Name: Dissezione e 2-Photon Imaging di linfonodi periferici nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: Impara la dissezione dei linfonodi periferici nei topi e l'imaging a due fotoni per studiare la motilità delle cellule T CD4+. Questo metodo consente di visualizzare le dinamiche delle interazioni linfocitarie in vivo.

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Ringraziamo Paquette Rebecca per l&#39;assistenza con la preparazione dei reagenti. MPM è supportato da una borsa di Ruth L. Kirchstein predoctoral dal National Institutes of Health e il sostegno di borse di GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP) anche dal National Institutes of Health.

1. Trasferimento adottivo di cellule: Vena caudale o iniezione intraoculare sono entrambi metodi adeguati per l&#39;introduzione di cellule tracker-etichettati o proteina fluorescente che esprimono linfociti. In questo video. dimostriamo trasferimento adottivo di cellule per iniezione coda vena. a. Materiale Cellule T CD4 + sono etichettati con 1,4 CFSE mM per 30 minuti a 37 º C, lavate due volte e risospese in 100 ml di RPMI-1640. Le cellule vengono caricati in una siringa da insulina sterile 28 gauge per l&#39;iniezione. Il numero di celle utilizzate dipende l&#39;esperimento viene fatto. Tipicamente, 5 milioni di cellule T sono sufficienti per una semplice visualizzazione delle cellule T. Un dispositivo di immobilizzazione roditore per il mouse è necessaria per evitare danni per l&#39;animale e per te stesso. b. Protezione degli animali Il mouse è fissato per il trasferimento adottivo lentamente appoggio l&#39;animale nel dispositivo di immobilizzazione roditori (vedi video) e chiudere l&#39;estremità aperta del tubo delicatamente lo stantuffo. Non lasciare andare la coda di topo durante questo processo, come alcuni animali più piccoli può girare intorno all&#39;interno del dispositivo di immobilizzazione. Questo metodo impedisce l&#39;animale da ferire se stesso e di muoversi durante l&#39;iniezione. Durante l&#39;installazione del dispositivo di immobilizzazione roditore, non spingere il pistone in là di quanto necessario per mantenere l&#39;animale dal salto in avanti. Inoltre, non spingere il pistone contro l&#39;animale, e non lasciare l&#39;animale nel dispositivo di immobilizzazione per un periodo prolungato di tempo. c. Visualizzazione della vena caudale Tirare delicatamente la coda verso di voi in modo che sia leggermente avvolto sopra il dito indice e tenuto contro l&#39;interno del dito con il pollice. Identificare le vene coda situate ai due lati della coda verticale. La visualizzazione è facilitato dal riscaldamento della coda con acqua calda e pulendoli giù con etanolo. d. L&#39;iniezione di cellule Quando la vena è stato localizzato, inserire la siringa conica rivolta verso l&#39;alto ad un parallelo angolo basso alla vena. Una volta in vena, lentamente spingere il pistone, se siete in vena ci dovrebbe essere alcuna resistenza all&#39;iniezione. Se non vi è alcuna resistenza, rimuovere la siringa e riprova in una posizione diversa. Se siete in vena, lentamente spingere il pistone fino a quando l&#39;iniezione è completa. La coda non deve diventare disteso durante l&#39;iniezione. Se lo fa, ciò significherebbe che l&#39;ago non è in vena. E &#39;possibile &quot;perdere&quot; la vena durante l&#39;iniezione. In questo caso, rimuovere l&#39;ago e provare l&#39;iniezione in un punto diverso. Se avete bisogno di tentare più di una iniezione, è meglio spostare la coda in alto verso il corpo del mouse dal sito di iniezione originale. Pianificare in anticipo per questa possibilità a partire distalmente sulla coda per darti spazio per un altro tentativo di trasferimento adottivo. e. Post-iniezione considerazioni Dopo l&#39;iniezione è stata completata, un piccolo riflusso di sangue dalla vena si verificherà. Premere delicatamente il sito di iniezione con un panno pulito, pulire fino a quando il sanguinamento si arresta. Togliere lo stantuffo e lasciare che l&#39;animale camminare in avanti, fuori dal dispositivo di immobilizzazione, mentre delicatamente aggrappato alla coda. Verificate sempre col vostro comitato animali cura e protocolli di utilizzare animali per garantire che siano conformi. E &#39;importante praticare questa tecnica più volte prima di tentare l&#39;esperimento vero e proprio. 2. Linfonodale isolamento Isolamento dei linfonodi per due immagini fotoni richiede la rimozione accurata del linfonodo corretta dal tessuto circostante. a. Selezione e l&#39;ubicazione dei linfonodi periferici Selezione dei linfonodi per l&#39;imaging dipenderà dagli obiettivi sperimentali. Essere a conoscenza di infezione locale o iniezione-drenante linfonodi, e selezionare il nodo appropriato per l&#39;imaging. L&#39;articolo di Van den Broeck et al. Descrive la posizione e la morfologia dei linfonodi murini in dettaglio 3. In questo video, ci dimostrano l&#39;asportazione di sei grandi nodi linfatici periferici che sono adatti per l&#39;isolamento di cellule o di imaging. b. Linfonodale rimozione: Tenete a mente l&#39;integrità del tessuto durante la rimozione dei linfonodi. Fare attenzione a non rompere la capsula o in qualsiasi modo danneggiare la struttura dei linfonodi. Perdita di integrità strutturale del linfonodo comprometterà l&#39;esperimento. Se necessario, rimuovere il grasso dalla superficie del linfonodo con multa dissettore (# 5 Dumont) sotto un microscopio da dissezione. I linfonodi non dovrebbe avere alcun grasso residuo sulla superficie del nodo, in modo da oscurare imaging dispersione della luce. Escissione corretta dei linfonodi è anche una tecnica importante per la pratica prima del primo esperimento reale. 3. Linfa NodImaging e installazione e considerazioni Il linfonodo deve essere assicurato alla fase di imaging, che in questo caso consiste in una camera di incasso. Riscaldato, ossigeno perfusi media è pompato nella camera da un lato utilizzando una pompa peristaltica e riscaldatore in linea, ed esce attraverso un canale verso il basso classificato in una camera di raccolta con un tubo a vuoto in un pallone di raccolta dei rifiuti. Nel nostro sistema, il linfonodo è immerso in 37 ° C media e super-perfusi con medici di grado CarboGen (5% CO 2, 95% O 2). La temperatura dei media perfusione dovrebbero essere registrati come vicino al linfonodo come è possibile. Il vostro sistema particolare può richiedere variazioni della portata media e scenografia per ospitare la fase di microscopio e obiettivo. a. Linfonodi configurazione di imaging: Come mostrato nel video, siamo sicuri del linfonodo dal primo allegando, midollare rivolto verso il basso (per l&#39;immagine T o zone a cellule B mediante un microscopio verticale) ad un coprioggetto di plastica, tagliato a misura appropriata. E &#39;importante utilizzare una colla non tossica dei tessuti (usiamo VetBond ™ di 3M Corporation). Il coprioggetto è fissato nei media che scorre mettendo una goccia di grasso al silicone sulla parte inferiore del vetrino, poi aderendo questo alla base in vetro della camera di imaging. b. 2-Photon Imaging considerazioni: Diversi fattori possono causare linfociti per fermare in movimento: temperatura troppo alta o troppo bassa; potenza del laser in eccesso; compressione o altri danni ai linfonodi, e la mancanza di ossigeno. Danni dovuti ad eccessiva potenza del laser o temperature&gt; ~ 39 ° C è irreversibile. Se le cellule sono debole, che è meglio per aumentare il guadagno del rivelatore o la cella di etichettatura protocollo piuttosto che utilizzare un laser di potenza superiore per visualizzare le cellule. Ottimizzazione di etichettatura o espressione di proteine ​​fluorescenti può essere richiesto per portare la fluorescenza al di sopra del livello di autofluorescenza di fondo. Con guadagno ragionevole e le impostazioni di potenza del laser, circa un due di turno della fluorescenza di sopra del basale (misurato mediante citometria di flusso) è ragionevole per la visualizzazione della cella. Sintonizzabile con due fotoni laser, la lunghezza d&#39;onda utilizzata per l&#39;eccitazione dovrebbe essere un po &#39;meno del doppio del singolo fotone massima eccitazione del fluoroforo essere ripreso. In due-fotone esperimenti usando più di una etichetta o proteina fluorescente che può essere necessario sperimentare con la lunghezza d&#39;onda di eccitazione utilizzato per trovare le impostazioni ottimali per entrambe le etichette. Eccitazione a due fotoni può essere utilizzato anche per le strutture collagene endogeno immagine sfruttando le intrinseche blu generazione di seconda armonica. Generazione di seconda armonica (SHG) si verifica quando due fotoni si combinano all&#39;interno di un materiale ed emettere un singolo fotone del doppio della frequenza dei fotoni originale. Nel tessuto, a due fotoni di eccitazione si verifica quando la luce laser incidente è perpendicolare ad una struttura proteica altamente ordinata come il collagene. Questioni pratiche relative a due fotoni di imaging sono stati discussi in anteprima su 4, 5.

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

In questo protocollo video vi mostriamo le procedure per il trasferimento di cellule adottivi e nodo isolamento linfa e la preparazione necessaria per la motilità dei linfociti di imaging in un linfonodo periferico. Due fotoni di imaging ha diversi vantaggi rispetto di imaging confocale in entrambi i tessuti espiantati (qui) e nei preparati intravitale. In particolare, l&#39;uso di raggi infrarossi eccitazione riduce al minimo la dispersione della luce e permette l&#39;imaging con ~ 300 micrometri sotto la capsula del linfonodo e più profondo in alcuni tessuti 4. Inoltre, multi-fotone di eccitazione è limitato al punto focale dell&#39;obiettivo, riducendo al minimo lo sbiancamento foto e danni ai tessuti da parte del piano focale. Come per ogni nuova tecnica, invece, a due fotoni imaging non è una panacea e suoi limiti e le insidie ​​potenziali devono essere tenuti a mente 5. Tra questi è il requisito che - ad eccezione dei segnali intrinseci quali di seconda generazione armonica di collagene le cellule di interesse devono essere marcate con sonde estrinseci o per espressione di proteine ​​fluorescenti. L&#39;impressione è così creato che queste cellule marcate sono il nuoto in un vuoto nero e che in realtà sono immersi in, e interagire con un ambiente complesso di elementi strutturali e una miriade di altri senza etichetta, le cellule invisibili. Nei sei anni dall&#39;introduzione di due fotoni di imaging per l&#39;immunologia, questa tecnica ha permesso ai ricercatori di affrontare annose domande da visualizzare direttamente nei processi intatti i tessuti viventi compresi interazioni cellula-cellula, la motilità cellulare e la localizzazione, vie di segnalazione cellulare e cellule citotossiche uccidendo eventi. Il campo si è rapidamente evoluta al di là iniziale descrizioni fenomenologiche, e le analisi quantitative con modelli al computer e simulazione stanno iniziando a dare un senso di come i movimenti apparentemente caotici cellulare e le interazioni all&#39;interno di linfonodi portare ad una risposta immunitaria efficace. Questo progresso è a un riesame in una recente pubblicazione 1, che elenca oltre 100 articoli che descrivono l&#39;applicazione della microscopia a due fotoni per immunoimaging.

dissezione e 2-photon imaging di linfonodi periferici nei topi

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Due fotoni di imaging ha rivelato una coreografia elegante della motilità e interazioni cellulari all&#39;interno del linfonodo in condizioni basali e l&#39;avvio di una risposta immunitaria 1. Qui, vi presentiamo i metodi per il trasferimento adottivo di cellule T etichettati, l&#39;isolamento dei linfonodi, e la motilità imaging di cellule T CD4 + nel linfonodo espiantati come descritto per primo nel 2002 2. Immagini a due fotoni di cellule immunitarie richiede che le cellule sono marcate, sia per colorazione con un colorante inseguitore cellulare o esprimendo una proteina fluorescente. Dimostriamo la procedura di trasferimento adottivo di cellule derivate da topi iniettando donatore nella vena della coda di un animale destinatario, dove hanno sede gli organi linfoidi in circa 15-30 min. Illustriamo l&#39;isolamento di un linfonodo e descrivono metodi per assicurare un corretto montaggio del linfonodo asportato. Altre considerazioni, quali una corretta ossigenazione dei media perfuso, la temperatura e potenza del laser sono discussi. Infine, vi presentiamo le immagini video in 3D di CD4 + cellule T naive espositrici motilità allo stato stazionario a 37 ° C.

Due fotoni di imaging ha scoperto la motilità dei linfociti e interazioni cellulari all&#39;interno del linfonodo in condizioni basali e durante una risposta immunitaria 1. In questo studio dimostriamo trasferimento adottivo di cellule T, l&#39;isolamento dei linfonodi, e la motilità imaging di cellule T CD4 + nel linfonodo espiantati.

Dissezione e 2-Photon Imaging di linfonodi periferici nei topi

L'imaging a due fotoni ha rivelato un'elegante coreografia di motilità e interazioni cellulari all'interno del linfonodo in condizioni basali e durante la...

Ciao, mi chiamo Melanie Matthew. Sono del laboratorio di Micah Helen presso l'Università della California di Irvine. Oggi preleveremo i linfonodi da un topo allo scopo di effettuare un'immagine fotonica in situ.Questo prevede la rimozione dei linfonodi inguinali, dei linfonodi ascellari e dei linfonodi cervicali. I sei linfonodi periferici facilmente accessibili in un topo per ottenere cellule fluorescenti nei linfonodi del topo. Per effettuare l'immagine mediante imaging a due fotoni, dobbiamo prima eseguire il trasferimento adottivo di cellule marcate con fluorescenza.Per questo esperimento, vi mostrerò innanzitutto il trasferimento adottivo. Ecco la nostra siringa per insulina da 28 gauge. La riempirò con alcune cellule.Per prima cosa voglio svasare la siringa in modo che scorra facilmente. Caricherò con attenzione le cellule, cercando di non toccare i lati del tubo con la siringa da insulina, poiché ciò potrebbe smussare l'ago rendendo più difficile l'iniezione nella vena della coda del topo.Se ci sono bolle d'aria, è necessario rimuoverle, in modo da eliminarle. Toglierle con dei colpetti qui. Così va bene.Ora siamo pronti per iniettare queste cellule nella vena della coda. Ok, ecco il nostro topo C57 black six. Lo inseriremo lentamente e delicatamente nel dispositivo per iniezioni nella vena della coda.Molti topi non gradiscono questa operazione, ma ciò impedisce loro di saltare durante l'iniezione vera e propria, evitando ulteriori lesioni a loro o possibili punture di ago a voi. Quindi, inserite con molta calma il topo all'interno. Ora cercate la vena della coda lungo i lati della coda del topo.Perciò una grossa arteria corre lungo la parte superiore. E poi su entrambi i lati della coda del topo, ci sono due belle vene lunghe, che arrivano fino alla punta.Prendete quindi il vostro ago e iniziate dalla parte bassa della coda, cercando una vena. Vedo chiaramente qui, c'è una vena. La inumidirò appena con etanolo, in modo da renderla più visibile.Ora procederemo con l'iniezione nella vena della coda e sarà importante mantenere il becco dell'ago rivolto verso l'alto, cioè con l'estremità aperta dell'ago verso l'alto. L'ago dovrà essere mosso in modo quasi parallelo alla coda.Non si vuole inserire con un angolo perché le vene sono proprio in superficie. Si desidera semplicemente far scivolare lentamente l'ago nella vena della coda. E mentre lo si fa, con un po' di esperienza in più, si dovrebbe essere in grado di percepire quando entra.Ma le prime volte si vuole spingere il liquido e verificare se c'è una certa resistenza. Se non c'è resistenza, si è nella vena della coda e si può effettuare un'iniezione rapida e semplice, come quella che ho appena fatto. Successivamente, è possibile estrarre lentamente l'ago.Un’ulteriore conferma che si è all’interno della vena è la comparsa di una piccola goccia di sangue dovuta al reflusso. Pertanto, la presenza di un leggero reflusso di sangue che fuoriesce dal sito di iniezione conferma in modo certo che si è raggiunta la vena della coda. Inoltre, il topo dovrebbe smettere di sanguinare poco dopo l’iniezione.Ok, questo è il nostro topo nero sei. Procederemo a rimuovere i linfonodi del topo dalle regioni inguinali laterali, che si trovano qui, qui sotto l'ascella, dove si trovano i linfonodi ascellari, e qui sull'altro lato. Quindi i linfonodi cervicali superficiali, che si trovano qui in alto nel collo, uno per ciascun lato.Ciao. Ora siamo pronti per dissezionare il nostro topo. Comincerò fissando il topo al piano, qui sulla tavola da dissezione. Procediamo semplicemente fissando le zampe. Sì.È necessario assicurarsi che il fissaggio con spilli sia sicuro. Questo ci permetterà di esporre meglio i linfonodi periferici. Di solito fisso semplicemente tutte e quattro le zampe al piano di lavoro.Non mi preoccupo della coda. Ad alcune persone piace pinzare anche la coda. Per evitare che il pelo entri nella zona in cui stiamo effettuando la dissezione e si diffonda sui linfonodi e sugli strumenti, spruzziamo il topo con etanolo al 70%.Ora che il topo è stato anestetizzato con etanolo, eseguirò un'incisione mediana. Per farlo, allontano il pelo dal corpo. Come si può vedere, sollevo la pelle e la sollevo formando una piccola tenda.E questo ti impedirà di tagliare il peritoneo, cosa che in questo caso non vuoi fare. Ok, quindi inizierò con un'incisione mediana qui in alto. Eseguo un piccolo taglio e mi assicuro di non aver raggiunto il peritoneo.Si può vedere che c'è il peritoneo al di sotto. Faccio scivolare la forbice al di sotto dell'incisione e lentamente procedo separando la pelle dal peritoneo, effettuando piccole incisioni man mano che avanzo, poiché andremo a prelevare i linfonodi cervicali. Procederò con attenzione fino alla linea della mascella del topo, lentamente, assicurandomi di non danneggiare vasi sanguigni importanti.E poiché stiamo prelevando i linfonodi inguinali, che si trovano nella parte inferiore del lembo cutaneo, eseguirò un'incisione mediana fino alla base della coda. Ecco fatto. Abbiamo un'incisione mediana che andrà bene per le nostre esigenze.Ora procederò a separare la pelle dal peritoneo. Farò ciò delicatamente con una pinzetta, staccando la pelle dal peritoneo man mano che avanzo. E sto esponendo il primo linfonodo che andremo a dissezionare.Questo è il linfonodo inguinale qui nella parte inferiore del lembo cutaneo. Ora che ho sollevato un lembo cutaneo dal corpo principale del topo, lo fisserò per esporre il linfonodo inguinale. Questa è un'esposizione migliore del linfonodo inguinale, che ci permetterà di dissezionarlo in modo pulito.Quindi, qui abbiamo il linfonodo inguinale esposto dopo il fissaggio. Si trova tipicamente nel lembo cutaneo, proprio sopra la gamba. Può essere individuato osservando la biforcazione a forma di Y dei vasi sanguigni che si trovano al di sopra di esso.Eccolo qui. È ripiegato con un po' di tessuto adiposo e i vasi sanguigni che corrono sulla sommità. Bene, ora rimuoverò il linfonodo inguinale.Faccio scorrere le pinzette lungo entrambi i lati del linfonodo per staccarlo dal tessuto adiposo. Non vogliamo alcun grasso. Con la nostra imaging a due fotoni, questo ostacolerebbe la penetrazione del laser nel tessuto.Vediamo. È importante rimuovere con attenzione tutto il tessuto adiposo dal linfonodo, mantenendo al contempo intatta la corteccia del linfonodo. Bene, così va bene.Ecco il nostro linfonodo di iena. Lo metterò nel nostro mezzo; un buon modo per capire se avete rimosso tutto il grasso è osservare se il linfonodo affonda. Una volta immerso nel mezzo, scenderà direttamente sul fondo.Se è presente del grasso, galleggerà. Bene, ora procederò a rimuovere il linfonodo ausiliario. Si trova nell'ascella del topo, proprio lungo un vaso sanguigno principale.Quindi a volte può essere complicato perché si può verificare un notevole sanguinamento che oscurerà il nodo. Ma vi mostrerò quello che faccio e speriamo che questa volta non ci sia sanguinamento. Per prima cosa, allargo il lembo cutaneo e successivamente allargo l'avambraccio vicino al nodo che desidero prelevare.Questo mi permette di staccare la pelle con maggiore destrezza usando le dita, ma tenendo fermo questo muscolo che si estende sopra l'ascella, che dovrebbe fuoriuscire insieme a un linfonodo ascellare con un leggero strappo. E ora lo cercherò. Ed eccolo qua.È proprio lì, nell'ascella, lungo un vaso sanguigno principale. Ora procederò all'escissione del linfonodo ascellare e potete risistemare la pelle con dei perni oppure trattenerla con le dita, a seconda di ciò che vi risulta più comodo. Tuttavia, preferisco lavorare con molta attenzione in questa fase.C'è molto poca adiposità intorno a questo linfonodo, il che lo rende adatto all'imaging, ma si trova vicino a un vaso sanguigno importante, quindi a volte si possono perdere se non si è attenti. Per il linfonodo ascellare, afferro il tessuto connettivo circostante e lo stacco lentamente dai vasi sanguigni. Ecco fatto, ci siamo.Ecco il nostro linfonodo ascellare. È proprio qui. È un bel linfonodo lungo e piatto.E sto afferrando una piccola quantità di tessuto connettivo residuo sul lato del linfonodo, in modo da non danneggiare il linfonodo stesso. Procederemo con l'imaging per mantenere i linfonodi idratati. Prima di effettuare l'imaging istituzionale, li posizioniamo in un mezzo indipendente dal CO2 in camere individuali, in modo da poter identificare i linfonodi inguinali, ascellari e cervicali.Il modo per capire se si è eseguita correttamente la preparazione del linfonodo è osservare se, dopo l'escissione, affonda sul fondo. Ciò significa che il linfonodo contiene pochissimo tessuto adiposo. Ora procederò a rimuovere il linfonodo cervicale, quello cervicale superficiale.E faccio così: ricomincio dal punto in cui ho rimosso il linfonodo ascellare, esponendo un po' meglio il tessuto cervicale. I linfonodi cervicali si trovano vicino ai muscoli della mascella del topo, precisamente lungo il lato.Sono gli stessi linfonodi che si possono percepire quando si è malati. Sono quelli qui che il medico palpa in caso di raffreddore. Per fare ciò, di solito infilo il dito sotto il tessuto per tirarlo leggermente in avanti mentre passo la pinza lungo il lato.Dovrebbe esserci un linfonodo che sporge. Oh, eccolo. È lì nel tessuto.Ecco qui. Quindi qui c'è un linfonodo cervicale superficiale. Bisogna fare attenzione a non asportare le ghiandole salivari.Non troverai alcuna cellula T nelle tue ghiandole salivari. E questi particolari linfonodi contengono cellule T positive per CD4 marcate con CFSC. Quindi ti mostreremo alcuni video in situ di queste cellule T in movimento all'interno del tessuto.Ok, ora incollerò il linfonodo su un'asticella di plastica infrangibile, in modo da fissarlo sul fondo della nostra camera per imaging in situ. In questo modo eviteremo movimenti del tessuto o deriva durante l'acquisizione delle immagini delle cellule T. Ho qui le mie asticelle di plastica infrangibili.La prima cosa che farò è tagliare uno di essi alle dimensioni adatte per il nostro linfonodo. Quindi prendo le forbici e taglio un piccolo quadrato qui. Bene, ora applicherò della colla sulla superficie.È un po' di colla. Spargerla sulla sezione del vetrino che abbiamo tagliato. Poi prenderò un fazzoletto di carta kim e assorbirò parte della colla.Questa è una colla che ricoprirà il nodo. Vogliamo soltanto uno strato molto sottile in modo da non ostacolare l'imaging. Successivamente, preleverò un linfonodo dalla soluzione.Cominceremo quindi con il nostro primo linfonodo qui dalla regione mediale. È importante essere delicati in questa fase. Non si deve danneggiare la corteccia del linfonodo.Prenderò solo l'angolo del linfonodo e lo incollerò al vetrino toccando delicatamente con l'angolo del linfonodo prima il vetrino e poi trascinando il linfonodo lungo il vetrino, fissandolo saldamente. Per fare ciò, ho utilizzato questa piccola quantità di tessuto adiposo rimasta sul margine del linfonodo. In questo modo, non altero effettivamente la corteccia del linfonodo.Prendo quindi il linfonodo e, per indurire la colla, lo immergo nello stesso pozzetto da cui l'ho prelevato. Lo giro a testa in giù e lo immerge delicatamente nel mezzo, trasportando tutta la colla. Rimuovo un po' della colla eccessiva che si è indurita insieme ad esso.Ecco fatto. Ora abbiamo un linfonodo preparato per l'imaging a due fotoni. Questo è il modo in cui si preparano i linfonodi per l'imaging a due fotoni in situ.Ora li porteremo al nostro microscopio, lo prepareremo e otterremo ottime immagini delle cellule T che abbiamo trasferito in modo adottivo. Qui abbiamo cellule T marcate con CFSE che si muovono all'interno di un linfonodo inguinale. Questo video è accelerato di circa 500 volte e si può notare che le cellule sono altamente mobili.Sono ingranditi di circa 20x con il nostro obiettivo a immersione in acqua da 20x. Questo è solo un esempio di movimento dei linfociti T. Non abbiamo effettuato alcuna colorazione sulle cellule circostanti.Di solito, in esperimenti più avanzati con due fotoni, è possibile osservare cellule dendritiche colorate, cellule B colorate, cellule T che interagiscono con cellule NK colorate. È possibile etichettare quasi qualsiasi tipo di cellula che ci si aspetta di trovare all'interno del linfonodo ed eseguirne l'immagine. Questo conclude il nostro protocollo di imaging del linfonodo presso l'istituto.

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Viene presentato un protocollo che combina la compensazione dei tessuti con la microscopia a fluorescenza del foglio di luce (LSFM) per ottenere immagini a risoluzione tridimensionale e cellulare dei vasi linfatici e dei linfonodi (LN) che raccolgono il liquido cerebrospinale (CSF) e il fluido epidurale spinale.

Imaging tridimensionale della vascolatura e del drenaggio linfatico vertebrale utilizzandoiDISCO e microscopia a fluorescenza del foglio di luce

Il manoscritto dimostra un metodo innovativo per lo studio in vivo della contrattilità dei vasi linfatici cervicali e del flusso linfatico nei topi, per testare varie funzioni fisiologiche dei vasi linfatici cervicali (cLV) e le strategie terapeutiche per la modulazione dei meccanismi regolatori linfatici di drenaggio e liberazione cerebrale.

Configurazione riproducibile per l'imaging a due fotoni in vivo della contrattibilità dei vasi linfatici cervicali e del flusso linfatico nei topi

Qui viene presentato un protocollo per valutare i vasi linfatici meningei (MLV) dei muri, che svolgono un ruolo importante in molteplici malattie neurologiche. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo integrato che consenta sia la valutazione funzionale del drenaggio dei tracce sia la caratterizzazione morfologica dettagliata della rete di MLV dorsali.

Protocollo integrato per la valutazione dei linfatici meningei: iniezione di cisterna magna, imaging dei linfonodi, dissezione meningea e colorazione dell'intero montaggio

Impara la dissezione dei linfonodi periferici nei topi e l'imaging a due fotoni per studiare la motilità delle cellule T CD4+. Questo metodo consente di visualizzare le dinamiche delle interazioni linfocitarie in vivo.

Dissezione e 2-Photon Imaging di linfonodi periferici nei topi

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