Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ingegnerizzare innesti vascolari su base biologica utilizzando un sistema di bioreattori pulsatile. Ciò si ottiene preparando un'impalcatura biodegradabile da una rete di PGA in cui le cellule cresceranno in fila e assemblandole in una camera del bioreattore. Gli scaffold vengono quindi alloggiati con cellule muscolari lisce e un coperchio con aria e tubo di alimentazione sigilla la camera del bioreattore.

Il bioreattore viene quindi collegato a un sistema di flusso per fornire un flusso pulsatile ai recipienti del bioreattore. Nel reattore, le cellule crescono in recipienti che superano test immunochimici, biochimici e meccanici. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia coronarica perché questa tecnica è un approccio promettente per rigenerare innesti vascolari impiantabili di piccolo diametro per il bypass arterioso.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'ingegneria vascolare, può essere applicato ad altri sistemi di organi che sono sottoposti a forze fisiologiche cicliche. In generale, l'individuo nuovo a questo metodo avrà difficoltà. Avrai bisogno di molta pratica per padroneggiare appieno le abilità.

Abbiamo avuto l'idea di questo approccio quando ci siamo resi conto dell'importanza di applicare la stimolazione meccanica fisiologica per rigenerare i costrutti ingegneristici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto il processo di canto del bioreattore è difficile da imparare perché ci sono molti passaggi e può essere acquisito solo attraverso una dimostrazione dettagliata. Per iniziare, utilizzare acqua distillata per pulire sezioni lunghe 30 centimetri di tubi in silicone con diametro interno di tre millimetri e lasciarli asciugare all'aria.

Usa le forbici per ritagliare una sezione di 1,1 centimetri per otto centimetri di rete PGA per ogni pezzo di tubo usando un emostato, quindi la rete PGA al tubo con sutura Dexon 6.0 lega tre nodi chirurgici e segue con punti singoli con emostato, la rete fissata crea un'impalcatura PGA. Lavare le impalcature immergendole prima in un idrossido di sodio molare per uno o due minuti, quindi tre immersioni in acqua distillata per due minuti per immersione. Asciugali tamponando tra un lavaggio e l'altro e lasciali asciugare all'aria in una cappa per 15 minuti dopo il terzo lavaggio.

Una volta asciugati, suturare polsini in Dacron di un centimetro su ciascuna estremità della rete con tre punti. Lasciare una sovrapposizione di due o tre millimetri e non forare il tubo. Assicurati di lasciare circa 15 centimetri di sutura libera per un uso successivo in questo protocollo.

Tutti i componenti e gli strumenti del bioreattore vengono preventivamente sterilizzati in autoclave. Il giorno prima di iniziare la coltura del bioreattore, il bioreattore deve essere parzialmente assemblato immergere i componenti del bioreattore le impalcature, quindi collegare il tubo di silicone, gli strumenti chirurgici e un filo sottile più lungo della lunghezza del bioreattore in un bagno di etanolo al 70% per almeno 30 minuti mentre è sommerso. Utilizzare il filo per tirare il tubo di silicone attraverso i bracci laterali del reattore.

Ora emergono il bioreattore e fissano le impalcature PGA all'interno fissando i polsini in Dacron sulle labbra di vetro svasate. Utilizzare la sutura in eccesso per legare ogni bracciale. Quindi, utilizzando i connettori, collegare il tubo in silicone su un lato dell'impalcatura con un paio di bracci del bioreattore e collegare il tubo sull'altro lato dell'impalcatura agli altri due bracci.

Una volta installati i connettori, estrarli dai bracci laterali e sciacquare il bioreattore con etanolo. Lasciare il reattore in ammollo per 10 minuti su ciascun lato. Posizionare il bioreattore su alcune piastre di Petri e sciacquarlo con coltura tissutale.

Acqua di grado. Usando una pipetta, assicurati di sciacquare anche la rete e il tubo. Ora posizionare un'ancoretta sterile nel reattore per un uso futuro e asciugare l'apparecchio durante la notte nella cappa con il ventilatore acceso e i raggi UV spenti da questo punto in poi.

Non sporgersi sul reattore in quanto ciò potrebbe causare contaminazioni Durante l'installazione, tutti i connettori devono essere puliti con alcool. Prima di effettuare gli attacchi, molte delle articolazioni vengono rinforzate con paraform, che deve essere imbevuto di etanolo al 70% prima di essere applicato. Quindi ho un sacco di entrambi.

A portata di mano, per precauzione, posizionare una capsula di Petri sterile su ogni apertura del bioreattore per proteggere l'impalcatura PGA all'interno dai contaminanti. Ora inizia la configurazione collegando la porta di iniezione al terzo braccio inutilizzato del bioreattore. Quindi, collegare la sacca per flebo al sistema di flusso.

Con il set di tubi tricheco, legare l'estremità blu il più vicino possibile alla giunzione a Y e bloccare il tubo. Collegare il tubo rosso all'estremità più lontana della sacca per flebo. Quindi collegare il tubo bianco a un lato del sistema di flusso.

Inserire un rubinetto di arresto a tre vie nel sistema di flusso. Collegare un'estremità del tubo del trasduttore di pressione al rubinetto di arresto e collegare l'altra estremità all'apertura centrale della sacca per flebo. Ora per riempire parzialmente il sistema di flusso e verificare la presenza di perdite, aggiungere 350 millilitri di PBS e l'1% di funghi alla sacca per flebo.

Utilizzando una siringa da 60 millilitri prima o dopo il collegamento al sistema di flusso, regolare il rubinetto per controllare la direzione del flusso di PBS e premere la sacca per lavare il sistema. Questo passaggio può essere eseguito prima o dopo l'inserimento delle celle. Ora le cellule possono essere inserite in un bioreattore.

In questo esempio, i resu sospendono 8 milioni di cellule SM, che è circa un T 75 confluente in 1,25 millilitri di terreno e le fanno gocciolare uniformemente sull'impalcatura PGA dalla giunzione Dacron alla giunzione Dacron. Dopo aver aggiunto le cellule, pulire il bordo del bioreattore con alcool. Evitare di passare il mouse sopra il reattore.

Quindi, assemblare con cura il coperchio del tappo in silicone. Assicurarsi di non esporre la parte inferiore del coperchio quando viene rimosso dalla sacca dell'autoclave o durante una delle seguenti fasi di fissaggio. Innanzitutto, collegare la porta di iniezione al tubo di alimentazione in corrispondenza del connettore maschio.

In secondo luogo, collegare filtri in PTFE da 0,20 micron a ciascuno dei tre aeroporti. Terzo paragrafo, filmare la porta di iniezione. Inserire il coperchio del tappo in silicone assemblato nel bioreattore di vetro.

Assicurarsi che il tubo di alimentazione non tocchi le impalcature PGA in sella. Quindi sigillare con paraforma. Ora collega il bioreattore al sistema di flusso e posiziona il bioreattore e il sistema di flusso all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius.

Per 25-30 minuti, il reattore deve essere posizionato su un lato e ruotato ogni cinque minuti. Successivamente, mentre si è ancora nell'incubatore, riempire la camera del bioreattore con 400 millilitri di 4-10 terreni di coltura utilizzando una pompa attraverso un tubo di alimentazione. Ora incuba gli scaffold seminati senza alcun pompaggio pulsatile per sei o sette giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Non è necessario un cambio medio o un'integrazione di vitamina C durante questo periodo prima di accendere la pompa, ispezionare il tubo per verificare la presenza di perdite o attorcigliamenti. Quindi regolare la velocità della pompa per mantenere un intervallo di pressione compreso tra 30 e 270 millimetri di mercurio negativi. Monitorare e mantenere questa pressione quotidianamente in tutta la coltura.

I cambi di terreno e l'integrazione di acido ascorbico devono essere eseguiti due volte a settimana mentre l'impalcatura cresce con il pompaggio pulsatile per alimentare prima il terreno fresco, collegare la porta di iniezione e il filtro in PTFE sui coperchi di alimentazione sia per il cambio del fluido che per lo smaltimento dei rifiuti medi. Quindi, posizionare saldamente il tubo di alimentazione nella pompa a doppia direzione e inserire un'estremità nella porta di alimentazione del bioreattore e l'altra estremità nel coperchio di alimentazione. Ora inizia lentamente a pompare 200 millilitri di terreno.

Gradualmente la velocità della pompa può essere aumentata. Quindi collegare un nuovo tubo di alimentazione e iniziare lentamente a pompare 200 millilitri di terreno fresco. Per aggiungere acido ascorbico al reattore, rimuovere 25 millilitri di terreno utilizzando una siringa sterile da 30 millilitri.

Aggiungere cinque millilitri di soluzione sterile di acido ascorbico e poi restituire i 25 millilitri. I recipienti ingegnerizzati medi appariranno opachi e raggiungeranno uno spessore della parete di circa 250 micron dopo otto settimane di coltura. In condizioni pulsatili, la colorazione con emato, toina ed eosina dei vasi ingegnerizzati mostra cambiamenti nella morfologia dei tessuti con il tempo e con la pulsazione.

Il lato luminale dei vasi è indicato con una colorazione tri CHRO di L masson. Per gli spettacoli di collagene, i vasi pulsati a quattro settimane hanno più collagene rispetto alla sua controparte non pulsata, le frecce bianche indicano i frammenti di PGA rimanenti nei vasi entro 12 settimane. L'analisi immunochimica mostra l'espressione del marcatore precoce della muscolatura liscia alfa actina, del marcatore intermedio della muscolatura liscia cal poin one e del marcatore tardivo della muscolatura liscia catena pesante della miosina Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette-otto ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire tutto nel modo più pulito e rigoroso possibile seguendo questa procedura. Altri metodi, come la modifica del lume dei vasi ingegnerizzati, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come l'importanza della modifica della superficie luminale nella manutenzione dei vasi ingegnerizzati durante gli studi in vivo. Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale, in particolare dell'ingegneria vascolare, per esplorare potenziali mezzi per trattare le malattie coronariche in modelli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere innesti vascolari ingegneristici impiantabili attraverso una cultura postale dinamica. Non dimenticare che lavorare con l'idrossido di sodio può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario utilizzare sempre precauzioni come la protezione degli occhi e il camice da laboratorio.