Name: Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Scopri l'etichettatura stirpe cellulare in embrioni di Danio rerio mediante fluoresceina ingabbiata e laser UV. Questo metodo consente di tracciare il destino cellulare in vivo con microscopia immunofluorescente multicolore.

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Vorremmo ringraziare Dan Carlin per un aiuto nel fare fluoresceina in gabbia. Inoltre vorremmo ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Vanderbilt University Medical School di programma per Grant Developmental Biology di formazione per JAC, e NIH HD054534to JTG.

1. Sintesi di Caged Fluoresceina Destrano <ol><li> Misurare 3,5-4 mg di aminodextran e aggiungere nel Invitrogen fornito tubo colorato contenente 1 mg di CMNB-gabbia fluoresceina SE. Nelle nostre mani, questo rapporto dà un carico medio di circa 2,5 molecole di colorante per destrano. </li><li> Aggiungere 500 ml di 0,1 M Na 2 B 4 O 7 tampone (borato di sodio) al tubo. </li><li> Cap e vortex per 30 secondi per sciogliere il aminodextran e fluoresceina in gabbia. </li><li> Lasciare reagire durante la notte su un miscelatore vortex. </li><li> Svitare la chiusura in basso su una colonna di spin Zeba e allentare il tappo. Segna un punto sulla colonna con un pennarello. Mettere in una colonna da 15 ml tubo conico. </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 2 minuti con il punto di fronte al centro del rotore. Usa colonna immediatamente dopo la compattazione. </li><li> Luogo colonna compattato in un nuovo tubo da 15 ml conica. </li><li> Piscina miscela di reazione e trasferimento al centro del letto compattato resina colonna. Sostituire il tappo. </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 2 minuti con il punto di fronte al centro del rotore. A seguito del conferimento, l'eluente e la parte superiore della colonna sarà quasi la stessa tonalità di colore giallo. </li><li> Trasferire il eluente giallo (~ 350 mL) a 1,5 mL provetta. </li><li> Liofilizzare a secco in un speedvac. Coprire il speedvac con un foglio. </li><li> Risospendere il conseguente ~ 2-3 mg di pallido schiuma gialla in acqua ad una concentrazione finale di 1% w / v. </li><li> Conservare questa soluzione a -20 ° C in un foglio coperto di tubi. E 'una buona idea per la soluzione di destrano aliquota per evitare ripetitivi congelamento-scongelamento. </li></ol> 2. L'iniezione di fluorescina Caged Destrano in embrioni Zebrafish <ol><li> Diluire 1% w / v punto della gabbia fluoresceina destrano 1:05 o 1:10 in KCl 0,2 M. </li><li> Iniettare 0,5 - 1.0nL della soluzione di fluoresceina in gabbia nel tuorlo delle cellule di embrioni uno stadio con una pressione di iniezione. Una volta iniettato, frizioni degli embrioni devono essere conservati al buio a 28,5 ° C per ridurre non specifici uncaging. </li><li> Rimuovere manualmente chorions da embrioni. </li><li> Anestetizzare gli embrioni nel 4% tricaine. </li><li> Gli embrioni saranno montati nello 0,8% di agarosio in piatto 35mmx10mm Petri, poi coperta con acqua uovo. </li><li> Equilibrare fuso agarosio in 50 blocchi ° C Calore per almeno 15 minuti. </li><li> Utilizzando una pipetta di vetro, elaborare un embrione in una quantità minima di acqua e rilasciarla nella Nota di agarosio:. E 'importante per raffreddare il tubo di agarosio in mano per circa 30 secondi prima di mettere l'embrione nel tubo per evitare uccidendo l'embrione. </li><li> Pipetta l'embrione dal tubo, insieme a circa 50μL di agarosio ed espellere il contenuto sul centro della capsula di Petri. </li><li> Rapidamente orientare l'embrione utilizzando un filo di plastica con le celle da Uncaged rivolto verso l'alto. Nota: Il agarosio con raffreddare rapidamente in modo da essere precipitoso con orientare l'embrione. Gli embrioni possono essere danneggiati se manipolato dopo l'agarosio diventa rigida. </li><li> Lasciare che il agarosio solidificare completamente (l'operazione richiede pochi minuti) e riempire i due terzi piatto pieno di acqua uovo contenente 4% e 0,003% tricaine PTU. </li></ol> 3. Laser Uncaging di Fluoresceina Destrano <ol><li> Il microscopio usato per uncaging deve avere un obiettivo 40X immersione in acqua. </li><li> Usiamo un Photonics strumenti laser con cella di 365 nm colorante e il 70% / 30% diviso specchio dicroico. </li><li> Prima uncaging, il laser deve essere fatta parafocale con l'obiettivo e attenuato alla potenza adeguata. </li><li> Per mettere a fuoco il laser, posto un vetrino specchio sotto l'obiettivo e mettere a fuoco l'obiettivo fino a graffi nella diapositiva sono visibili. </li><li> Regolare laser attenuatore fino a quando il laser in grado di produrre un graffio ben visibile nello specchio con un singolo impulso. </li><li> Regolare il fuoco dell'obiettivo su e giù. Se il laser in grado di produrre un graffio quando l'obiettivo è a fuoco, regolare il fuoco del laser a ¼ di giro verso l'alto o verso il basso. Ripetere fino a quando il laser può graffiare lo specchio solo quando l'obiettivo è a fuoco. </li><li> Luogo montato embrione nel quadro dell'obiettivo e mettere a fuoco l'area da Uncaged. </li><li> Per uncage, focus su una cella di interesse e di impulso è 10-20 volte a 2-3 Hz. </li><li> Dopo uncaging, libero il bimbo con peeling agarosio via con una pinza e di metterli in acqua uovo contenente 0,003% PTU. Lasciate che gli embrioni si sviluppano in un box a tenuta di luce fino a che non sono fissi. </li></ol> 4. Etichettatura e di rilevamento degli anticorpi di Uncaged Fluoresceina Destrano <ol><li> Fissare gli embrioni in Ab fissativo (4% paraformaldeide, 0.3MM CaCl 2, 8% di saccarosio, fosfato 1X Soluzione salina tamponata, pH 7.3) per 2-4 ore a temperatura ambiente (RT) o di notte (O / N) a 4 ° C. Mantenere gli embrioni in una scatola di luce stretto o imballati in pellicola tubo per tutte le fasi di etichettatura. </li><li> Rimuovere fissativo e sostituire con il 100% MeOH, lasciare per 10 minuti a RT, rimuovere MeOH e sostituce fresca MeOH 100%. </li><li> Conservare in MeOH a -20 ° C per almeno 30 minuti. Nota: È possibile memorizzare in MeOH per un massimo di due settimane prima di epitopi cominciano a degradare. </li><li> Reidratare embrioni con 5 lavaggi minuto a RT del 75% fosfato MeOH/1X soluzione salina tamponata con 0,1% di Tween 20 (1X PBSTw), poi 1XPBTw 50% MeOH/50%, poi 25% MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li> Lavare tre volte per 5 minuti in 1XPBSTw. </li><li> Se gli embrioni sono&gt; 24 ore di vita, permiabilize embrioni con 10 mg / ml proteinasi K in 1XPBSTw. Tempo Permiabilization dipende sul palco. Cinque minuti in proteinasi K è sufficiente se gli embrioni sono tra 24 e 48 ore dopo la fecondazione (HPF). Più tempo può essere richiesto se per gli anziani larve. Ri-fix in Ab fissativo per 20 minuti a RT </li><li> Lavare cinque volte per 5 minuti in 1XPBSTw a temperatura ambiente. </li><li> Incubare in soluzione di blocco (1XPBS, x100 Triton 0,1%, 10% di siero di pecora, 10% di siero bovino albume, 1% Dimetilsolfossido) per 1-2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Diluire gli anticorpi primari (anti-fluoresceina più anticorpi contro specifici marcatori di cellule-tipo) a bloccare soluzione. </li><li> Embrioni incubare O / N a 4 ° C in una soluzione contenente anticorpi primari. </li><li> Lavare quattro volte per 20 minuti in 1XPhosphate Soluzione salina tamponata con x100 Triton 0,1% (PBSTx) a temperatura ambiente. </li><li> Diluire fluorescenza marcata con anticorpi secondari (di solito 1:300) in soluzione di blocco. </li><li> Incubare O / N a 4 ° C in una soluzione contenente anticorpi secondari. </li><li> Lavare quattro volte per 20 minuti in 1XPBSTx a temperatura ambiente. </li><li> Embrioni in chiaro 1XPBS 50% glycerol/50% per almeno due ore a temperatura ambiente, quindi rimuovere glicerolo / PBS miscela e aggiungere 100% glicerolo e lasciate riposare O / N a 4 ° C. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Dopo immunomarcatura, ci dovrebbe essere un'area arricchita di colorazione nelle cellule che sono state Uncaged (Figure.1). Non è raro vedere un segnale relativamente alto rapporto rumore&gt; 48 zebrafish ora vecchi, a causa di uncaging spontanea della fluoresceina. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Etichettatura Lineage del complesso zebrafish pineale. A 24 HPF, una parte del anlage anteriore pineale, indicata da foxd3:. Espressione GFP, è stato Uncaged utilizzando impulsi laser UV A) Con 48hpf, un lato sinistro ammasso di cellule chiamato parapineal (cerchio rosso) è emerso dalla Uncaged dominio (cerchio bianco). B) Uncaged segnale fluoresceina è arricchito in parapineal (cerchio rosso) e l'organo pineale (cerchio bianco).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
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<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Come descritto, questo protocollo fornisce un metodo relativamente rapido etichettatura lignaggio in zebrafish che si basa su delle tecniche comunemente usate di microiniezione, microscopia, ed immunofluorescenza. Abbiamo scoperto che il laser uncaging essere il modo più efficiente ed economica per uncage fluoresceina in maniera localizzata. Questo metodo potrebbe essere usato per etichettare lignaggio con endpoint sperimentale non più tardi di 4 dpf. Tuttavia, come le cellule si dividono, la gabbia-fluoresceina concent...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-fluoresceina SE caging</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodestrano, 10 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Colonne spin per desalificazione Zeba</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo caprone anti-fluoresceina</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo asino Alexa Fluor 633 anti-caprone</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 35 mm x 10 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio composto eretto con obiettivo a immersione in acqua 40x</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema manuale di illuminazione laser MicroPoint</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feniltiourea (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>Filo di plastica</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Mixer vortex</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector a pressione</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

etichettatura stirpe di cellule zebrafish con laser uncagable fluoresceina destrano

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Un problema centrale in biologia dello sviluppo è quello di dedurre l&#39;origine della miriade di tipi di cellule presenti nei vertebrati che si presentano dai precursori indifferenziati. I ricercatori hanno utilizzato vari metodi di etichettatura lignaggio, come ad esempio l&#39;etichettatura DII 1 e pressione di iniezione di enzimi tracciabili 2 per il destino della cellula accertare nelle fasi successive di sviluppo in sistemi modello. Le mappe destino primo pesce zebra (Danio rerio) sono state assemblate mediante iniezione iontoforetica di coloranti fluorescenti, come destrano rodamina, in celle singole in regioni discrete dell&#39;embrione e tracciare il destino della cellula etichettata nel tempo 3-5. Anche se efficaci, questi metodi sono tecnicamente impegnativi e richiedono attrezzature specializzate non si trovano comunemente nei laboratori di zebrafish. Recentemente, photoconvertable proteine ​​fluorescenti, come Eos e Kaede, che irreversibilmente passare da verde a fluorescenza rossa quando esposta alla luce ultravioletta, stiamo vedendo un maggior uso in zebrafish 6-8. La chiarezza ottica dell&#39;embrione pesce zebra e la relativa facilità della transgenesi hanno reso questi strumenti particolarmente interessanti per l&#39;etichettatura di lignaggio e di osservare la migrazione delle cellule in vivo 7. Nonostante la loro utilità, queste proteine ​​hanno alcuni svantaggi rispetto ai metodi lignaggio dye-mediata etichettatura. Il più importante è la difficoltà che abbiamo trovato per ottenere 3-D ad alta risoluzione durante fotoconversione di queste proteine. In questa luce, forse la migliore combinazione di risoluzione e facilità d&#39;uso per l&#39;etichettatura lignaggio in zebrafish si avvale della gabbia fluoresceina destrano, un colorante fluorescente che è associato a un gruppo di tempra, che maschera la sua fluorescenza 9. Il colorante può essere &quot;Uncaged&quot; (uscito dal gruppo tempra) all&#39;interno di una cella specifica usando la luce UV di una lampada laser o mercurio, consentendo la visualizzazione della sua fluorescenza o immunolocalizzazione. A differenza dei metodi iontoforesi, fluoresceina in gabbia possono essere iniettati con apparati di iniezione standard e Uncaged con un microscopio a epifluorescenza dotato di un foro stenopeico 10. Inoltre, gli anticorpi contro la fluoresceina rilevare solo la forma Uncaged, e la fissazione epitopo sopravvive ben 11. Infine, fluoresceina in gabbia può essere attivato con altissima risoluzione in 3-D, soprattutto se la microscopia a due fotoni è impiegata 12,13. Questo protocollo descrive un metodo di etichettatura lignaggio di fluoresceina in gabbia e uncaging laser. Subsequenctly, Uncaged fluoresceina viene rilevato in contemporanea con altri epitopi come GFP, mediante l&#39;etichettatura con gli anticorpi.

Questo protocollo delinea un modo per etichettare e tracciare il destino dei piccoli gruppi di cellule di embrioni di zebrafish con UV-uncaging della fluoresceina in gabbia, seguita da montare tutto immunomarcatura per amplificare il segnale proveniente dal fluoresceina Uncaged.

Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano

Un problema centrale della biologia dello sviluppo consiste nel dedurre l'origine delle miriadi di tipi cellulari presenti nei vertebrati mentre questi derivano da cellule indifferenziate...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare le linee cellulari in un embrione di pesce zebra. Questo viene ottenuto innanzitutto sintetizzando fluoresceina caging e iniettandola negli embrioni di pesce zebra. Gli embrioni vengono quindi montati in agarosio in modo che le cellule da etichettare siano accessibili.Successivamente, un laser UV viene utilizzato per attivare la fluoresceina caging in cellule selezionate dell'embrione. Infine, gli embrioni vengono raccolti dopo aver raggiunto lo stadio desiderato e le cellule marcate vengono rilevate in relazione ai marcatori di particolari linee cellulari. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il destino delle cellule selezionate negli embrioni mediante microscopia foto-decapante e immunofluorescenza.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come la fotoconversione del Cade, è che l'immunofluorescenza multicolore può rilevare il fluoresceina sbloccata oltre ad altri anticorpi specifici per marcatori cellulari. Per iniettare il dextrano di fluoresceina cagingato negli embrioni di pesce zebra, sintetizzarlo prima e preparare una soluzione al 1% in peso per volume. Aliquotare le scorte seguendo il protocollo scritto allegato.Successivamente, aliquota del diluente, da uno a cinque o da uno a dieci in cloruro di potassio 0,2 molare. Successivamente, iniettare da 0,5 a un nanolitro di soluzione di fluoresceina caging nell'uovo di embrioni allo stadio di una singola cellula. Dopo l'iniezione mediante un iniettore a pressione, i gruppi di embrioni devono essere mantenuti al buio a 28,5 gradi Celsius per ridurre l'uncaging non specifico al corretto stadio di sviluppo.Rimuovere manualmente la corion dagli embrioni, anestetizzare gli embrioni in trica al 4% per montare gli embrioni in equilibrio, 0,8% di aros fuso in un blocco riscaldante a 50 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Successivamente, raffreddare il tubo in mano per circa 30 secondi. Prima di aggiungere gli embrioni utilizzando una pipetta di vetro, aspirare un embrione con una quantità minima di acqua e rilasciarlo nell'aros. Pipettare l'embrione dal tubo insieme a circa 50 microlitri di aros ed espellere il contenuto al centro di una piastra di Petri da 35 millimetri per 10 millimetri.Utilizzando un filamento di plastica, orientare rapidamente l'embrione in modo che le cellule da sbloccare siano rivolte verso l'alto. Lasciare solidificare completamente l'aros e riempire la piastra. Riempire per due terzi con acqua per uova contenente 4% trica e 0,003% PTU, e mantenere gli embrioni in una scatola impermeabile alla luce fino allo sblocco.Per eseguire il laser on caging del dextrano marcato con fluoresceina, utilizzare un microscopio composto con un obiettivo ad immersione in acqua da 40x. Utilizziamo un laser a cella di colorante da 365 nanometri di Photonics Instruments e uno specchio dicotroico con divisione 70%30% prima dell'uncaging. Il laser deve essere reso parfocale con l'obiettivo e attenuato alla potenza appropriata per focalizzare il fascio laser.Posizionare un vetrino a specchio sotto l'obiettivo e mettere a fuoco l'obiettivo finché non risultano visibili i graffi sul vetrino. Regolare l'attenuatore del laser finché il laser non produce un graffio chiaramente visibile sullo specchio con un singolo impulso, regolando contemporaneamente il fuoco dell'obiettivo su e giù. Se il laser è in grado di produrre un graffio quando l'obiettivo è fuori fuoco, regolare il fuoco del laser di un quarto.Aumentare o diminuire. Ripetere finché il laser non riesce a incidere lo specchio. Solo quando l'obiettivo è a fuoco, posizionare l'embrione montato sotto l'obiettivo e mettere a fuoco l'area da sbloccare per effettuare lo sblocco.Concentrarsi su una cellula di interesse e stimolarla da 10 a 20 volte a una frequenza di due-tre hertz. Dopo la fotoattivazione. Liberare l'embrione rimuovendo le membrane con pinzette e trasferirlo nell'acqua per uova contenente PTU allo 0,003%. Fissare gli embrioni nel fissativo per anticorpi da due a quattro ore a temperatura ambiente oppure tutta la notte a quattro gradi Celsius.Rimuovere il fissativo e sostituirlo con metanolo al 100%. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il metanolo e sostituirlo con metanolo fresco al 100%.Conservare gli embrioni in metanolo a meno 20 gradi Celsius per almeno 30 minuti. È possibile conservarli in metanolo fino a due settimane prima che gli epitopi inizino a degradare. Reidratare gli embrioni con lavaggi di cinque minuti a temperatura ambiente di 75% metanolo, 25% PBS al fosfato 1x con 0,1% tween 20; quindi 50% metanolo, 50% PBS 1x con tween 20; infine 25% metanolo, 75% PBS 1x con tween 20, lavando tre volte per cinque minuti in PBS 1x con tween 20.Se gli embrioni hanno più di 24 ore, permeabilizzarli con 10 microgrammi per millilitro di proteinasi K in XPBS con tween 20; il tempo di permeabilizzazione dipende dallo stadio dell'embrione. Cinque minuti in proteinasi K sono sufficienti.Se gli embrioni hanno un'età compresa tra 24 e 48 ore dalla fecondazione, potrebbe essere necessario più tempo per le larve più vecchie. Riffissare con un fissativo per anticorpi per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli embrioni cinque volte per cinque minuti ciascuna in PBS-X con Tween 20 al 1% a temperatura ambiente.Quindi, incubare in soluzione bloccante per uno o due ore a temperatura ambiente. Diluire gli anticorpi primari nella soluzione bloccante. Successivamente, incubare gli embrioni tutta la notte a quattro gradi Celsius in una soluzione contenente gli anticorpi primari; la mattina seguente lavare gli embrioni quattro volte in XPBS 1× con Triton X-100, quindi diluire gli anticorpi secondari marcati con fluorocromo nella soluzione bloccante.Incubare gli embrioni tutta la notte a quattro gradi Celsius in una soluzione contenente anticorpi secondari. Dopo aver lavato quattro volte in XPBS con Triton X-100, chiarire gli embrioni in una soluzione di 50% glicerolo e 50% XPBS per almeno due ore a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la miscela di glicerolo e PBS e aggiungere glicerolo al 100%; incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius.I risultati rappresentativi per larve di controllo e larve sottoposte a foto-sblocco sono mostrati sotto forma di proiezioni confocali. Gli embrioni di controllo sono stati iniettati con fluoresceina caginggata ma non sono stati sottoposti a foto-sblocco a 48 ore dalla fecondazione. L'embrione di controllo mostra un'etichettatura con GFP nel complesso pineale.Alcune etichettature di fondo puntiformi, ma non è rilevabile alcun accumulo localizzato di fluoresceina marcata. Negli embrioni in cui è stata rimossa la protezione fotochemica, si osserva un chiaro accumulo di fluoresceina deprotetta in alcune delle cellule marcate con GFP. Queste sono le discendenti delle cellule bersagliate mediante l'attivazione fotochimica della protezione 24 ore prima, con alcune modifiche minori.Questa procedura può essere utilizzata per etichettare la linea cellulare di quasi ogni tessuto nell'embrione di pesce zebra prima delle 48 ore post-fecondazione.

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Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

Funzione-Spacer-Lipid (FSL) costruisce permettere le caratteristiche della superficie delle cellule viventi e virioni essere modificate senza perdita di vitalità. Il metodo richiede solo semplice contatto di una soluzione di costruire una cella con FSL / virione e l'incorporazione superficie spontanea e stabile si verifica.

FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Le manipolazioni mirate per causare stress diretto o morte nelle singole cellule sono state relativamente difficili da realizzare. In questo articolo, viene descritto un approccio di ablazione con risoluzione di singole cellule per stressare e uccidere selettivamente singole cellule in coltura cellulare e animali viventi basato su un laser UV confocale standard.

Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Scopri l'etichettatura stirpe cellulare in embrioni di Danio rerio mediante fluoresceina ingabbiata e laser UV. Questo metodo consente di tracciare il destino cellulare in vivo con microscopia immunofluorescente multicolore.

Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano

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