Solida piastra a base di restrizioni alimentari, Caenorhabditis elegans

La procedura esegue la restrizione dietetica sul piatto standard a base di eleganza marina per studiarne l'effetto sulla longevità, la riproduzione e il metabolismo. Ciò si ottiene misurando prima con precisione la concentrazione dei batteri che verranno utilizzati come fonte di cibo. Il secondo passo della procedura consiste nel diluire correttamente la coltura batterica in concentrazioni adeguate.

Quindi preparare piastre SDR a base di batteri uccisi. Infine, impostare esperimenti SDR con una popolazione di vermi sincronizzata per età. I risultati della produzione di progenie e le misurazioni della durata della vita possono mostrare una produzione di progenie ritardata e ridotta, nonché un aumento della durata media della vita.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a 60 metodi come Dian in AZA medium, è che tutto l'esperimento sarà eseguito su un gioco standard a base di AGA solido che viene utilizzato dalla maggior parte dei laboratori caldi per gli esperimenti di restrizione dietetica e vedere l'eleganza stabilire curve di calibrazione separate per ogni ceppo batterico utilizzato come fonte di cibo. Raccogli una singola colonia di batteri e coli OP 50 da una striscia fresca su lb agar e inoculare tre millilitri di coltura di brodo liquido lb in uno shaker a 37 gradi Celsius durante la notte. Preparare una doppia diluizione seriale della coltura notturna.

Quindi misurare l'assorbanza di ciascuna diluizione a 600 nanometri mediante spettrofotometro in triplicato. Inoltre dut ogni sospensione batterica, 1 milione di pieghe uniformemente seminare 0,4 millilitri di sospensione batterica di ogni diluizione su una piastra agricola da 100 millimetri lb e incubare a 37 gradi Celsius per 18-24 ore. Contare il numero di colonie batteriche coltivate su ciascuna piastra per calcolare le unità formanti colonie per millilitro per ogni campione.

Ora tracciate OD 600 in funzione della concentrazione batterica ed eseguite un'analisi di regressione lineare per stabilire la relazione tra i valori misurati di OD 600 e le concentrazioni di batteri OP 50. Per questo metodo, viene utilizzata una concentrazione di batteri di una volta 10 per l'11° CFU per millilitro nella condizione di alimentazione ad lido e una volta per 10 fino all'ottavo CFU per millilitro come condizione ottimale di alimentazione DR. Tuttavia, possono essere necessarie da quattro a sei diverse concentrazioni di batteri per stabilire una relazione dose-dipendente completa.

Per i DSP e le relative risposte. Preparare un inoculo con una singola colonia di batteri e coli OP 50 in tre millilitri di brodo LB liquido, coltivato in uno shaker a 37 gradi Celsius per sei-otto ore. Trasferire la coltura OP 50 in un nuovo pallone contenente 500 millilitri di brodo LB e far crescere per una notte affinché i batteri raggiungano la saturazione, se necessario.

Preparare un'adeguata diluizione della coltura OP 50 per la misurazione dell'assorbanza a OD 600. Per determinare la concentrazione di batteri, pellettare i batteri mediante centrifugazione a 1500 Gs per 20 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere i batteri a una concentrazione di una volta 10 a del 12° CFU per millilitro.

Ora, preparare colture batteriche da 10 millilitri in sei diverse concentrazioni, che vanno da una volta 10 della 12a a una volta 10 della settima CFU per millilitro di pipetta. Puntare due millilitri di coltura batterica al centro di una piastra N GM solidificata da 60 millimetri. Evitare di toccare la superficie della piastra con la punta della pipetta, poiché le tacche sulla superficie consentono ai vermi di penetrare negli aerati.

Metti le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi applicare 10 microlitri di 100 milligrammi per millilitro di soina carbonica e 10 microlitri di 50 milligrammi per millilitro di micina su ciascuna piastra per una crescita residua dei batteri. Conservare le piastre con diverse concentrazioni di batteri uccisi con antibiotici a quattro gradi Celsius per un uso futuro per un massimo di un mese.

È importante preparare e conservare un numero sufficiente di piatti, preferibilmente lo stesso lotto per l'intero impianto. Sperimenta almeno uno o due giorni prima per verificare la vitalità dei batteri. Raschiare alcuni batteri dalle piastre SDR e distribuirli su una piastra N GM vuota con carbonico, seina e antimicina.

Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per sei-otto ore e confermare l'assenza di crescita batterica. Per la maggior parte degli studi relativi ai DSP, come l'analisi della durata della vita e il profilo della produzione di progenie, è essenziale la preparazione di una popolazione di vermi sincronizzata per età. Usa un raccoglitore di vermi di platino per trasferire da 20 a 30 adulti attivi dal punto di vista riproduttivo su diverse piastre NGM regolari.

Con OP 50. A seconda del numero di uova necessarie per gli esperimenti, potrebbero essere necessari più adulti. Lasciare le piastre a 20 gradi Celsius per quattro ore per consentire la deposizione delle uova.

Togliete gli adulti dal piatto e ispezionate visivamente i piatti per verificare la presenza di uova. Continuare a incubare le piastre a 20 gradi Celsius per consentire alla progenie di svilupparsi nella tarda L di quattro giorni e allo stadio adulto. Di solito questo richiede tre giorni per N due vermi di tipo selvatico a 20 gradi Celsius.

Per l'analisi della durata di vita. Trasferisci da 10 a 12 vermi adulti del primo giorno su una piastra SDR per avviare la restrizione dietetica. Per ottenere una potenza statistica sufficiente, usa un totale di 60-100 worm per ogni condizione SDR.

Segna la vitalità di ogni verme ogni due o tre giorni fino a quando tutti i vermi sono morti. È importante trasferire i vermi su piastre SDR fresche a giorni alterni per evitare di morire di fame. Questa curva di calibrazione traccia la concentrazione di OP 50 in relazione a OD 600.

L'equazione generata dall'analisi di regressione lineare può essere utilizzata per tutti i calcoli futuri delle concentrazioni di batteri OP 50. Questo studio analizza l'effetto dei trattamenti cronici con SDR sulla durata media della vita di diversi ceppi di vermi rispetto a una normale risposta dose-dipendente dei vermi wild type all'SDR. L'effetto della durata della vita della SDR è parzialmente soppresso dalla sovraespressione della DR 2, mentre la mutazione DAF 16 MU 86 non ha alcun effetto sull'estensione della durata della vita indotta dalla SDR.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire Dian sul gioco standard basato su AGA in eleganza marina.