L'induzione di anergia Alloantigen specifici nelle cellule mononucleari del sangue periferico di stimolazione Alloantigen con co-stimolatorie blocco del segnale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è attivare linfociti T del donatore specifici per l'alloantigene del ricevente mediante stimolazione ex vivo con alloantigeni del ricevente in presenza di anticorpi che bloccano la co-stimolazione delle cellule presentanti l'antigene nei linfociti T attraverso il loro recettore CD28. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto PBMC da due donatori sani diversi. Successivamente, si allestisce una coltura co-colturale allostimolante in massa incubando le popolazioni di PBMC incompatibili per HLA in presenza di anticorpi monoclonali contro i ligandi B7.1 e B7.2 per bloccare la stimolazione di CD28.

Successivamente, l'efficacia dell'allo-attivazione viene misurata mediante reazioni linfocitarie miste primarie e secondarie, o MLR. Infine, la specificità allo delle allo-attivazione viene valutata determinando le risposte verso soggetti estranei e quelle specifiche per il CMV. Si ottengono risultati che dimostrano come i linfociti T del donatore diventino iporesponsivi a stimolazioni successive con antigeni allo, mentre i linfociti T del donatore non reattivi verso antigeni allo rimangano intatti e funzionali.

Abbiamo impiegato con successo questa strategia in precedenti e attuali studi clinici pilota sull'infusione di cellule T allogeniche attivate durante e dopo il trapianto di cellule staminali con incompatibilità HLA, osservando un miglioramento nella ricostituzione immunitaria, un numero ridotto di infezioni e una malattia da trapianto contro l'ospite acuta e cronica meno grave rispetto ai controlli storici di riceventi sottoposti a trapianti allogenici non manipolati. Un vantaggio principale della strategia di allo anodizzazione è che gli effetti fuori bersaglio sono minimizzati, poiché la tecnica non riduce le risposte delle cellule T specifiche per patogeni o per antigeni associati ai tumori, né elimina le cellule T regolatorie CD4 dal pool di cellule T del donatore, dimostrando che la procedura sarà eseguita da Christine Vin, scienziata del nostro laboratorio. Il primo passo consiste nel prelevare sangue da due donatori volontari sani.

Le cellule di un donatore fungeranno da rispondenti e le cellule di un altro donatore fungeranno da stimolatrici. Successivamente, isolare i PBMC dal sangue mediante centrifugazione su gradiente di densità utilizzando Ficoll-Paque. Mescolare una piccola quantità di cellule con tripan blu e contare i PBMC vitali utilizzando il contaemocitometro.

Diluire i PBMC provenienti da ciascun donatore in 10 millilitri di mezzo di coltura completo, alla concentrazione di 1 milione di cellule vitali per millilitro, in provette coniche separate da 15 millilitri. Designare una provetta di PBMC del donatore come stimolatori e l'altra come risponditrici, per impostare la coltura co-colturale alloreattiva su larga scala.

Aggiungere 100 microgrammi di anticorpi anti B 7.1 e anti B 7.2 al tubo da 15 millilitri designato come stimolatore. Agitare delicatamente il tubo e incubare per 30 minuti; al termine del periodo di incubazione, irradiare i PBMC stimolatori e aggiungerli a un flacone per coltura cellulare T 25 da 50 centimetri cubi con tappo permeabile ai gas.

Etichettare la coltura bulk di cellule allo del donatore. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di PBMC del donatore in risposta, a una concentrazione di 1 milione per millilitro in mezzo completo, nel flacone. Aggiungere ulteriori 100 microgrammi di ciascuno degli anticorpi 7.1 e 7.2 al flacone e mescolare delicatamente prima di posizionare il flacone in posizione verticale in un incubatore per 72 ore.

Successivamente, irradiare altri 10 milioni di PBMC stimolatori per una coltura co-coltura di controllo bulk senza anticorpi bloccanti, quindi aggiungerli a un flacone per colture cellulari T25 da 50 centimetri cubi. Etichettare il flacone come coltura co-coltura di controllo bulk. Aggiungere 10 millilitri degli stessi PBMC risponditori utilizzati per la coltura co-coltura allo-stimolata bulk, a una concentrazione di 1 milione per millilitro in mezzo completo, al flacone e mescolare delicatamente prima di posizionare il flacone in posizione verticale in un incubatore per 72 ore.

Il passo successivo consiste nel misurare la funzione del pool di cellule T donatrici allo-attivate nello stesso giorno delle colture di coalizione; etichettare una piastra a 96 pozzetti con fondo a U per il MLR primario per ciascuno dei tre punti temporali da misurare. Quindi trasferire con decantazione 5 millilitri da ciascuna delle colture di controllo di massa e delle colture co-attivate allo in provette da 15 millilitri.

Successivamente, pipettare 200 microlitri di sospensione cellulare da ogni provetta in pozzi triplificati su ognuna delle tre piastre. Etichettare questi pozzi come "nessun blocco co-stimolatorio" o "nessun CSB" per le cellule provenienti dalle colture fredde di controllo bulk e "CSB" per le cellule provenienti dalle colture fredde bulk allo-attivanti. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno completo in sei pozzi su ogni piastra come controlli negativi.

Infine, aggiungere 200 microlitri di PBS in tutti i pozzetti vuoti per ridurre l'evaporazione e posizionare le piastre nell'incubatore 72 ore dopo l'allestimento delle colture co bulk; etichettare una piastra UBO 96 pozzetti MLR secondario per ciascuno dei tre punti temporali da misurare. Per preparare le cellule risponditrici per il MLR secondario, trasferire cinque millilitri da ciascuna delle colture co controllo bulk e allo stimolanti in provette da 15 millilitri e centrifugare le provette da cinque a dieci minuti a 2000 giri/min a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le cellule altre due volte aspirando con attenzione i supernatanti, disgregando i pellet, aggiungendo 10 millilitri di mezzo completo in ciascuna provetta e quindi centrifugando nuovamente le cellule dopo il secondo lavaggio.

Risospendere le cellule in un millilitro di terreno completo. Utilizzare la colorazione con blu di tripano per enumerare le cellule vitali e regolare la concentrazione cellulare a 1 milione di cellule risponditrici vitali per millilitro. Pipettare 100 microlitri di sospensione cellulare da ogni tubo in pozzetti triplificati di ciascuna piastra.

Etichettare questi pozzetti come stimolazione con cellule allogeniche di prima parte o lega FP. Quindi pipettare 100 microlitri di sospensione cellulare da ogni tubo in altri tre pozzetti su ciascuna piastra ed etichettare questi pozzetti come stimolazione CD3/28 di PBMC provenienti dallo stesso donatore utilizzato per fornire le cellule stimolatrici di prima parte per l’allogenico. Le colture co-stimolate attivate e quelle di controllo vengono utilizzate come cellule stimolatrici per il MLR secondario: sospendere 10 milioni di PBMC del donatore di prima parte a una concentrazione di 1 milione per millilitro e aggiungere radiazioni.

100 microlitri di cellule stimolatrici irradiate nei pozzetti etichettati come fp allo restimolazione su ogni piastra MLR secondaria. Per i controlli positivi, aggiungere un microlitro ciascuno di anticorpi monoclonali anti-CD3 e anti-CD28 e 98 microlitri di terreno completo nei pozzetti etichettati come stimolazione CD3-28 su ogni piastra MLR secondaria. Inoltre, aggiungere 200 microlitri di terreno completo in sei pozzetti vuoti su ogni piastra da utilizzare come controlli negativi e aggiungere 200 microlitri di PBS in tutti i pozzetti vuoti per ridurre l'evaporazione.

Posizionare le piastre nell'incubatore. Il passaggio successivo consiste nel misurare la specificità delle PBMC allo provenienti da un nuovo donatore sano, definito donatore di terza parte, che vengono utilizzate per testare la specificità del processo allo in un MLR secondario. Sospendere le PBMC del donatore di terza parte a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro e irradiare l'etichetta 3 96 mentre le piastre per il giorno tre, cinque e sette dell'MLR secondario per la specificità.

Per preparare le cellule risponditrici per il MLR secondario al fine di misurare la specificità, trasferire cinque millilitri da ciascuna delle colture co-bulk di controllo e delle colture co-bulk allo stimolanti in provette da 15 millilitri e centrifugare le provette da cinque a 10 minuti a 2000 giri al minuto. Quindi lavare le cellule due volte aspirando con attenzione i soprannati, risospendendo i pellet, aggiungendo 10 millilitri di terreno completo a ciascuna provetta e centrifugando nuovamente le cellule dopo il secondo lavaggio. Risospendere infine le cellule in un millilitro di terreno completo.

Utilizzare la colorazione con trian blu per contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare a 1 milione di cellule risponditrici vitali per millilitro, quindi pipettare 100 microlitri di sospensione cellulare da ogni tubo in pozzetti tripli su ciascuna piastra. Etichettare questi pozzetti come TP o stimolazione alloreattiva da terzo partecipante. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di cellule stimolatrici TP irradiate nei pozzetti etichettati come stimolazione alloreattiva TP.

Per ulteriori test sulla specificità delle risposte allo, si misurano le risposte ai patogeni dopo l'attivazione di PBMC provenienti da donatori con risposte proliferative precedentemente documentate verso CMV etichettare 3 piastre a 96 pozzetti M-L-R-C-M-V ai giorni tre, cinque e sette, e trasferire cinque millilitri da ciascuna delle colture di controllo bulk e delle colture allo-attivanti in provette da 15 millilitri. Successivamente, lavare, contare e risospendere le cellule a un milione per millilitro in terreno completo; pipettare 100 microlitri di sospensione cellulare da ogni provetta in tre pozzetti di ciascuna piastra, ed etichettare questi pozzetti come stimolazione CMV.

Quindi aggiungere 0,1 microlitri di lisato di CMV in 100 microlitri di terreno completo nei pozzetti etichettati come stimolazione con CMV. Aggiungere quindi 200 microlitri di terreno completo in sei pozzetti per ogni piastra come controlli negativi. Infine, aggiungere 200 microlitri di PBS in tutti i pozzetti vuoti per ridurre l'evaporazione e posizionare le piastre nell'incubatore per misurare la proliferazione nel MLR primario e secondario.

Aggiungere un microcurie di timidina triziata ai pozzetti del controllo negativo e a quelli contenenti cellule, 16 ore prima del raccolto delle piastre. Raccogliere la timidina su un filtro-mat per ogni piastra utilizzando un apparecchio di raccolta TomTec o uno strumento simile ad aria. Asciugare i filtri-mat per un'ora.

Quindi posizionarli in sacchetti campione individuali. Aggiungere cinque millilitri di liquido scintillante a ciascuno e sigillare. Misurare l'incorporazione di tri-timidina nelle ultime 16 ore dell'esperimento leggendo le membrane filtranti con un contatore scintillometrico Wallach Micro Beta o strumento equivalente, utilizzando PBMC stimolatori e risponditori con incompatibilità HLA.

Da questa figura si può osservare che la presenza di un blocco co-stimolatorio nel MLR primario riduce la proliferazione alloreattiva media dei PBMC risponditori al giorno cinque a circa il 30% di quella osservata nel MLR primario di controllo in assenza di blocco co-stimolatorio. Ciò equivale a un'inibizione media della proliferazione alloreattiva primaria di circa il 70% al giorno cinque. Come mostrato in questa figura.

Da questa figura si può osservare che nella MLR secondaria, la proliferazione allo-specifica delle PBMC allo-attivate al quinto giorno è tipicamente del 10-15% rispetto a quella osservata con le PBMC di controllo. Ciò corrisponde a un'inibizione media della proliferazione del 85-90%, dimostrando che le PBMC allo-attivate sono iporispondenti agli stimolatori allo-specifici di prima parte. Come mostrato in questa figura, una volta acquisita padronanza, le colture cellulari bulk con le cellule mononucleate del sangue periferico del donatore allo-attivate possono essere allestite in due o tre ore.

L'approccio può essere facilmente standardizzato per l'uso clinico al fine di generare linfociti T del donatore con ridotta reattività alloreattiva, ma con mantenuta immunità specifica contro i patogeni. Queste cellule possono essere trasferite in modo adottivo nel contesto del trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche per migliorare la riconstituzione immunitaria senza indurre una malattia del trapianto contro l'ospite eccessiva. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente.

Questo aiuta a preservare la vitalità delle cellule ed evitare l'attivazione non specifica o la perdita di cellule presentatrici di antigene. Se si utilizzano PBMC criopreservati come stimolatori o risponditori, si dovrebbe adottare un protocollo validato per la risuscitazione delle cellule congelate, in grado di fornire costantemente rese elevate di cellule vitali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come alloneizzare i linfociti mononucleati del sangue periferico da donatori umani e di come eseguire saggi per valutare l'efficacia e la specificità di questa procedura; tale strategia può essere utilizzata per generare linfociti T da donatore umano con risposte alloreattive ridotte, che possono essere impiegate clinicamente per migliorare il ripristino immunitario dopo il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche.