Un metodo per l'incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

Questo protocollo descrive un nuovo metodo di incapsulamento dei follicoli ovarici nella rete interpenetrante di alginato di fibrina per la coltura in vitro. Il follicolo secondario è costituito da ovociti situati centralmente circondati da diversi strati di cellule somatiche, che supportano lo sviluppo degli ovociti, l'incapsulamento del follicolo e la coltura in un ambiente tridimensionale che consente l'espansione del follicolo supportando la comunicazione tra più compartimenti cellulari e mantenendo questa struttura sferica del follicolo. Nella prima fase di questo protocollo, isolare i follicoli secondari dalle ovaie di topo di 16 giorni per il metodo a goccia.

Sciacquare e trasferire i follicoli in una soluzione di incapsulamento. Aspirare ogni follicolo con una soluzione di fibrinogeno alginato, pipettare in una soluzione di trombina, calcio e lasciare che le perle si reticolino per il metodo paraform. Trasferire i singoli follicoli in gocce di soluzione di fibrinogeno alginato su un vetrino rivestito di paraform e aggiungere una soluzione di trombina per avviare la reticolazione F-A-I-P-N.

Quindi trasferire i follicoli incapsulati in un mezzo di crescita e immagine, il follicolo incapsulato nell'FA IPN. Poiché questo sistema combina il supporto strutturale con la reattività biologica per supportare la crescita e lo sviluppo di follicoli immaturi per produrre ovuli, può essere applicato agli aggregati cellulari di coltura per mantenere i contatti cellulari senza limitare l'espansione. Ciao, mi chiamo Lonnie Shea e attraverso una collaborazione con tre gocciolatoi di legno, abbiamo sviluppato un sistema di coltura per la maturazione in vitro dei follicoli ovarici.

E questo studio sulla cultura riflette davvero una vera collaborazione tra bioingegneria e biologia riproduttiva. E oggi, le persone che sviluppano effettivamente questo sistema culturale vi presenteranno i metodi. In primo luogo, Ariel Checkoff è un borsista post-dottorato in bioingegneria che ha sviluppato il sistema di biomateriali.

Il prossimo è Minsu, che è un biologo riproduttivo presso il Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, che ha sviluppato le procedure di manipolazione del tessuto ovarico. E insieme vi presenteranno i metodi per incapsulare e coltivare il tessuto ovarico. Il vantaggio principale della tecnica descritta dei metodi esistenti, come la coltura standard sulla plastica della superficie piana, è che il sistema di alginato di fibrina supporta l'architettura tridimensionale del follicolo, presentando al contempo un ambiente meccanicamente dinamico per il follicolo in rapida espansione.

Il microambiente meccanico dinamico nell'uomo attuale fornisce ulteriori vantaggi quando questa tecnologia viene tradotta dal modello di massa alla potenziale applicazione clinica perché nel follicolo umano ha bisogno di una crescita molto più estesa per produrre uova mature e fertilizzanti per risultati ottimali. Eseguire tutte le dissezioni in terreni a base di L 15 per il controllo del pH a 37 gradi Celsius, stadi riscaldati per il controllo della temperatura e su un banco pulito per ridurre al minimo la contaminazione batterica. Trasferire le ovaie appena sezionate in una nuova piastra di Petri da 35 millimetri con uno o due millilitri di terreno di mantenimento contenente lo 0,1% di collagenasi e lo 0,1% di DNA e incubare per 15 minuti in un incubatore di anidride carbonica.

Lavare i campioni in DM per rimuovere la collagenasi e quindi trasferirli in una piastra di Petri da 35 millimetri con DM fresco per isolare i follicoli dall'ovaio. Allontana delicatamente i follicoli dall'intera ovaia utilizzando aghi da 2 28 5 8 gauge attaccati alle siringhe da insulina. Rimuovere il più possibile le cellule stromali senza danneggiare l'integrità del follicolo.

Sezionare da 20 a 40 follicoli secondari con un diametro da 130 a 150 micron per ovaia. Questi follicoli di solito hanno due o tre strati di cellule della granulosi. Ora in un piatto di fecondazione in vitro, aggiungi un millilitro di mm nel pozzetto centrale e tre millilitri di mm nell'anello esterno.

Trasferire i follicoli intatti con la pipetta nell'anello esterno della capsula di fecondazione in vitro. Conserva questa capsula per fecondazione in vitro all'interno dell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo che tutti i follicoli sono stati raccolti.

Esamina i campioni al microscopio da dissezione con un ingrandimento da cinque a otto volte follicoli selezionati di dimensioni comprese tra 130 e 150 micron che mostrano una morfologia sana, inclusi due o tre strati di cellule di granulosi, nessuna separazione tra ovociti e cellule di granulosi e ovociti intatti e rotondi. Trasferisci i follicoli sani al centro di un'altra piastra per la fecondazione in vitro per l'incapsulamento. Per il metodo a goccia di incapsulamento dei follicoli, aggiungere un millilitro di 50 unità internazionali per millilitro di soluzione di trombina nel pozzetto centrale di un piatto di fecondazione in vitro, scongelare e mantenere la soluzione madre di fibrinogeno sul ghiaccio.

E portare il fibrinogeno a temperatura ambiente subito prima dell'incapsulamento. Immediatamente prima dell'uso. Preparare la soluzione di fibrinogeno alginato mescolando una volta PBS 0,5% di alginato e 50 milligrammi per millilitro.

Fibrinogeno a un rapporto di due a uno a uno in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Agitare delicatamente e centrifugare la soluzione leggermente torbida per ridurre l'evaporazione. Spegnere il tavolino di riscaldamento del microscopio da dissezione nell'angolo dell'anello esterno di una capsula per fecondazione in vitro.

90 microlitri di soluzione di fibrinogeno alginato per l'incapsulamento e una seconda goccia di 10 microlitri per una fase di lavaggio. Trasferire da 10 a 15 follicoli nella goccia da 10 microlitri con una quantità minima di terreno di coltura, quindi mescolare rapidamente con una quantità minima di soluzione, trasferire tutti i follicoli nella goccia da 90 microlitri e mescolare aspirare un follicolo entro cinque microlitri di soluzione di fibrinogeno alginato utilizzando una punta da 10 microlitri e rilasciare la soluzione di fibrinogeno alginato insieme al follicolo nella soluzione di trombina al centro del piatto di fecondazione in vitro. Continuare a ripetere questo passaggio fino a quando tutti i follicoli sono incapsulati.

Lascia riposare le perle per cinque o sette minuti per reticolare il gel nella soluzione di trombina calcio. Le perle diventeranno più scure man mano che si forma la fibrina. Trasferire le perline nel mezzo di manutenzione iniziando con le perline più scure.

Per prima cosa incubare per 15-30 minuti a 37 gradi Celsius e risciacquare la trombina rimanente. Infine, trasferisci le perline in una piastra di coltura e immagina. Preparare immediatamente la soluzione di fibrinogeno alginato mescolando alginato allo 0,5% e 50 milligrammi per millilitro.

Fibrinogeno in rapporto uno a uno in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 millilitri, pipettare 7,5 microlitri di miscela di fibrinogeno alginato sul vetro rivestito di profumo. Far scorrere con un distanziatore da tre millimetri e trasferire un follicolo in ogni goccia. Con una quantità minima di supporti.

Aggiungere 7,5 microlitri di soluzione di trombina a ogni goccia senza toccare o mescolare la goccia con il follicolo perché il gel si forma quasi istantaneamente. Coprire i gel con il secondo vetro rivestito di para film. Far scivolare e mettere in un piatto da 100 millimetri a testa in giù in un'incubatrice per cinque minuti.

Trasferire le perle appiccicose in un terreno di mantenimento utilizzando una pinza, se necessario, e poi in un pozzetto di coltura ogni due giorni. Visualizzare i follicoli coltivati utilizzando un microscopio ottico e misurare il diametro del follicolo con l'immagine J.Sostituire anche metà dei terreni di crescita con terreni di crescita freschi e bilanciati ogni due giorni Dopo otto giorni di coltura, l'idrogel dovrebbe apparire limpido a causa della completa degradazione dei componenti della fibrina e i follicoli possono raggiungere le loro dimensioni finali superiori a 400 micron di diametro. Rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 100 microlitri di 10 unità internazionali per millilitro.

Alginato lia in alfa mem per degradare l'alginato. Mettere il piatto in un'incubatrice per 25-30 minuti. Quindi rimuovere i follicoli dalle perle parzialmente disciolte con una punta smussata.

Trasferire i follicoli nell'anello esterno di una piastra per fecondazione in vitro con mezzi di dissezione per lavare via la liasi dell'alginato, quindi trasferirli nell'anello interno. Ora trasferisci i follicoli antrali nell'anello esterno e poi interno della piastra di fecondazione in vitro con terreno di maturazione contenente HCG ed EGF, incuba in un incubatore di anidride carbonica per 15-16 ore. Esaminare le colture per l'espansione delle cellule del cumulo per rimuovere la cellula del cumulo.

Aggiungere una soluzione IDE più elevata a una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro e incubare per due o tre minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Pipetta per la bocca per liberare. Gli ovociti delle cellule del cumulo determinano infine il loro stadio di maturazione al microscopio.

L'alginato è un biomateriale naturale adatto alla coltura di follicoli in vitro grazie alla sua delicatezza e alle sue caratteristiche biochimiche come la dimensione della maglia, la rigidità controllabile e l'inerzia biologica. I piccoli follicoli incapsulati subiscono una bassa forza di compressione nell'alginato all'inizio della coltura. Tuttavia, man mano che il follicolo si espande, il volume spostato nel cordone aumenta, il che si traduce in una maggiore forza di compressione nella direzione opposta all'espansione del follicolo.

Le catene dei singoli polimeri sono completamente aggrovigliate in una soluzione di fibrillina alginato prima della reticolazione. Entrambi i componenti di F-A-I-P-N iniziano a reticolare immediatamente quando sono esposti alla miscela di trombina e un follicolo di calcio degradano la componente di fibrina di F-A-I-P-N durante il periodo di coltura, il che è dimostrato da un chiaro cerchio attorno al follicolo. L'architettura 3D del follicolo è supportata dall'alginato rimanente.

Queste immagini mostrano la crescita secondaria del follicolo in F-A-I-P-N nel tempo dal giorno 0, 4, 6 e otto fino al risultante M a due stadi X.Con il corpo polare, una pronina è un inibitore della proteasi che può essere aggiunto al terreno di coltura per rallentare la degradazione della fibrina. Quando 0,01 TIU per millilitro di aprotinina viene aggiunto al terreno di coltura nei primi quattro giorni, i follicoli non sono in grado di degradare la matrice. E dopo una proteina in rimozione, i follicoli riprendono la crescita e raggiungono lo stadio antrale.

Tuttavia, i follicoli sono stati inizialmente coltivati in una concentrazione più elevata di aprotinina, una crescita inibita. Oggi abbiamo dimostrato una nuova tecnica per variare l'incapsulamento dei follicoli e la coltura in vitro in una rete tridimensionale di fibrina alginato. Il sistema non solo mantiene intatta la struttura follicolare attraverso la coltura, ma supporta anche il successo della genesi follicolare in vitro, che si traduce in un sito O a due stadi M.

Questa tecnologia è importante per scoprire come funziona il follicolo ovarico e ha il potenziale per fornire opzioni di fertilità ai giovani pazienti oncologici più in generale. Questo sistema di coltura può essere utilizzato per la coltura di cluster cellulari o per la coltura di cellule mentre si organizzano in strutture. Questi sistemi di coltura 3D forniranno strumenti preziosi per sezionare la crescita molecolare dei tessuti.