Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

L'obiettivo generale di questa procedura è progettare innesti vascolari di origine biologica utilizzando un sistema di bioreattore pulsatile. Questo risultato si ottiene preparando un impalcatura biodegradabile in rete di PGA sulla quale le cellule cresceranno in fila e assemblandola all'interno di una camera di bioreattore. Le impalcature vengono quindi seminate con cellule muscolari lisce e un coperchio dotato di tubo di ventilazione e alimentazione sigilla la camera del bioreattore.

Il bioreattore viene quindi collegato a un sistema di flusso per fornire un flusso pulsatile ai vasi presenti nel bioreattore. All'interno del reattore, le cellule crescono formando vasi che superano test immunochemici, biochimici e meccanici. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia coronarica, poiché rappresenta un approccio promettente per la rigenerazione di innesti vascolari impiantabili di piccolo diametro destinati al bypass arterioso.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili nell'ingegneria vascolare, può essere applicato anche ad altri sistemi organici soggetti a forze fisiologiche cicliche. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica incontreranno difficoltà. Sarà necessario molto esercizio per padroneggiare completamente le competenze richieste.

L'idea di questo approccio è nata quando abbiamo compreso l'importanza di applicare stimolazioni meccaniche fisiologiche per rigenerare costrutti ingegnerizzati. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché il processo di utilizzo del bioreattore è difficile da apprendere, essendo composto da molteplici passaggi che possono essere acquisiti soltanto attraverso una dimostrazione dettagliata. Per iniziare, utilizzare acqua distillata per pulire sezioni di tubo in silicone lunghe 30 centimetri e con un diametro interno di tre millimetri, quindi lasciarle asciugare all'aria.

Utilizzare le forbici per ritagliare una sezione della rete PGA di 1,1 centimetro per otto centimetri per ogni pezzo di tubo, usando un emostatico, quindi fissare la rete PGA al tubo con un punto di sutura Dexon 6.0 annodando tre nodi chirurgici e proseguendo con punti singoli usando l'emostatico; la rete fissata forma un impalcatura PGA. Lavare le impalcature immergendole prima in idrossido di sodio uno molare per uno-due minuti, seguito da tre risciacqui in acqua distillata per due minuti ciascuno. Asciugarle delicatamente tra un lavaggio e l'altro e lasciarle asciugare all'aria in una cappa per 15 minuti dopo il terzo risciacquo.

Dopo averlo asciugato, cucire un centimetro di manicotto in Dacron a ciascuna estremità della maglia con tre punti di sutura. Lasciare un'estremità del tubo sovrapposta di due-tre millimetri e non perforare il tubo. Assicurarsi di lasciare circa 15 centimetri di sutura libera per un uso successivo in questo protocollo.

Tutti i componenti del bioreattore e gli strumenti vengono sterilizzati in autoclave in anticipo. Il giorno precedente l'avvio della coltura nel bioreattore, il bioreattore deve essere parzialmente assemblato: immergere i componenti del bioreattore, gli scaffold, il tubo di silicone a rete, gli strumenti chirurgici e un filo sottile più lungo della lunghezza del bioreattore in una soluzione di etanolo al 70% per almeno 30 minuti. Durante l'immersione, utilizzare il filo per far passare il tubo di silicone attraverso i bracci laterali del reattore.

Ora estrarre il biorreattore e fissare all'interno le matrici di PGA stringendo i manicotti in Dacron sui bordi svasati del vetro. Utilizzare l'eccesso di sutura per fissare ciascun manicotto. Successivamente, mediante connettori, collegare il tubo in silicone su un lato della matrice a una coppia di bracci del biorreattore e collegare il tubo sull'altro lato della matrice agli altri due bracci.

Dopo aver installato i connettori, estrarli dai bracci laterali e risciacquare il biorreattore con etanolo. Lasciare il reattore in ammollo per 10 minuti su ciascun lato. Posizionare il biorreattore su alcune piastre di Petri e risciacquarlo con coltura di tessuti.

Gradienza dell'acqua. Utilizzando una pipetta, assicurarsi di risciacquare anche la rete metallica e i tubi. Inserire ora una barretta magnetica sterile nel reattore per un uso futuro e lasciare asciugare l'apparato tutta la notte sotto cappa con il ventilatore acceso e la lampada UV spenta da questo momento in avanti.

Non inclinarsi sopra il reattore, poiché ciò potrebbe causare contaminazione. Durante il montaggio, tutti i connettori devono essere puliti accuratamente con alcol. Prima di effettuare i collegamenti, molte delle giunzioni vengono rinforzate con paraform, che deve essere immerso in etanolo al 70% prima dell'applicazione. Avere quindi a disposizione abbondanza di entrambi.

Come precauzione, posizionare una piastra di Petri sterile su ciascun'apertura del biorreattore per proteggere l'impalcatura PGA all'interno da contaminanti. Iniziare ora il montaggio collegando il porto di iniezione al terzo braccio non utilizzato del biorreattore. Successivamente, collegare la sacca per fleboclisi al sistema di flusso.

Con il set di tubi per walrus, chiudere l'estremità blu il più vicino possibile al giunto a Y e bloccare il tubo con una molletta. Collegare il tubo rosso all'estremità opposta della sacca per fleboclisi. Quindi collegare il tubo bianco a un lato del sistema di flusso.

Inserire un rubinetto a tre vie nel sistema di flusso. Collegare un'estremità del tubo del trasduttore di pressione al rubinetto e l'altra estremità all'apertura centrale del sacco per fleboclisi. Per riempire parzialmente il sistema di flusso e verificare la presenza di perdite, aggiungere 350 millilitri di PBS e 1% fungi zone al sacco per fleboclisi.

Utilizzando una siringa da 60 millilitri prima o dopo aver collegato al sistema di flusso, regolare il rubinetto per controllare la direzione del flusso di PBS e comprimere il sacchetto per lavare il sistema. Questo passaggio può essere eseguito sia prima che dopo il posizionamento delle cellule. A questo punto, le cellule possono essere posizionate nel bioreattore.

In questo esempio, sospendere 8 milioni di cellule SM, pari a circa una T 75 confluenza, in 1,25 millilitri di mezzo e distribuirle uniformemente sullo scaffold PGA dalla giunzione in Dacron alla giunzione in Dacron. Dopo aver aggiunto le cellule, pulire il bordo del bioreattore con alcol. Evitare di sostare sopra il reattore.

Successivamente, assemblare con attenzione il coperchio con tappo in silicone. Assicurarsi di non esporre la parte inferiore del coperchio quando viene rimosso dal sacchetto dell'autoclave o durante i successivi passaggi di attacco. Per prima cosa, collegare il porto di iniezione al tubo di alimentazione nel connettore maschio.

In secondo luogo, applicare filtri in PTFE da 0,20 micron a ciascuno dei tre porti di aerazione. In terzo luogo, sigillare il porto di iniezione con del film. Inserire il tappo in silicone assemblato nel biorreattore di vetro.

Assicurarsi che il tubo di alimentazione non tocchi le matrici PGA posizionate. Quindi sigillare con paraform. A questo punto collegare il bioreattore al sistema di flusso e posizionare il bioreattore e il sistema di flusso all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius.

Per 25-30 minuti, il reattore deve essere posizionato lateralmente e ruotato ogni cinque minuti. Successivamente, mentre è ancora all'interno dell'incubatrice, riempire la camera del biorreattore con 400 millilitri di un mezzo di coltura 4-10 mediante una pompa attraverso un tubo di alimentazione. Incubare ora le impalcature seminate senza alcun pompaggio pulsatile per sei-sette giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Non è necessario alcun cambio di mezzo né integrazione con vitamina C durante questo periodo prima di accendere la pompa; ispezionare i tubi per verificare la presenza di perdite o piegature. Quindi regolare la velocità della pompa in modo da mantenere un intervallo di pressione compreso tra -30 e 270 millimetri di mercurio. Monitorare e mantenere questa pressione quotidianamente per tutta la durata della coltura.

Le sostituzioni del mezzo e la supplementazione con acido ascorbico devono essere effettuate due volte alla settimana, mentre lo scaffold cresce con pompaggio pulsatile per fornire mezzo fresco. Per prima cosa, collegare la porta di iniezione e il filtro in PTFE sui tappi di alimentazione, sia per la sostituzione del mezzo sia per lo smaltimento del mezzo di scarto. Successivamente, inserire saldamente il tubo di alimentazione nella pompa bidirezionale e collegare un'estremità alla porta di alimentazione del bioreattore e l'altra estremità al tappo di alimentazione. A questo punto, avviare lentamente il pompaggio per rimuovere 200 millilitri di mezzo.

Gradualmente è possibile aumentare la velocità della pompa. Quindi collegare un nuovo tubo di alimentazione e iniziare lentamente a pompare 200 millilitri di mezzo fresco. Per aggiungere acido ascorbico al reattore, prelevare 25 millilitri di mezzo utilizzando una siringa sterile da 30 millilitri.

Aggiungere cinque millilitri di soluzione sterile di acido ascorbico e quindi reintegrare i 25 millilitri. I vasi ingegnerizzati appariranno opachi e raggiungeranno uno spessore parietale di circa 250 micrometri dopo otto settimane di coltura. In condizioni pulsanti, la colorazione con ematossilina, eosina e toina dei vasi ingegnerizzati mostra variazioni della morfologia tissutale nel tempo e in risposta alla pulsazione.

Il lato luminale dei vasi è indicato con una colorazione triacroma di Masson. La colorazione per il collagene mostra che il vaso sottoposto a stimolazione pulsatile per quattro settimane presenta una maggiore quantità di collagene rispetto al suo corrispettivo non pulsato. Le frecce bianche indicano i frammenti residui di PGA nei vasi a 12 settimane. L'analisi immunoistochimica mostra l'espressione del marcatore precoce del muscolo liscio alfa-actina, del marcatore intermedio calponina-1 e del marcatore tardivo catena pesante della miosina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette-otto ore se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di eseguire ogni passaggio nel modo più accurato e sterile possibile, seguendo attentamente il protocollo indicato. Altri metodi, come la modifica della superficie luminale dei vasi ingegnerizzati, possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori quesiti, ad esempio sull'importanza della modifica della superficie luminale nel mantenimento dei vasi ingegnerizzati durante studi in vivo, dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale, in particolare dell'ingegneria vascolare, per esplorare possibili metodi per trattare le malattie delle arterie coronarie in modelli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere innesti vascolari ingegnerizzati impiantabili attraverso una coltura postale dinamica. Non dimenticare che lavorare con idrossido di sodio può essere pericoloso e che precauzioni come la protezione degli occhi e l'uso del camice da laboratorio devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.