Name: Un metodo per lincapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Scopri un metodo innovativo per l'incapsulamento di follicoli ovarici in una rete 3D di fibrina-alginato. Questa tecnica supporta la maturazione degli oociti preservando le interazioni cellulari essenziali per la ricerca in biologia riproduttiva.

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Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (U54HD41857 e PL1EB008542, un P30 core Biomateriali all&#39;interno del Consorzio Oncofertility tabella di marcia di sovvenzione).

1. Follicolo di isolamento Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e l'uso degli animali istituito istituzionali e protocollo di cura presso la Northwestern University. Per risultati ottimali, tutti dissezioni sono svolte in L15 mezzi per il controllo del pH a livelli ambientali di CO 2, a 37 ° C fasi riscaldato per il controllo della temperatura, e su una panchina pulita per minimizzare la contaminazione batterica. I media dissezione (DM) è preparata con i media L15 integrata con 50 UI / ml penicillina e 50 microlitri / ml streptomicina e 1% FBS. I mezzi di manutenzione (MM) è preparata con i media αMEM integrata con 50 UI / ml penicillina e 50 microlitri / ml streptomicina e 1% FBS. <ol><li> Trasferimento ovaie appena sezionato da 16 giorni vecchio mouse in un piatto nuovo 35 millimetri Petri con 1-2 MM Collagenasi mL contenente 0,1% e 0,1% DNasi. Incubare per 15 minuti all'interno di un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo l'incubazione, eseguire diverse fasi di lavaggio in DM per rimuovere collagenasi, e poi il trasferimento ad un piatto 35 millimetri Petri con DM fresca. Isolare follicoli dall'ovaio delicatamente sfogliando (o il taglio), follicoli di distanza dal ovaio intero utilizzando due aghi calibro 28 08/05 allegata al siringhe monouso. Rimuovere il stroma più possibile, senza danneggiare l'integrità del follicolo. Sezionare i 20-40 follicoli secondari per dell'ovaio (130-150mm). Questi follicoli di solito hanno 2-3 strati di cellule somatiche. </li><li> Aggiungere 1 ml di MM al pozzo centrale di mm FIV 60 (fecondazione in vitro) piastra di Petri, e 3 MM mL per l'anello esterno. Trasferimento follicoli intatti con una pipetta per l'anello esterno del piatto FIV per sciacquare brevemente, e poi selettivamente trasferirli nel pozzo centrale (vedi 1.4). Conservare questo piatto FIV nell'incubatrice. </li><li> Dopo che tutti i follicoli sono raccolti, la fase di selezione viene effettuata con un microscopio da dissezione con un 5-ingrandimento 8x. Follicoli sani hanno le seguenti caratteristiche morfologiche: <ul><li> 2-3 strati di cellule somatiche </li><li> 130-150 millimetri </li><li> Nessuna separazione tra ovocita e cellule somatiche </li><li> Ovociti intatto e rotondo Trasferire i follicoli sani al centro di piatti FIV per l'incapsulamento. </li></ul></li></ol> 2. Follicolo incapsulamento, Metodo 1 - "Il metodo Drop" <ol><li> Aggiungere 1 ml di 50 UI / ml di trombina in TBS con 40 mM CaCl 2 in mezzo e del piatto FIV. Scongelare e mantenere magazzino fibrinogeno (50 mg / mL in TBS) sul ghiaccio. Portare il fibrinogeno a temperatura ambiente a destra prima dell'uso. </li><li> Preparare il fibrinogeno / alginato soluzione mescolando 1x PBS, 0,5% di alginato in soluzione PBS e 50 mg / mL di soluzione di fibrinogeno nel rapporto 02:01:01 in un tubo da microcentrifuga 1,7 ml sterili. Evitare di introdurre bollicine nella soluzione. Delicatamente vortice e spin-down. La soluzione appare leggermente torbida e deve essere preparata immediatamente prima dell'uso. </li><li> Inserire due gocce di fibrinogeno / soluzione alginato nell'anello esterno di un piatto FIV: un 90 gocce microlitri per l'incapsulamento e 10 gocce microlitri per il lavaggio. Per diminuire l'evaporazione, spegnere la fase di riscaldamento sul microscopio da dissezione. Trasferimento 10-15 follicoli in gocce 10 L con una minima quantità di terreni di coltura (&lt;5 mL) con un punta micropipetta 200 micron, e mescolare rapidamente. Trasferire tutti i follicoli in gocce 90 microlitri con una minima quantità di soluzione (&lt;5 mL) dalla prima goccia, e mescolare. </li><li> Contemporaneamente aspirare un follicolo e 5 ml di fibrinogeno / alginato soluzione con un punta di 10 microlitri pipetta, e rilascio nel trombina / soluzione di Ca 2 + nel piatto FIV. Ripetere questa operazione finché tutti i follicoli sono incapsulati. </li><li> Cross-link le perline per 5-7 minuti in trombina / soluzione di Ca 2 +. Le perle diventerà più scuro come gel di fibrina. Trasferire le perle in una capsula di Petri contenente MM, a partire dai grani più scura per primo. Incubare il piatto per 15-30 minuti InThe incubatore per sciacquare la trombina rimanenti. </li><li> Trasferire le perle in una piastra a 96 cultura e contenente 100 ml di mezzi di crescita del follicolo, e di immagine subito. I media di crescita (GM) si prepara con i media αMEM integrata con 10 mUI / ml di FSH ricombinante, 3 mg / mL di BSA, 1 mg / ml di bovini Fetuina, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml di transferrina, e 5 ng / ml di selenio. </li></ol> 3. Follicolo incapsulamento, Metodo 2 - "Il metodo Parafilm" <ol><li> Preparare il fibrinogeno / alginato soluzione miscelando una soluzione di alginato 0,5% e 50 mg / mL di soluzione di fibrinogeno in un rapporto di 1:1 in una provetta da microcentrifuga 1,7 ml sterili. </li><li> Pipettare 7,5 ml di gocce del fibrinogeno / alginato miscela su un vetrino rivestito parafilm con distanziali da 3 mm. Trasferire 1 follicolo in ogni goccia con minimiquantità l di media. </li><li> Aggiungere 7,5 ml di trombina / Ca 2 + soluzione ad ogni goccia. La miscelazione è inutile perché il gel forme quasi istantaneamente. </li><li> Coprire il gel con il secondo vetrino parafilm rivestito, mettere le diapositive a testa in giù in una capsula di Petri 100 mm, e trasferimento in incubatore per 5 minuti. </li><li> Trasferire le perle in una capsula di Petri contenente MM, e poi nella cultura così come descritto in precedenza. Se i talloni stare insieme, che è causa di cross-linking tra le perle, possono essere separati delicatamente con una pinza. </li></ol> 4. Follicolo Imaging e cambiamento media <ol><li> Ogni 2 giorni, i follicoli colta sono esposte utilizzando un microscopio ottico e il diametro follicolare viene misurata con il software di programma ImageJ. </li><li> Ogni 2 giorni, la metà dei terreni di crescita (50 mL) è sostituito dal fresco, pre-equilibrato dei media di crescita. </li></ol> 5. Recupero follicolo da Matrix 3D e in maturazione in vitro degli ovociti (IVM) <ol><li> Dopo 8 giorni di coltura, la idrogel appare chiaro a causa della completa degradazione della componente fibrina, ed i follicoli espandersi ad un diametro di 300-400 micron. L'alginato rimanente viene degradata da alginato-liasi, un impianto di derivazione enzima che degrada specificamente alginato e non influisce sulle cellule animali. </li><li> Rimuovere i supporti di crescita da pozzetti contenenti le perline e aggiungere 100 mL di 10 UI / ml in alginato liasi αMEM. Lascia la piastra nell'incubatore per 25-30 minuti. </li><li> Rimuovere follicoli dalla perline sciolto con una punta fine smussata. Primo trasferimento per l'anello esterno di un piatto contenente FIV DM, e poi verso il centro e, anche contenenti DM da lavare. </li><li> Dopo il lavaggio, trasferire i follicoli per l'esterno, e poi l'anello interno di un piatto FIV contenente i media stagionatura. In mezzi maturazione in vitro (IVM) è composto da αMEM, 10% FCS, 1,5 UI / ml di hCG, e di 5 ng / mL del fattore di crescita epidermico (EGF) </li><li> Trasferimento a CO 2 incubatore per 15-16 ore. Esaminare i follicoli per l'espansione delle cellule cumuliformi. Per rimuovere le cellule del cumulo dal ovocita, aggiungere ialuronidasi soluzione a una concentrazione finale 0,1 mg / ml ed incubare nell'incubatore per 2-3 minuti. Utilizzare una punta di 75 mm a taglio micropipetta cellule del cumulo dal ovocita pipettando su e giù parecchie volte. Determinare fase di maturazione dell'ovocita sotto una luce o di un microscopio da dissezione. Le tappe possibili, dal meno al più maturi, sono i seguenti: <ul><li> Degenerata. L'ovocita è frammentato in due o più pezzi. </li><li> Vescicola germinale (GV) stadio. L'ovocita non ha ripreso la meiosi in risposta all'esposizione hCG, che è evidente dalla presenza continua del nucleo dell'ovocita (GV). </li><li> Vescicola germinale ripartizione (GVBD). La membrana nucleare è assente l'ovocita, ma non è presente corpo polare. Pertanto, l'ovocita è ancora in meiosi-I. </li><li> Metafase II ovocita arrestato (MII). L'ovocita ripreso la meiosi, ed è ora arrestato in metafase II. Un corpo polare deve essere visibile su una luce o un microscopio da dissezione. L'ovocita MII rimarrà a meno che non fecondate in esperimenti successivi. </li></ul></li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Abbiamo descritto un nuovo metodo di incapsulamento dei follicoli ovarici in una FA-IPN per la coltura in vitro (Figura 1). Follicoli ovarici costituito da un ovocita circondato da diversi strati di cellule somatiche. La comunicazione tra i comparti multipli cellulare è essenziale per lo sviluppo dei follicoli sani e la maturazione degli ovociti. Incapsulamento follicolo in un idrogel 3D supporta l'espansione follicolo, pur mantenendo l'architettura del follicolo 9,11,12. Come sviluppare follicoli, il loro volume aumenta in modo esponenziale e il incapsulamento biomateriale dovrebbe consentire questa espansione senza lo sviluppo di una forza inibire compressione. FA-IPN è una rete integrata di due materiali naturali, in cui la fibrina è proteoliticamente degradabile da plasmina attivata dal follicolo e alginato è biologicamente inerte 13 (Figura 2). Durante la crescita del follicolo, degradazione della fibrina inizia a livello locale nei pressi del follicolo, e continua fino a quando la fibrina viene cancellata dal idrogel. La componente non degradabile alginato, che rimane intatta per tutto il periodo della cultura, sostiene la struttura 3D del idrogel. Follicoli sono stati isolati nella fase secondaria di sviluppo (150-180 micron di diametro) e ampliato a 400 micron in fase antrale di sviluppo nel FA-IPN gel. Con la stimolazione con hCG, i follicoli colto può subire l'espansione delle cellule cumulo, e ovociti può riprendere la meiosi e il progresso di metafase II per la fecondazione. Questi risultati suggeriscono che il metodo di incapsulamento e il materiale incapsulante permesso cultura follicolo e la maturazione in vitro di successo (Figura 3). Degradazione della fibrina attorno al encapsulfollicoli ated inizia il primo giorno di cultura, ed è completata da giorno 6. Aprotinina, un inibitore della plasmina solubili, possono essere utilizzati per alterare degradazione della fibrina e di estendere gradiente meccaniche nel materiale incapsulante (Figura 4). Se follicoli sono coltivati ​​con 0,01 TIU / ml aprotinina, la fibrina è più lento degrado per i primi 4 giorni. Tuttavia, i follicoli può ancora sviluppare allo stadio antrale e ovociti restano competenti per riprendere la meiosi di metafase II, dopo l'aprotinina è removed.A alta concentrazione di aprotinina (0,1 TIU / mL) inibisce in maniera significativa degradazione della fibrina, matrice di rigidezza impedisce l'espansione del follicolo e delle cellule somatiche invasione nella matrice si osserva. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso di sviluppo del follicolo. Il follicolo ovarico è costituito da un ovocita in posizione centrale circondato da uno o più strati di cellule somatiche, che sostengono lo sviluppo degli ovociti. Come sviluppare follicoli dalla secondaria alla fase preovulatoria antrale, le cellule somatiche che circonda l'ovocita proliferare e differenziarsi, e l'ovocita aumenta di dimensioni. Maturazione in vitro (IVM) è il passo finale per la cultura follicolo, quando le cellule somatiche adiacenti alla ovocita, chiamate cellule del cumulo, espandere dopo stimolazione con hCG, e l'ovocita riprende la meiosi e progredisce ad un metafase II (MII) stadio. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> Figura 2a. Alginato e fibrina-alginato per la cultura follicolo 3D in vitro. (A) alginato è un biomateriale naturale che è adatto per la cultura follicolo in vitro grazie alla sua gelificazione dolce e caratteristiche biochimiche, come la dimensione delle maglie, rigidità controllabile e inerzia biologica. Alginato è un copolimero polisaccaride lineare di α-L-guluronic acido (G) e β-D-mannuronico acido (M). Le aree con monomeri G ripetere, denominato "G-blocchi", sono interconnessi per formare un idrogel, in presenza di ioni calcio bivalenti. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="Figura 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2b"> Figura 2b. (Bi) Piccoli follicoli incapsulato esperienza bassa forza di compressione in alginato all'inizio della cultura. Tuttavia, poiché il follicolo si espande il volume spostato nel tallone è in aumento, che si traduce in una maggiore forza di compressione nella direzione opposta di espansione follicolo (b-ii). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="Figura 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2c"> Figura 2c. Le catene di polimeri individuali sono completamente impigliata nella fibrina-alginato soluzione prima del cross-linking. Entrambi i componenti della FA-IPN iniziare a cross-link immediatamente in quanto sono esposti alla miscela di trombina e calcio. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="Figura 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3a"> Figura 3a. Diagramma di flusso per l'isolamento del follicolo e l'incapsulamento in un FA-IPN. Follicoli secondari sono isolati da 16 giorni di vecchio mouse (Ai). Gli organi riproduttivi sono sezionato (A-II), e follicoli isolati sono trasferito in un piatto con i media manutenzione (A-III). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="Figura 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3b"> Figura 3b Il metodo goccia per l'incapsulamento follicolo in soluzione fibrinogeno alginato (B: I-IV).. Due gocce di fibrinogeno-alginato soluzione, la caduta di risciacquo (10 mL) e la caduta di incapsulamento (90 mL) sono pipettati nel piatto (Bi). Prossimi 3-5 follicoli vengono trasferiti in una goccia di risciacquo (B-II). Dopo il risciacquo e la rimozione dei media, i follicoli sono trasferiti al calo incapsulamento (B-III). Ogni follicolo è aspirato con 5 microlitri fibrinogeno-alginato soluzione con una punta di 10 microlitri pipetta e poi espulso in trombina / calcio soluzione (B-iv). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="Figura 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3c"> Figura 3 quater. Il reticola tallone per 5 minuti. Il metodo di parafilm per l'incapsulamento follicolo in soluzione fibrinogeno alginato (C: I-III). Fibrinogeno-alginato di soluzione (7,5 mL) è pipettati sul vetrino rivestito parafilm e follicoli vengono trasferiti individualmente ad ogni goccia dopo il risciacquo (Ci, ii). Trombina soluzione (7,5 mL) viene aggiunto a ogni goccia (C-III). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="Figura 3d-e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3d-e"> Figura 3d - e. Le gocce sono coperti con un secondo vetrino parafilm rivestiti e la FA-IPN è reticolato in incubatrice per 5 minuti. (D) I follicoli incapsulati vengono trasferiti ai media la crescita in una piastra da 96 pozzetti. (E) L'immagine di un follicolo incapsulato nel FA-IPN (freccia bianca). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Degradazione della fibrina dalla crescente FolliCLE. Follicoli degradare la fibrina componente della FA-IPN durante il periodo di cultura, che è dimostrato da un cerchio chiaro intorno al follicolo. Architettura 3D del follicolo è supportata dal alginato rimanenti. Il giorno 0 (D0) la fibrina è ancora intatta e la matrice di tutto il follicolo è nuvoloso; dopo 1 giorno in coltura (D1), l'anello libero intorno al follicolo appare (freccia bianca) e la parte anteriore di degradazione della fibrina continua ad espandersi radialmente il giorno 2 (D2) e il giorno 4 (D4) della cultura. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Immagini di crescita del follicolo. Rappresentante la crescita del follicolo immagini ofsecondary nella FA-IPN il giorno 0 (A), 4 (B), 6 (C) e 8 (D) della cultura. Dopo 8 giorni, i follicoli antrali sono stati maturati in vitro, e la conseguente fase di ovociti MII sono mostrati (E, il corpo polare viene mostrata con freccia nera). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Fibrina degradazione è stata inibita da aprotinina. Crescente follicoli il giorno 2, 4, 10 e 12 sono riportati nella prima riga. Aprotinina a concentrazioni 0,01 TIU / mL (seconda fila) e 0,1 TIU / mL è stato aggiunto al terreno di coltura nei giorni 0, 2 e 4. Solo follicolo culture con 0,01 TIU / ml aprotinina degradato la fibrina dopo la rimozione aprotinina ed ha raggiunto fase antrale. Follicoli colto in 0,1 TIU / ml aprotinina non è cresciuto nella FA-IPN. <table border="1"><tbody><tr><td> Abbreviazione </td><td> Nome e cognome </td></tr><tr><td> CO 2 incubatore </td><td> 37 ° C incubatore al 5% di CO 2 </td></tr><tr><td> COC </td><td> Complessi cumulo oocita </td></tr><tr><td> 3D </td><td> Dimensionale 3 </td></tr><tr><td> DM </td><td> Dissezione dei media </td></tr><tr><td> FEG </td><td> Fattore di crescita epidermico </td></tr><tr><td> FA-IPN </td><td> Fibrina-alginato rete compenetrano </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Siero bovino fetale </td></tr><tr><td> GM </td><td> La crescita dei media </td></tr><tr><td> GV </td><td> Vescicola germinale </td></tr><tr><td> hCG </td><td> Gonadotropina corionica umana </td></tr><tr><td> ITS </td><td> Transferrina supplemento di insulina Selenio </td></tr><tr><td> FIV piatto </td><td> Centro ben 60 mm di piatto fecondazione in vitro </td></tr><tr><td> MM </td><td> Manutenzione mezzi di comunicazione </td></tr><tr><td> MII fase ovocita </td><td> Metafase II fase ovocita </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> Ricombinante dell'ormone follicolare Stimolare </td></tr><tr><td> TBS </td><td> Tris soluzione salina tamponata </td></tr><tr><td> TIU </td><td> Unità tripsina inibitorio </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Abbreviazioni

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
<li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li>
<li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture%2C+in+vitro+follicle+development+and+transplantation%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li>
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<li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li>
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<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li>
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<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+micro+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo presentato follicolo ovarico incapsulamento in una FA-IPN consente cultura follicolo in un ambiente 3D in vitro. Un FA-IPN è un processo dinamico, cellula-reattiva matrice in cui sono determinati le proprietà iniziali meccaniche dalla combinazione di entrambi fibrina e alginato. Durante la cultura, il follicolo incapsulato attiva proteasi che degradano solo una componente del IPN, la fibrina, che si traduce in una rigidità gel gradualmente decrescente che ha contribuito unicamente dal alginato che rim...

<table><tbody><tr><td>Fetuina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Roche Group</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>rFSH</td><td>Istituto Nazionale del Diabete e delle Malattie Digestive e Renali</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Kit di fibrina Tisseel</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>Alginato di sodio</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>Mw 418kDa</td></tr></tbody></table>

un metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 sistema dimensionale

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Il follicolo ovarico è l&#39;unità funzionale dell&#39;ovaio che secerne ormoni sessuali e supporta la maturazione degli ovociti. Follicolo Nelle tecniche in vitro fornire uno strumento per lo sviluppo del modello follicolo per studiare biologia di base, e sono ulteriormente sviluppata come una tecnica per preservare la fertilità del clinica 1-4. Il nostro sistema di coltura in vitro impiega idrogel in modo da simulare l&#39;ambiente nativo ovarico, mantenendo l&#39;architettura 3D follicolare, interazioni cellula-cellula e di segnalazione paracrina che lo sviluppo del follicolo diretta 5. In precedenza, i follicoli sono stati colti con successo in alginato, un inerte alghe polisaccaride derivato che subisce gelificazione con gli ioni calcio 6-8. Idrogel alginato formata ad una concentrazione di 0,25% w / v sono stati i più permissivi per la cultura follicolo, e mantenuto la massima competenza dello sviluppo 9. Idrogel alginato non sono degradabili e quindi un aumento del diametro del follicolo risultati in una forza di compressione sul follicolo che possono influenzare la crescita del follicolo 10. Successivamente abbiamo sviluppato un sistema di coltura basato su una rete di fibrina-alginato compenetrano (FA-IPN), in cui sono gelificato una miscela di fibrina e alginato contemporaneamente. Questa combinazione offre un ambiente dinamico meccanico perché entrambi i componenti contribuiscono alla rigidità matrice inizialmente, tuttavia, proteasi secreto dal follicolo crescente degrado fibrina nella matrice di alginato lasciando solo quello di fornire supporto. Con l&#39;IPN, il contenuto alginato può essere ridotto al di sotto dello 0,25%, il che non è possibile con alginato solo 5. Così, come il follicolo si espande, si sperimenterà una forza di compressione ridotto a causa del ridotto contenuto di solidi. Qui, descriviamo un metodo di incapsulamento e di un sistema di coltura in vitro di follicoli ovarici in una FA-IPN. L&#39;ambiente dinamico meccanico imita l&#39;ambiente naturale in cui follicoli ovarici piccolo risiedono in una corteccia rigido e passare a un midollo più permissiva in quanto aumentano di dimensione 11. La componente degradabile può essere particolarmente critico per la traduzione clinica al fine di supportare il maggiore di 10 aumento di 6 volte il volume che i follicoli umani normalmente sottoposti in vivo.

Un nuovo metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico in una rete di fibrina-alginato 3D compenetrano è descritto. Questo sistema combina un sostegno strutturale con degradazione proteolitica per sostenere lo sviluppo dei follicoli immaturi per la produzione di ovociti maturi. Questo metodo può essere applicato agli aggregati di coltura cellulare per mantenere la cellula-cellula contatti senza limitare l&#39;espansione.

Un metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

Il follicolo ovarico è l'unità funzionale dell'ovaio che secerne ormoni sessuali e supporta la maturazione dell'ovocita. Le tecniche di coltura follicolare in vitro forniscono...

Questo protocollo descrive un nuovo metodo di incapsulamento dei follicoli ovarici in una rete interpenetrante di fibrina e alginato per la coltura in vitro. Il follicolo secondario è costituito da un oocita situato centralmente, circondato da diversi strati di cellule somatiche, che sostengono lo sviluppo dell'oocita; l'incapsulamento del follicolo e la coltura in un ambiente tridimensionale permettono l'espansione del follicolo mantenendo al contempo la comunicazione tra i diversi compartimenti cellulari e preservando la struttura sferica del follicolo. Nel primo passaggio di questo protocollo, isolare i follicoli secondari dalle ovaie di topi di 16 giorni per il metodo a goccia.Risciacquare e trasferire i follicoli in una soluzione di incapsulamento. Aspirare ciascun follicolo con soluzione di fibrinogeno e alginato mediante pipetta e trasferirlo in una soluzione di trombina e calcio, lasciando indurire le perle per il metodo paraform. Trasferire singoli follicoli in gocce di soluzione di fibrinogeno e alginato su un vetrino di vetro rivestito con paraform e aggiungere la soluzione di trombina per avviare la reticolazione F-A-I-P-N.Quindi trasferire i follicoli incapsulati in un mezzo di crescita e acquisire un'immagine del follicolo incapsulato nell'IPN di acido folico. Poiché questo sistema combina supporto strutturale e risposta biologica per favorire la crescita e lo sviluppo di follicoli immaturi finalizzati alla produzione di ovociti, potrebbe essere applicato per la coltura di aggregati cellulari al fine di mantenere i contatti cellula-cellula senza limitarne l'espansione. Salve, mi chiamo Lonnie Shea e, in collaborazione con Three Fold Drip, abbiamo sviluppato un sistema di coltura per la maturazione in vitro dei follicoli ovarici.Questo studio sulla coltura rappresenta davvero una reale collaborazione tra bioingegneria e biologia della riproduzione. Oggi, le persone che hanno effettivamente sviluppato questo sistema di coltura vi presenteranno i metodi. Per prima, Ariel Checkoff è un ricercatore postdottorato in bioingegneria che ha sviluppato il sistema di biomateriali.Segue Minsu, biologo della riproduzione del Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, che ha sviluppato le procedure per la manipolazione del tessuto ovarico. Insieme, illustreranno i metodi per l'incapsulamento e la coltura del tessuto ovarico. Il principale vantaggio della tecnica descritta rispetto ai metodi esistenti, come la coltura standard su superfici plastiche piane, è che il sistema fibrina-alginato sostiene l'architettura tridimensionale del follicolo, offrendo al contempo un ambiente meccanicamente dinamico per il follicolo in rapida espansione.L'ambiente meccanico dinamico presente nell'uomo attuale offre ulteriori vantaggi quando questa tecnologia viene traslata da un modello su larga scala a potenziali applicazioni cliniche, poiché nel follicolo umano è necessaria una crescita molto più estesa al fine di produrre ovociti maturi e fecondabili per risultati ottimali. Eseguire tutte le dissezioni in un mezzo a base di L15 per il controllo del pH, su piastre riscaldate a 37 gradi Celsius per il controllo della temperatura e su un bancone sterile per minimizzare la contaminazione batterica. Trasferire le ovaie appena dissezionate in una nuova piastra di Petri da 35 millimetri contenente da uno a due millilitri di mezzo di mantenimento con 0,1% di collaghenasi e 0,1% di DNAsi, e incubare per 15 minuti in un incubatore a anidride carbonica.Lavare i campioni in DM per rimuovere la collagenasi, quindi trasferirli in una piastra di Petri da 35 millimetri con DM fresco al fine di isolare i follicoli dall'ovaio. Staccare delicatamente i follicoli dall'ovaio intero utilizzando due aghi da insulina da 28 gauge fissati a siringhe per insulina. Rimuovere la maggior quantità possibile di cellule stromali senza danneggiare l'integrità del follicolo.Dissezionare da 20 a 40 follicoli secondari con un diametro di 130-150 micron per ovaio. Questi follicoli presentano solitamente due o tre strati di cellule della granulosa. Aggiungere ora in una piastra IVF un millilitro di mm nel pozzetto centrale e tre millilitri di mm nell'anello esterno.Trasferire i follicoli integri con la pipetta nell'anello esterno della piastra per fecondazione in vitro. Mantenere questa piastra per fecondazione in vitro all'interno dell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver raccolto tutti i follicoli.Esaminare i campioni al microscopio stereoscopico con un ingrandimento da cinque a otto volte, selezionando i follicoli di dimensioni comprese tra 130 e 150 micron che presentano una morfologia sana, inclusi due o tre strati di cellule della granulosa, nessuna separazione tra l'ovocita e le cellule della granulosa e ovociti integri e rotondeggianti. Trasferire i follicoli sani al centro di una nuova piastra per fecondazione in vitro (IVF) per l'incapsulamento. Per il metodo a goccia di incapsulamento follicolare, aggiungere un millilitro di soluzione di trombina a 50 unità internazionali per millilitro nel pozzetto centrale di una piastra IVF, scongelare e mantenere la soluzione madre di fibrinogeno sul ghiaccio.E portare il fibrinogeno a temperatura ambiente subito prima dell'incapsulamento. Immediatamente prima dell'uso. Preparare la soluzione di alginato con fibrinogeno mescolando PBS 1×, alginato 0,5% e 50 milligrammi per millilitro.Fibrinogeno in un rapporto di due a uno a uno in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Vortexare delicatamente e centrifugare la soluzione leggermente torbida per ridurre l'evaporazione. Spegnere il piatto riscaldante sul microscopio stereoscopico nell'angolo dell'anello esterno di una piastra per fecondazione in vitro.90 microlitri di soluzione di fibrinogeno e alginato per l'incapsulamento e una seconda goccia di 10 microlitri per un passaggio di lavaggio. Trasferire da 10 a 15 follicoli nella goccia di 10 microlitri con una quantità minima di mezzo di coltura, quindi mescolarli rapidamente con una minima quantità di soluzione; trasferire tutti i follicoli nella goccia di 90 microlitri e mescolare. Aspirare un follicolo all'interno di cinque microlitri di soluzione di fibrinogeno e alginato utilizzando una punta da 10 microlitri e rilasciare la soluzione di fibrinogeno e alginato insieme al follicolo nella soluzione di trombina al centro della capsula Petri per fecondazione in vitro. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti i follicoli sono stati incapsulati.Lasciare riposare le perle per cinque o sette minuti per favorire il legame incrociato del gel nella soluzione di calcio trombina. Le perle diventeranno più scure man mano che si forma il fibrina. Trasferire le perle nel mezzo di mantenimento, iniziando da quelle più scure.Incubare prima per 15-30 minuti a 37 gradi Celsius e rimuovere il trombina residuo con un risciacquo. Infine, trasferire le perle in una piastra per colture e acquisire l'immagine. Preparare immediatamente la soluzione di alginate di fibrinogeno mescolando alginato 0,5% e 50 milligrammi per millilitro.Fibrinogeno in rapporto uno a uno in un tubo sterile da microcentrifuga da 1,7 millilitri, pipettare gocce da 7,5 microlitri della miscela di fibrinogeno e alginato sul vetro rivestito con parafilm. Posizionare un distanziatore da tre millimetri e trasferire un follicolo in ciascuna goccia, utilizzando una quantità minima di mezzo di coltura.Aggiungere 7,5 microlitri di soluzione di trombina a ciascuna goccia senza toccare o mescolare la goccia con il follicolo, poiché il gel si forma quasi istantaneamente. Coprire i gel con il secondo vetrino rivestito di parafilm. Far scivolare e posizionare in una piastra da 100 millimetri capovolta in un incubatore per cinque minuti.Trasferire le perle appiccicose nel mezzo di mantenimento utilizzando pinzette, se necessario, e quindi in una pozzetta di coltura ogni due giorni. Acquisire immagini delle follicelle coltivate mediante microscopio ottico e misurare il diametro follicolare con ImageJ. Sostituire inoltre metà del mezzo di crescita con mezzo di crescita fresco equilibrato ogni due giorni. Dopo otto giorni di coltura, l'idrogel dovrebbe apparire trasparente a causa della completa degradazione dei componenti della fibrina e le follicelle possono raggiungere le dimensioni finali, superiori a 400 micron di diametro. Rimuovere il mezzo di crescita e aggiungere 100 microlitri di 10 unità internazionali per millilitro.L'alginate lia in alfa mem per degradare l'alginate. Posizionare la piastra in un incubatore per 25-30 minuti. Successivamente, rimuovere i follicoli dalle perle parzialmente disciolte utilizzando una punta con estremit&agrave; smussata.Trasferire i follicoli nell'anello esterno di una piastra IVF con mezzo di dissezione per eliminare l'alginato, quindi trasferirli nell'anello interno. Successivamente, trasferire i follicoli antrali nell'anello esterno e poi in quello interno della piastra IVF con mezzo di maturazione contenente HCG ed EGF, e incubare in un incubatore a anidride carbonica per 15-16 ore. Esaminare le colture per verificare l'espansione delle cellule del cumulo al fine di rimuovere le cellule del cumulo.Aggiungere la soluzione IDE ad alta concentrazione fino a raggiungere una concentrazione finale di 0,1 milligrammo per millilitro e incubare per due o tre minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Aspirare con la pipetta per liberare gli oociti dalle cellule del cumulo e determinarne infine lo stadio di maturazione al microscopio.L'alginato è un biomateriale naturale adatto alla coltura in vitro dei follicoli grazie alle sue caratteristiche meccaniche e biochimiche delicate, come la dimensione della maglia, la rigidità controllabile e l'inertezza biologica. I follicoli incapsulati di piccole dimensioni subiscono una bassa forza compressiva all'interno dell'alginato all'inizio della coltura. Tuttavia, con l'espansione del follicolo, il volume spostato all'interno della perla aumenta, generando una forza compressiva maggiore nella direzione opposta all'espansione follicolare.Le catene di polimeri individuali sono completamente intrecciate nella soluzione di alginato di fibrillina prima del reticolaggio. Entrambi i componenti del F-A-I-P-N iniziano a reticolare immediatamente non appena esposti alla miscela di trombina e calcio; i follicoli degradano il componente fibrina del F-A-I-P-N durante il periodo di coltura, come dimostrato da un cerchio chiaro attorno al follicolo. L'architettura tridimensionale del follicolo è sostenuta dall'alginato residuo.Queste immagini mostrano la crescita dei follicoli secondari in F-A-I-P-N nel tempo, dal giorno 0, 4, 6 e fino allo stadio M due X. Con il corpuscolo polare, una pronina è un inibitore della proteasi che può essere aggiunto al mezzo di coltura per rallentare la degradazione del fibrinogeno. Quando 0,01 UI TIU per millilitro di aprotinina vengono aggiunti al mezzo di coltura nei primi quattro giorni, i follicoli non sono in grado di degradare la matrice. E dopo la rimozione della proteina, i follicoli riprendono la crescita e raggiungono lo stadio antrale.Tuttavia, i follicoli coltivati inizialmente in una concentrazione più elevata di aprotinina hanno mostrato una crescita inibita. Oggi abbiamo dimostrato una nuova tecnica per la variabilità dell'incapsulamento dei follicoli e della coltura in vitro in una rete tridimensionale di fibrina e alginato. Il sistema non solo mantiene intatta la struttura follicolare durante la coltura, ma supporta anche con successo la genesi follicolare in vitro, che porta a un sito M di secondo stadio O.Questa tecnologia è importante per scoprire come funziona il follicolo ovarico e ha il potenziale di offrire opzioni di fertilità ai giovani pazienti oncologici. Più in generale, questo sistema di coltura può essere utilizzato per la coltura di aggregati cellulari o per la coltura di cellule mentre si organizzano in strutture. Questi sistemi di coltura 3D forniranno strumenti preziosi per analizzare a livello molecolare la crescita dei tessuti.

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Coltura di cellule normali in loro contesto tridimensionale rappresenta un metodo alternativo per studiare eventi precoci necessari per la trasformazione cellulare e tumorigenesi. Questo metodo è utilizzato per la coltivazione ovarici normali e cellule oviductal per studiare eventi precoci nella formazione del cancro ovarico.

Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube

Questo video descrive i protocolli per incapsulare i complessi cumulo-ovociti suini (COC) in perle di fibrina-alginato per stabilire una coltura 3D. Questo sistema di maturazione in vitro mantiene la normale comunicazione cellula-cellula, garantendo la maturazione degli ovociti e mantenendo la vitalità.

Coltura 3D di COC suini: una procedura per incapsulare complessi di ovociti cumulici in perle di idrogel polimerico di fibrina-alginato

In questo video, descriviamo un protocollo per l'incapsulamento di ovociti suini in microbioattori idrofobici.

Sistema microbioreattore in marmo liquido: un protocollo di coltura 3D per l'incapsulamento di ovociti suini

Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell'effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

Qui presentati sono presentati due protocolli per l'incapsulamento di oociti di porcina in condizioni di coltura 3D. Nel primo, i complessi cumuli-oocici (COC) sono incapsulati in perline fibrin-alginate. Nel secondo, sono racchiusi con particelle di polvere di propilene di etilene fluorrinate (microbioreattori). Entrambi i sistemi garantiscono condizioni ottimali per mantenere la propria organizzazione 3D.

Idrogel alginato degradati proteolylylylyd e microbioreattori idrofobici per l'incapsulamento dell'Oocito Porcine

Questo protocollo descrive un nuovo modello di coltura tridimensionale (3D) che utilizza un idrogel di acido ialuronico legato alla tiramina per incapsulare e coltivare follicoli preantrali dall'ovaio di topo. Descriviamo anche due approcci alla crioconservazione del follicolo ovarico mediante vitrificazione.

Applicazione di un nuovo idrogel di acido ialuronico per la coltura tridimensionale dei follicoli e metodologia per la crioconservazione dei follicoli ovarici di topo

Descriviamo i metodi per coltivare i follicoli ovarici in un nuovo stampo di agarosio privo di scaffold che completa la gametogenesi in vitro .

Produzione e utilizzo di stampi di agarosio personalizzabili per la coltura di follicoli ovarici di topo senza scaffold

Descriviamo metodi per isolare cellule somatiche ovariche di topo da una frazione arricchita di stroma dell'ovaio e per generare organoidi somatici ovaricos di topo utilizzando un approccio senza impalcatura.

Indagine del microambiente ovarico: metodi per l'isolamento, la coltura 2D e la coltura organoide delle cellule somatiche ovariche del topo

Un metodo è descritto per la preparazione di un 3-dimensionale matrice costituita da collagene di tipo I e di fibroblasti umani primari. Questo gel organotipica serve come substrato utile per valutare la migrazione delle cellule invasive perché imita caratteristiche di base di stroma tissutale ed è suscettibile di molte forme di microscopia.

Organotipiche Collagene I test: una piattaforma malleabile per valutare Comportamento cella in un 3-dimensionale Contesto

Monostrati auto-assemblati (SAM) formato da tioli alcani a catena lunga su oro fornire ben definito substrati per la formazione di pattern proteico delle cellule e di confino. Stampa microcontact di hexadecanethiol utilizzando un (PDMS) polidimetilsilossano timbro seguita da riempimento con un glicole-terminated alcano tiolo monomero produce un modello in cui proteine ​​e cellule di assorbire solo alla regione timbrato hexadecanethiol.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Scopri un metodo innovativo per l'incapsulamento di follicoli ovarici in una rete 3D di fibrina-alginato. Questa tecnica supporta la maturazione degli oociti preservando le interazioni cellulari essenziali per la ricerca in biologia riproduttiva.

Un metodo per l'incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

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