Name: Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Impara un metodo non chirurgico per instillare materiali nei polmoni di topi anestetizzati e analizzare cellule immunitarie polmonari e linfonodi drenanti mediante citometria di flusso.

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1. Prima del processo, preparare e raccogliere i seguenti elementi <ol><li> Si prega di fare riferimento all'immagine della Figura 1a) e 1b) per la costruzione di una piattaforma di legno per trattenere il mouse durante la procedura. </li><li> Mix di digestione per linfonodi - HBSS + 1.25mg/ml Collagenasi TypeIV o 2,5 mg / ml Collagenasi D </li><li> Mix di digestione per i polmoni - HBSS + 1 mg / ml Collagenasi </li><li> Diluire sfere di lattice (1:20) in PBS per iniezione intraperitoneale di visualizzare i LDLNs </li></ol> Nota: LDLNs sono piccoli e difficili da trovare. Per informazioni su come trovarli, iniettare 200μl della diluito 1:20 sfere di lattice rosso fluorescente ip nel topo. Il peritoneo fognature a questi LDLNs 8. 24 HPI, esporre la cavità toracica del mouse come descritto sopra. Il LDLNs apparirà rosa le perline che drenato dalla cavità peritoneale. <ol start="5"><li> Globuli rossi (RBC) Lysis Buffer - 0,15 m NH 4 Cl, 10mM KHCO 3, 0.1 mM Na 2 EDTA in 1L dH 2 0. Regolare il pH a 7,2-7,4 e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Cellula filtro 70μm o 100μm </li><li> Soluzione madre di 0.5M EDTA, pH = 8.0 </li><li> HBSS senza CaCl 2 e MgCl 2 </li><li> Forbici e blunt-ended forcipe </li><li> Laringoscopio </li><li> Gavage ago (22 gauge) piegato ad angolo (Figura 2) </li><li> Styrofoam bordo e perni per la diffusione del mouse </li><li> Bilancia a due piatti in alto </li><li> Anilina blu Soluzione - 10 mg in H 2 O </li></ol> Nota: Useremo questa soluzione per la dimostrazione di esso tecnica di iniezione. 2. Preparazione e la somministrazione di anestetici del mouse <ol><li> Preparare una miscela di xylazina e ketamina in PBS sterile in modo che le concentrazioni finali sono 2mg/ml e 10mg/ml rispettivamente. </li><li> Pesare il mouse su un equilibrio pan superiore. </li><li> Calcolare la dose richiesta per ogni mouse. Dose alla xylazina (2-4 mg / kg) e ketamina (70-80 mg / kg) di peso corporeo in giusto volume della miscela preparata e iniettare intaperitoneally. Ogni ceppo di topi può richiedere l'ottimizzazione di anestetico. Topi riceve troppo anestetico può avere un tasso ridotto respirazione che potrebbe essere fatale dopo inoculo viene instillata nei polmoni. </li><li> Dopo 3-5 minuti, osservare il mouse per gli effetti degli anestetici. Controllare i seguenti segni per confermare che il mouse è completamente anestetizzato: <ol><li> Il tasso di respirazione dovrebbe rallentare. </li><li> Il mouse non dovrebbe allungare il suo braccio quando preso per il collo. </li><li> Non ci dovrebbe essere alcuna risposta quando gli arti posteriori sono stimolati. Se questi criteri non sono soddisfatti, attendere per qualche minuto e controllare di nuovo prima di procedere alla fase successiva. </li></ol></li></ol> 3. Iniezione intratracheale <ol><li> Preparare il innoculum in soluzione salina 50μl. Riempire una siringa da 1ml con ago sterile sonda gastrica piegato con il innoculum. La siringa deve essere caricata con una tasca d'aria 100μl dietro la innoculum per assicurare che tutto il fluido è instillato nei polmoni. </li><li> Posizionare il mouse sulla piattaforma inclinata di legno appeso dai suoi incisivi sul filo e delicatamente trattenere sul posto con un pezzo di nastro. </li><li> Accendere il laringoscopio con la mano sinistra (destra se siete mancini) e prendere un paio di pinze smussato finita. Utilizzare la punta del laringoscopio e pinza per sollevare delicatamente aprire la bocca. </li><li> Con la pinza, tirare la lingua fuori e tenerlo da parte. Guida la lama laringoscopio verso la parte posteriore della bocca. Tenere il laringoscopio premuto molto delicatamente in un angolo di 90 ° fino a vedere l'apertura della trachea. Tenere il laringoscopio a posto. Si deve prestare attenzione quando si tira la lingua dalla bocca e questo dovrebbe essere fatto con delicatezza in modo che nessun danno tissutale si verifica. </li><li> Con l'altra mano, prendere la siringa da 1 ml contenente il innoculum, dotato di sonda gastrica l'ago piegato con le mani a destra e inserire l'ago nella trachea fino a quando la curva è l'ago dalla incisivi davanti. Spingere il pistone in modo uniforme di consegnare il innoculum. Il innoculum non bolla. Estrarre l'ago della trachea nel più breve tempo possibile. I topi si soffoca e muore, se la trachea è bloccata per troppo tempo. Tenere il mouse in posizione verticale per qualche secondo per permettere innoculum di essere inalate nei polmoni. </li><li> Prendete il mouse fuori della piattaforma e vicino ad una lampada riscaldante. Non lasciare i topi sotto il fuoco diretto per lunghi periodi di tempo. Il mouse dovrebbe essere pienamente sveglio entro 30 minuti dopo la procedura (tempi di recupero possono variare in base ceppi). I topi devono essere osservati diligentemente durante questo tempo e non deve essere consentito di avere troppo caldo o troppo freddo, potrebbe anche mettere i topi in distress respiratorio che portano alla morte. </li></ol> 4. La raccolta e la lavorazione del polmone linfonodi drenanti e polmoni per citometria a flusso<ol><li> Sacrificio topo, utilizzando il metodo desiderato secondo le linee guida del AVMA eutanasia. Questo può variare a seconda dei risultati raccolti individuali. Somministrazione di un letale non di sodio pentobarbital è un esempio di una procedura di eutanasia appropriata. Non abbiamo visto gli effetti negativi polmonare di eutanasia da parte di CO 2. </li><li> Pin le braccia e le gambe su una tavola di dissezione. Fare un'incisione lungo il centro del lato ventrale con le forbici. Tirare delicatamente la pelle ed esporre i muscoli della parete toracica. </li><li> Praticare incisioni attraverso i muscoli della parete toracica per esporre gli organi addominali. </li><li> Tenere la punta dello sterno, con la pinza e perforare la membrana. Tagliare la membrana lungo i lati della gabbia toracica. </li><li> Con le forbici parallele alla superficie della scheda dissezione, tagliare la cavità toracica lungo il dorso-ventrale linea su entrambi i lati. </li><li> Sollevare leggermente la gabbia toracica in su. Sul lato destro del cuore, proprio sotto il timo, cercare due linfonodi. Un nodo leggermente più grande linfa terzo si trovano sotto un piccolo vaso arterioso che corre perpendicolare alla trachea. Linfonodi raccolta in 1 ml di mix di digestione dei linfonodi. </li><li> Dopo la raccolta i linfonodi, tenere il cuore con un paio di pinze e afferrare i polmoni con un altro. Polmoni raccolta in 3 ml di ghiaccio PBS freddo in un 6-pozzetti. </li><li> Separare i lobi dei polmoni, aspirare PBS e tagliare i lobi in piccoli pezzi con pinze e forbici. Aggiungere 3 ml della miscela di digestione per i polmoni. Tenere il 6 pozzetti sul ghiaccio durante questa fase. </li><li> Incubare i linfonodi per 25-30 min e polmoni per 30 minuti a 37 ° C. Aggiungi EDTA a una concentrazione finale di 10mM a ciascuna delle miscele di digestione per bloccare la reazione e il luogo sul ghiaccio. </li><li> Utilizzando una siringa da 3 ml, passare i pezzi di polmoni attraverso un ago 18GA 3 volte. Mash i pezzi dei polmoni e il LNs attraverso 70-100μm filtri cellulare utilizzando il back-end di un stantuffo della siringa da 1 ml. Lavare i filtri cella con 10 ml di HBSS senza Ca 2 + e Mg 2 +. Centrifugare a 500 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di tampone di lisi e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 ml di HBSS senza Ca 2 + e Mg 2 + per placare la lisi. Centrifugare a 500 xg per 5 min. Portare il polmone e sospensioni cellulari LDLN singola 10ml e 5 ml, rispettivamente. Contare le cellule vive usando un emocitometro per esclusione trypan blu. Le cellule sono ora pronti a macchia di citometria a flusso. 1 lobo del polmone potrebbe essere sufficiente per la citometria a flusso. Lobi altri possono essere utilizzati per altre questioni sperimentali all'interno del mouse stesso, come omogenati di citochine o di tessuto per esame istologico. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: PMA e macrofagi alveolari dei polmoni acquisire antigene dagli spazi alveolari dei polmoni immediatamente dopo l'iniezione. La figura 3 mostra la percentuale di CD11c + (espresso sulla PMA e macrofagi alveolari), le cellule che sono positivi per spore di Bacillus anthracis fluorescente, 30 minuti dopo che l'iniezione. In questo momento, ~ 15,9% di CD45 + + CD11c cellule nella sospensione singola cellula del polmone nutrito spore Bacillus anthracis (Figura 3, pannelli inferiori). Per un'ulteriore caratterizzazione di cellule CD11c + nei polmoni, fare riferimento a Kim e Braciale 4. Perline fluorescente sono normalmente utilizzati per valutare il traffico di antigeni particolato LDLNs 9. Per valutare questo trasporto dai polmoni al LDLNs, fluorescente sfere di lattice che sono stati iniettati con LPS e LDLNs sono stati analizzati a 24 HPI. Circa il 4% delle cellule CD11c hi nel LDLNs ospitava perline fluorescenti a 24hpi (Figura 4). Questi esperimenti dimostrano che questo rappresentante protocollo può essere efficacemente utilizzato per tenere traccia delle cellule che acquisiscono antigeni particelle inalate nei polmoni e, successivamente, li il traffico verso il LDLNs. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Piattaforma di legno per immobilizzare i topi durante lo iniezione. Un blocco di legno è stato tagliato in un angolo e barre di metallo sono stati montati, la facciata figura 1a) e 1b vista laterale figura). Un piccolo pezzo di filo era avvolto intorno alla barra di metallo per ancorare gli incisivi davanti al mouse. Un pezzo di nastro è stato fissato alla piattaforma di legare attorno al mouse per mantenere in posizione durante la procedura. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Aghi sonda gastrica per esso iniezione. Un ago sonda gastrica (a destra) è stato piegato ad un angolo di ~ 135 ° (a sinistra) per lo iniezione. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Percentuale di tutte le cellule + CD11c nei polmoni che lo porto GFP iniettato esprimere Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), sfida dopo 5 ore. AJ topi sono stati sfida con 1x10 8 GFP-spore di Bacillus anthracis ei polmoni sono stati analizzati presso l'infezione dopo 5 ore. I grafici mostrano punto percentuale di CD11c + cellule dei polmoni che sono positivi per il Bacillus anthracis. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Rilevamento di perline fluorescenti (giallo / verde) nel polmone linfonodo drenante 24 ore successive i. Iniezione t. AJ topi sono stati trattati con PBS (pannello di sinistra) o 5x10 9 Fluoresbrite YG Microsfere (0.5μm) con 10μg LPS (pannello di destra) sono stati analizzati e LDLNs 24hpi. Rappresentante trame dot mostrare la percentuale di cellule CD11c hi nel LDLNs che porto perline fluorescenti tramato contro un canale vuoto.

<ol><li>Grayson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+lung+dendritic+cell+maturation+and+migration+during+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection.</a> J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).</li>
<li>GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+between+dendritic+cell+subsets+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor between dendritic cell subsets of the lung.</a> Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).</li>
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<li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li>
<li>Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo utilizzato questo protocollo per studiare il traffico di spore di Bacillus anthracis dai polmoni al LDLNs. Per le applicazioni simili, il numero di particelle consegnato ai polmoni dovrebbero essere scelti con cura in modo che il materiale iniettato può essere rilevato nel LDLNs mediante citometria di flusso. Abbiamo anche utilizzato con successo questo metodo per il trasferimento adottivo di cellule e l&#39;etichettatura delle popolazioni specifiche cellule del polmone utilizzando anticorpi fluorescent...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Cella stariner 70μm </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anilina blu </td><td> Pescatore </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;alimentazione degli animali ago </td><td> Popper e Sons Inc </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi TypeIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG Microsfere (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laringoscopio Lama </td><td> PennCentury, Inc </td><td> Per il modello LS-1 </td><td> Fare riferimento a <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Leggero laringoscopio a fibre ottiche </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso Perline fluorescente (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Per l&#39;iniezione ip </td></tr><tr><td> Xylazina (100mg/ml) </td><td> Lloyd Laboratori </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Fagociti come i macrofagi alveolari e le cellule dendritiche del polmone (PMA) in continuo campione antigeni dagli spazi alveolari dei polmoni. PMA, in particolare, sono noti a migrare verso i nodi polmone drenaggio linfatico (LDLNs) dove sono presenti gli antigeni inalati alle cellule T di avviare un&#39;adeguata risposta immunitaria a una varietà di immunogeni 1,2. Alle interazioni modello tra i polmoni e gli antigeni aeree nei topi, gli antigeni può essere somministrato per via intranasale 1,3,4, intratracheally 5 o sotto forma di aerosol 6. Consegna da ogni tracciato prevede distinte competenze tecniche e limitazioni che devono essere considerati prima di progettare un esperimento. Per esempio, l&#39;esposizione intranasale e aerosol antigeni offre ad entrambi i polmoni e il tratto respiratorio superiore. Quindi antigeni possono accedere al tessuto linfoide associato nasale (NALT) 7, potenzialmente complicare l&#39;interpretazione dei risultati. Inoltre, la deglutizione, lo starnuto e la frequenza respiratoria del mouse può anche portare a incongruenze nelle dosi consegnate. Anche se il coinvolgimento del tratto respiratorio superiore può essere preferito per alcuni studi, può complicare esperimenti concentrandosi sugli eventi specificamente avviata nei polmoni. In questa impostazione, il intratracheale (it) percorso è preferibile in quanto offre materiali di prova direttamente nei polmoni e ignora il NALT. Molti protocolli di iniezione coinvolgere l&#39;intubazione sia cieco della trachea attraverso la cavità orale o esposizione chirurgica della trachea per accedere ai polmoni. Qui, descriviamo un semplice, coerente, metodo non chirurgico per esso l&#39;instillazione. L&#39;apertura della trachea è visualizzata utilizzando un laringoscopio e un ago piegato sonda viene quindi inserito direttamente nella trachea di consegnare il innoculum. Abbiamo anche descrivere le procedure per la raccolta ed elaborazione dei LDLNs e polmoni per l&#39;analisi del traffico di antigeni in citometria a flusso.

Illustriamo non chirurgica consegna dei materiali di prova nei polmoni di topi anestetizzati attraverso la trachea. Questo metodo permette l&#39;esposizione dei polmoni a patogeni batterici e virali, citochine, anticorpi, perline, prodotti chimici o coloranti. Approfondiremo la raccolta ed elaborazione dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante (LDLNs) per la citometria a flusso.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Le cellule fagocitiche, come i macrofagi alveolari e le cellule dendritiche polmonari (LDC), campionano continuamente gli antigeni dagli spazi alveolari dei polmoni. Le LDC, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare in modo non chirurgico un materiale di prova nei polmoni di topi utilizzando un ago per gavaggio e successivamente analizzare i polmoni e i linfonodi drenanti dei polmoni. Questo viene ottenuto inserendo innanzitutto un laringoscopio illuminante e un ago per gavaggio piegato nella trachea di un topo anestetizzato. Il materiale di prova viene quindi instillato nei polmoni dell'animale tramite il laringoscopio e l'ago per gavaggio.Successivamente, vengono estratti i polmoni e i linfonodi drenanti. Infine, i polmoni e i linfonodi vengono processati per ottenere sospensioni cellulari singole. In definitiva, questo metodo facilita l'analisi mediante citometria a flusso dell'associazione del materiale in esame con le cellule immunitarie polmonari e del traffico cellulare verso i linfonodi drenanti dei polmoni.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le esposizioni intranasali e aerosolizzate, è che consente una somministrazione mirata del materiale in esame direttamente nei polmoni, bypassando il tessuto linfatico associato al naso. Inoltre, è semplice da eseguire rispetto ai metodi chirurgici di installazione intratracheale. A dimostrare la procedura saranno Elizabeth Enti, una ricercatrice postdottorato nel laboratorio di Richie, e Manji, uno studente laureando nel laboratorio di lens.Dopo aver anestetizzato il topo, preparare l'inoculo in 50 microlitri di soluzione salina. Riempire una siringa da un millilitro dotata di un ago sterile curvo per gavaggio con l'inoculo. Caricare la siringa con una bolla d'aria da 100 microlitri dietro l'inoculo per assicurare che tutto il liquido venga somministrato nei polmoni.Posizionare il topo sul piattaforma di legno inclinata, sospeso per i denti incisivi al filo metallico, e immobilizzarlo delicatamente con un pezzo di nastro. Successivamente, accendere il laringoscopio con una mano e utilizzare l'altra mano per afferrare una pinzetta ottusa. Usare la punta del laringoscopio e la pinzetta per aprire delicatamente la bocca con la pinzetta.Estrarre la lingua e mantenerla lateralmente. Indirizzare la lama del laringoscopio verso la parte posteriore della bocca. Mantenere il laringoscopio premuto delicatissimamente a un angolo di 90 gradi fino a quando non si riesce a vedere l'apertura della trachea.Tenendo il laringoscopio fermo con una mano, prendere con l'altra mano la siringa da un millilitro munita di ago per gavaggio piegato contenente l'inoculo. Inserire l'ago nella trachea fino a quando la curvatura dell'ago si trova a livello degli incisivi anteriori. Premere lo stantuffo in modo uniforme per somministrare l'inoculo senza formare bolle.Estrarre immediatamente l'ago dalla trachea. Tenere il topo in posizione eretta per alcuni secondi per permettere l'inalazione dell'inoculo nei polmoni. Posizionare il topo vicino a una lampada riscaldante e lasciarlo riprendere conoscenza.Dopo l'eutanasia, fissare le zampe del topo su un tavolo da dissezione. Praticare un'incisione lungo la linea mediana della superficie ventrale con le forbici. Sollevare delicatamente la pelle ed esporre il peritoneo.Eseguire incisioni sul peritoneo per esporre gli organi addominali. Afferrare la punta dello sterno con la pinzetta e perforare il diaframma con le forbici. Tagliare il diaframma lungo i lati della gabbia toracica con le forbici, parallelamente alla superficie del piano di dissezione.Tagliare attraverso la cavità toracica lungo la linea dorsoventrale su entrambi i lati leggermente. Sollevare la gabbia toracica sul lato destro del cuore. Subito sotto il timo, cercare due linfonodi.Un terzo linfonodo leggermente più grande si trova al di sotto di un piccolo vaso sanguigno arterioso che corre perpendicolare alla trachea. Raccogliere i linfonodi in un millilitro di soluzione di digestione dei linfonodi, mescolare e porre sul ghiaccio. Dopo aver raccolto i linfonodi, prelevare i polmoni e trasferirli in una piastra a sei pozzetti.Mantenendo la piastra a sei pozzetti sul ghiaccio, aspirare il PBS e tagliare i lobi in piccoli pezzi utilizzando pinzette e forbici. Tenere fermo ciascun linfonodo con un ago da 26 gauge e sminuzzarlo con un secondo ago da 26 gauge. Per assicurare il rilascio di tutte le cellule, aggiungere tre millilitri della miscela di digestione per i polmoni e un millilitro per i linfonodi.Dopo aver incubato i linfonodi per 25-30 minuti e i polmoni per 30 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere EDTA fino a una concentrazione finale di 10 millimolare a ciascuna delle miscele di digestione per arrestare la reazione, quindi porle sul ghiaccio. Utilizzando una siringa da tre millilitri, far passare i pezzi di polmone attraverso un ago da 18 gauge. Schiacciare tre volte i pezzi di polmone e dei linfonodi attraverso filtri cellulari da 70 a 100 micron.Utilizzando la parte posteriore dello stantuffo di una siringa da un millilitro, lavare i filtri cellulari con 10 millilitri di HBSS senza calcio e magnesio. Centrifugare i campioni cellulari a 500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere i pellet in cinque millilitri di tampone per la lisi dei globuli rossi e incubare per tre minuti.A temperatura ambiente, aggiungere 10 millilitri di HBSS senza calcio e magnesio per interrompere la lisi e centrifugare i campioni a 500 ×g per cinque minuti. Portare il polmone e i linfonodi linfatici drenanti del polmone, rispettivamente, a sospensioni cellulari singole di 10 millilitri e 5 millilitri. Contare le cellule utilizzando l'esclusione del triptan blu in un emocitometro.In queste due figure, i topi AJ sono stati sottoposti a sfida con un miliardo di spore di basille di rassis, e i polmoni sono stati analizzati mediante citometria a flusso a 30 minuti dall'infezione. Questi diagrammi a dispersione mostrano la strategia di selezione. Questi pannelli mostrano la percentuale di cellule polmonari positive per CD45 e positive per CD11c che risultano positive per le spore di Bacillus anthracis.In questa figura, i topi AJ sono stati iniettati per via intratraqueale e successivamente sono stati analizzati i linfonodi drenanti del polmone. I diagrammi a dispersione rappresentativi mostrano la percentuale di cellule CD11C high nei linfonodi drenanti del polmone che contengono microsfere fluorescenti, riportate rispetto a un canale vuoto. Il pannello a sinistra mostra i risultati ottenuti da topi iniettati con PBS, mentre il pannello a destra mostra i risultati di topi iniettati con cinque volte 10 alla nove floras, microsfere giallo-verde brillanti con 10 microgrammi di LPS.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo, ad esempio quali eventi vengono specificamente avviati nei polmoni e come gli antigeni inalati vengono trasportati dai polmoni ai linfonodi drenanti.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

L'uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell'uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

L'obiettivo di questo lavoro è quello di descrivere i metodi semplici che sarà di grande aiuto nella messa a punto e l'analisi dei polmoni del mouse con cancro ai polmoni o altre patologie. Vi presentiamo 3 protocolli modo semplice e affidabile per effettuare instillazioni polmone, la fissazione, e misurazioni del volume polmonare.

Instillazione e fissaggio Metodi utili in mouse Lung Cancer Research

Questo articolo presenta un metodo rapido e semplice per l'amministrazione bleomicina direttamente nella trachea del mouse tramite intubazione. I principali vantaggi di questo metodo sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, e non richiede attrezzature specializzate o tempi di recupero lunghi.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Si descrive un metodo per la generazione di precisione intercettato Lung fette (PCLS) e immunocolorazione loro di visualizzare la localizzazione dei vari tipi di cellule immunitarie nel polmone. Il nostro protocollo può essere esteso per visualizzare la posizione e la funzione dei diversi tipi di cellule in una varietà di condizioni.

Taglio di precisione polmone mouse Fette per la visualizzazione in diretta cellule dendritiche polmonare

Qui descriviamo un modello di trapianto orthotopic syngeneic minimamente invasiva delle cellule di adenocarcinoma del polmone del topo come un modello di tempo - e riduzione dei costi per studiare il cancro del polmone non a piccole cellule.

Trapianto orthotopic delle cellule dell'Adenocarcinoma del polmone Syngeneic studiare espressione PD-L1

La somministrazione intratracheale (IT) di agenti sperimentali nei topi spesso si traduce in consegna asimmetrica ai polmoni distali.  In questa relazione, descriviamo un approccio intrabronchiale diretto (IB) per cannulare ogni polmone in topi viventi non chirurgici.  Questo approccio può essere utilizzato per somministrare selettivamente gli agenti a un polmone o può essere adattato per migliorare la somministrazione simmetrica dell'agente a entrambi i polmoni.

Amministrazione intrabronchiale diretta per migliorare la deposizione selettiva dell'agente all'interno del polmone del mouse

In questo studio, presentiamo un protocollo efficace e riproducibile per isolare le popolazioni immunitarie del sistema respiratorio murino. Forniamo anche un metodo per l'identificazione di tutte le cellule immunitarie innate e adattative che risiedono nei polmoni di topi sani, utilizzando un pannello di citometria a flusso a 9 colori.

Analisi citometrica a flusso per l'identificazione delle cellule immunitarie innate e adattative del polmone murino

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

Il modello murino di trapianto tracheale intrapolmonare (IPTT) è utile per lo studio della malattia obliterante delle vie aeree (OAD) dopo il trapianto di polmone. Offre approfondimenti sul comportamento immunologico e angiogenico polmonare specifico nell'obliterazione delle vie aeree dopo allotrapianto con elevata riproducibilità. Qui descriviamo la procedura IPTT e i suoi risultati attesi.

Trapianto tracheale intrapolmonare murino: un modello per lo studio della malattia obliterante delle vie aeree dopo il trapianto di polmone

Impara un metodo non chirurgico per instillare materiali nei polmoni di topi anestetizzati e analizzare cellule immunitarie polmonari e linfonodi drenanti mediante citometria di flusso.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

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