni lunghe 30 centimetri di tubo in silicone con un diametro interno di tre millimetri e lasciarle asciugare all'aria.Utilizzare le forbici per ritagliare una sezione della rete PGA di 1,1 centimetro per otto centimetri per ogni pezzo di tubo, utilizzando un emostatico, quindi fissare la rete PGA al tubo con un punto di sutura Dexon 6.0 annodando tre nodi chirurgici e proseguendo con punti singoli utilizzando l'emostatico; la rete fissata forma un impalcatura PGA. Lavare le impalcature immergendole prima in idrossido di sodio uno molare per uno-due minuti, seguito da tre risciacqui in acqua distillata per due minuti ciascuno. Asciugare delicatamente tra un lavaggio e l'altro e lasciare asciugare all'aria in cappa per 15 minuti dopo il terzo risciacquo.Dopo averlo asciugato, cucire un centimetro di manicotto in Dacron a ciascuna estremità della maglia con tre punti di sutura. Lasciare un'estremità del tubo sovrapposta di due-tre millimetri e non perforare il tubo. Assicurarsi di lasciare circa 15 centimetri di sutura libera per un uso successivo in questo protocollo.Tutti i componenti e gli strumenti del biorreattore vengono sterilizzati in autoclave preventivamente. Il giorno prima di avviare la coltura nel biorreattore, il biorreattore deve essere parzialmente assemblato: immergere i componenti del biorreattore, le matrici, il tubo di silicone a rete, gli strumenti chirurgici e un filo sottile più lungo della lunghezza del biorreattore in una soluzione di etanolo al 70% per almeno 30 minuti. Durante l'immersione, utilizzare il filo per far passare il tubo di silicone attraverso i bracci laterali del reattore.Ora estrarre il bioreattore e fissare all'interno le impalcature in PGA stringendo i manicotti in Dacron sui bordi svasati del vetro. Utilizzare l'eccesso di sutura per fissare ciascun manicotto. Successivamente, mediante connettori, collegare il tubo di silicone su un lato dell'impalcatura a una coppia di bracci del bioreattore e collegare il tubo sull'altro lato dell'impalcatura agli altri due bracci.Una volta installati i connettori, estrarli dai bracci laterali e risciacquare il biorreattore con etanolo. Lasciare il reattore in ammollo per 10 minuti su ciascun lato. Posizionare il biorreattore su alcune piastre di Petri e risciacquarlo con coltura di tessuti.Gradi d'acqua. Utilizzando una pipetta, assicurarsi di lavare anche la rete e i tubi. Posizionare ora una barretta magnetica sterile nel reattore per un uso futuro e asciugare l'apparato tutta la notte in cappa con il ventilatore acceso e la luce UV spenta da questo momento in avanti.Non appoggiarsi sopra il reattore, poiché ciò potrebbe causare contaminazione. Durante l'allestimento, tutti i connettori devono essere puliti accuratamente con alcol. Prima di effettuare i collegamenti, molti dei giunti vengono rinforzati con paraform, che deve essere immerso in etanolo al 70% prima dell'applicazione. Pertanto, è consigliabile avere a disposizione abbondanza di entrambi i materiali.Pronti come precauzione, posizionare una piastra di Petri sterile su ciascuna apertura del biorreattore per proteggere l'impalcatura PGA all'interno da contaminanti. Iniziare ora il montaggio collegando il porto di iniezione al terzo braccio non utilizzato del biorreattore. Successivamente, collegare la sacca per fleboclisi al sistema di flusso.Con il set di tubi per walrus, legare l'estremità blu il più vicino possibile al giunto a Y e bloccare il tubo con una molletta. Collegare il tubo rosso all'estremità opposta della sacca per fleboclisi. Quindi collegare il tubo bianco a un lato del sistema di flusso.Inserire un rubinetto a tre vie nel sistema di flusso. Collegare un'estremità del tubo del trasduttore di pressione al rubinetto e l'altra estremità all'apertura centrale del sacco per fleboclisi. Per riempire parzialmente il sistema di flusso e verificare la presenza di perdite, aggiungere 350 millilitri di PBS e 1% fungi zone al sacco per fleboclisi.Utilizzando una siringa da 60 millilitri prima o dopo aver collegato al sistema di flusso, regolare il rubinetto per controllare la direzione del flusso di PBS e premere il sacchetto per lavare il sistema. Questo passaggio può essere eseguito sia prima che dopo il posizionamento delle cellule. Ora le cellule possono essere posizionate nel biorreattore.In questo esempio, risospendere 8 milioni di cellule SM, pari a circa una T75 confluenza, in 1,25 millilitri di mezzo e distribuirle uniformemente sullo scaffold PGA dalla giunzione in Dacron alla giunzione in Dacron. Dopo aver aggiunto le cellule, pulire il bordo del bioreattore con alcol. Evitare di sostare sopra il reattore.Successivamente, assemblare con attenzione il coperchio con tappo in silicone. Assicurarsi di non esporre la parte inferiore del coperchio quando viene rimosso dal sacchetto dell'autoclave o durante i successivi passaggi di attacco. Per prima cosa, collegare il porto di iniezione al tubo di alimentazione nel connettore maschio.In secondo luogo, applicare filtri in PTFE da 0,20 micron a ciascuno dei tre porti di aerazione. Nel terzo paragrafo, sigillare il porto di iniezione. Inserire il tappo in silicone assemblato nel biorreattore in vetro.Assicurarsi che il tubo di alimentazione non tocchi le matrici PGA posizionate. Quindi sigillare con paraform. A questo punto collegare il bioreattore al sistema di flusso e posizionare il bioreattore e il sistema di flusso all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius. Per 25-30 minuti, il reattore deve essere posizionato lateralmente e ruotato ogni cinque minuti. Successivamente, mentre è ancora all'interno dell'incubatrice, riempire la camera del biorreattore con 400 millilitri di un mezzo di coltura 4-10 mediante una pompa attraverso un tubo di alimentazione. Incubare ora le impalcature seminate senza alcun pompaggio pulsatile per sei-sette giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Non è necessario alcun cambio di mezzo né integrazione con vitamina C durante questo periodo prima di accendere la pompa; ispezionare i tubi per verificare la presenza di perdite o piegature. Quindi regolare la velocità della pompa in modo da mantenere un intervallo di pressione compreso tra -30 e 270 millimetri di mercurio. Monitorare e mantenere questa pressione quotidianamente per tutta la durata della coltura.Le sostituzioni del mezzo e l'intintegrazione di acido ascorbico devono essere effettuate due volte alla settimana mentre lo scaffold cresce con pompaggio pulsatile per alimentare prima il mezzo fresco; collegare la porta di iniezione e il filtro in PTFE sui tappi di alimentazione sia per la sostituzione del mezzo sia per lo smaltimento del mezzo di scarto. Successivamente, inserire saldamente il tubo di alimentazione nella pompa bidirezionale e collegare un'estremità alla porta di alimentazione del bioreattore e l'altra estremità al tappo di alimentazione. Ora avviare lentamente il pompaggio per rimuovere 200 millilitri di mezzo.Gradualmente, la velocità della pompa può essere aumentata. Quindi, collegare un nuovo tubo di alimentazione e iniziare lentamente a pompare 200 millilitri di mezzo fresco. Per aggiungere acido ascorbico al reattore, prelevare 25 millilitri di mezzo utilizzando una siringa sterile da 30 millilitri.Aggiungere cinque millilitri di soluzione sterile di acido ascorbico e quindi reintrodurre i 25 millilitri. I vasi ingegnerizzati appariranno opachi e raggiungeranno uno spessore parietale di circa 250 micrometri dopo otto settimane di coltura. In condizioni pulsanti, la colorazione con ematossilina, eosina e toina dei vasi ingegnerizzati mostra variazioni della morfologia tissutale nel tempo e in risposta alla stimolazione pulsatile.Il lato luminale dei vasi è indicato con una colorazione triacroma di Masson. La colorazione per il collagene mostra che il vaso pulsato di quattro settimane presenta più collagene rispetto al suo corrispettivo non pulsato. Le frecce bianche indicano i frammenti residui di PGA nei vasi a 12 settimane. L'analisi immunoistochimica mostra l'espressione del marcatore precoce del muscolo liscio alfa-actina, del marcatore intermedio del muscolo liscio calponina-1 e del marcatore tardivo del muscolo liscio catena pesante della miosina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette-otto ore se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di eseguire ogni passaggio nel modo più accurato e sterile possibile seguendo attentamente il protocollo. Altri metodi, come la modifica della superficie luminale dei vasi ingegnerizzati, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sull'importanza della modifica della superficie luminale nel mantenimento dei vasi ingegnerizzati durante studi in vivo, dopo il loro sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale, in particolare dell'ingegneria vascolare, per esplorare possibili metodi per trattare le malattie delle arterie coronarie in modelli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere innesti vascolari ingegnerizzati impiantabili attraverso una coltura postale dinamica. Non dimenticare che lavorare con idrossido di sodio può essere pericoloso e che precauzioni come la protezione degli occhi e l'uso del camice da laboratorio devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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