Name: Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Impara due metodi in vitro per valutare la citotossicità mediata da linfociti T CD8+ nelle cellule beta pancreatiche: il saggio di rilascio del Cromo-51 e l'imaging in tempo reale con marcatori del potenziale mitocondriale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health DK074656 e AI56374 (CEM), così come la Juvenile Diabetes Research Foundation.

1. Preparazione di cellule <ol><li> Obiettivo coltura cellulare: Cultura delle linee di cellule beta del mouse, NIT-1 e NIT-4, era un 1,2 precedentemente descritta in DMEM supplementato con 10% FBS, 0,02% BSA, non aminoacidi essenziali, HEPES 15mm, 16,5 mm Glocose e penicillina / streptomicina. Per 51 etichettatura Cr, le cellule di semi in un piatto fondo da 96 pozzetti alla piastra di coltura 5X10 4 cellule / pozzetto in 200 microlitri terreno di coltura. Per gli esperimenti di microscopia, le cellule di semi in un 8-ben Lab-Tak II chambered coprioggetti 5x10 a 4 per camera in 500 microlitri terreno di coltura, e consentono di crescere per 48 ore prima di utilizzare negli esperimenti di citotossicità. </li><li> Controllo di colture cellulari linea T: Utilizzare la riga di cellule Jurkat (ATCC, CD3 + umano linea cellulare dei linfociti) come controllo negativo. Cellule in coltura Jurkat RPMI1640 supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1,5 g / L di bicarbonato di sodio, 10 HEPES mM e 1.0 mM di piruvato di sodio. </li></ol> 2. La raccolta e l'attivazione di effettori autoreattivi cellule T CD8 + NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] e NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] sono stati acquistati da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e allevati nella nostra struttura mouse. F1 progenie ibrida da accoppiamenti di NOD-AI4a con NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] sviluppare il diabete a 3-5 settimane di età. Tutti i topi sono stati ospitati in specifici esenti da organismi patogeni strutture e approvato dalla cura degli animali all'istituzione competente e del comitato Usa. <ol><li> Eutanasia 3-4 settimana di vita NOD-AI4a / b topo, utilizzando CO 2. </li><li> Raccogliere milza di topi. Topi eutanasia sono preparati con spray etanolo e aperto sotto il cofano chirurgico. Milza vengono rimossi e messi in gelide tampone HBSS immediatamente. </li><li> Raccogliere le cellule della milza con un 7 ml di vetro omogeneizzatore. Due o tre ogni milza sono messi in 5 ml di HBSS freddo e omogeneizzato con una ML 7, vetro omogeneizzatore. Omogeneizzato viene raccolto e centrifugato a 1200rpm per 5 minuti a 4 ° C con una Sorvall RT7 centrifuga +. Pellet cellulari sono raccolti. </li><li> Rimuovere i globuli rossi con il trattamento ipotonico soluzione. I pellets sono trattati con 5 ml di soluzione ipotonica / milza in ghiaccio per 5 minuti, poi neutralizzato con l'aggiunta di un uguale volume di HBSS. Raccogliere le cellule per centrifugazione, come sopra, e risospendere in 50 HBSS ml. Passare attraverso le cellule sospese filtro cellulare e conta con un emocitometro con colorazione TrypanBlue. </li><li> Attivare le cellule. Risospendere le cellule a 5x10 6 / ml e attivare utilizzando una cultura 3 giorni con 0,1 mM AI4 mimotopo (amino YFIENYLEL sequenza di acido) e 25 U / mL di IL-2 in RPMI1640 supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1,5 g / L bicarbonato di sodio, 10 HEPES mM e 1.0 mM di piruvato di sodio. </li></ol> 3. 51 saggio di rilascio Cr esaminare CML <ol><li> Cellule bersaglio Etichetta: Aggiungi 51 Cr di indirizzare le cellule a 1 μCi / bene e cultura per 3 ore, e lavare 3 volte con terreno di coltura. </li><li> Sospendere cellule effettrici in RPMI 1640 medium, come indicato al punto 2,5 in modo che il volume finale aggiunti a ciascun pozzetto è di 200 microlitri. </li><li> Dopo l'ultimo lavaggio delle cellule bersaglio marcato, aggiungere attivato cellule effettrici di colture di cellule effettrici il target a bersaglio desiderato (E: T) rapporti. Usiamo solitamente E: T ratio a 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 e 50:1. </li><li> Aggiungi fresca modificato RPMI 1640 medium (vedi punto 2.5) a 6 pozzi di cellule bersaglio per fungere da controllo lisi spontanea. </li><li> Co-coltura le cellule effettrici e la destinazione di 16 ore. </li><li> Raccogliere il supernatante in tubi 6x50 mm Vetro Lime </li><li> Lisare le cellule con l'aggiunta di 100μl 2% SDS e pipettaggio più volte con delicatezza. </li><li> Raccogliere lisato cellulare in un altro insieme di tubi 6x50 mm Vetro Lime. </li><li> Lavare una volta con i pozzi puliti H 2 O e aggiungere il lavaggio di tubi lisato la cella. </li><li> Contare il supernatanti e lisati cellulari mediante un contatore gamma. </li><li> Calcolare lisi specifica quanto segue: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="Equazione 1"></li></ol> 4. Colorazione delle cellule per l'imaging cellulare dal vivo Tra le più comunemente utilizzati coloranti potenziale della membrana mitocondriale, TMRM espone la tossicità mitocondriale meno. 3 Perciò, scegliamo TMRM per questi studi dal vivo imaging cellulare. <ol><li> Preparare uno stock 40 mM soluzione TMRM in DMSO e conservare a -20 ° C. Fare una [25 nM] fresca soluzione di lavoro in rosso fenolo senza DMEM con tutti i supplementi per NIT-1 coltura cellulare 1. </li><li> Macchia obiettivo NIT-1 con cellule TMRM 25 nM per 30 min a 37 ° C. </li><li> Sostituire il supporto con mezzi freschi contenente 5 nM TMRM a mantenere la distribuzione di equilibrio del colorante 4. </li><li> Conte attivato cellule T effettrici AI4 utilizzando un hematocytometer. </li><li> Macchia attivato AI4 effettrici delle cellule T con 1 ml / ml per PicoGreen5 minuti a temperatura ambiente e lavare con rosso fenolo senza terreno di coltura per 3 volte. </li></ol> 5. La valutazione dei linfociti T-mediata morte delle cellule beta utilizzando l'imaging cellulare dal vivo <ol><li> Montare il coprioggetti camerati con le cellule NIT colorate sul palco di una Zeiss LSM 510 microscopio confocale. Rimuovere la linguetta con un dremmel e il gas sterilizzare il vetro con ossido di etheline camerati. Il palco è dotato di un live-cellule in camera di imaging che ha temperatura controllata a 37 ° C e 5% di CO 2 con l'umidità. </li><li> Aggiungi attivato e colorate le cellule T per camere designato a diversi E: T ratio. </li><li> Ha aggiunto lo stesso numero di cellule Jurkat colorate alle camere di controllo. </li></ol> 6. Ottenere immagini di cellule vive Il microscopio è dotato di uno stadio motorizzato che ci ha permesso di acquisire le immagini riprese in luoghi diversi dalle camere stesso o diverso automaticamente nel corso del tempo l'esperimento. <ol><li> Utilizza un obiettivo 63x obiettivo di olio, prendete le immagini ad un intervallo di ogni 3 minuti per un totale di 300 fotogrammi al luogo. </li><li> Rileva colorazione TMRM utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 543 nm e set di filtri per l'emissione di 565-619 nm </li><li> Rileva colorazione PicoGreen utilizzando una eccitazione 488 nm e un set di filtri per l'emissione di 500-630 nm. Il video è stato creato utilizzando il software LSM Zeiss. </li></ol> 7. Conversione video per la pubblicazione <ol><li> Utilizzando il software LSM Zeiss, creare un file compresso filmato in un formato AVI. </li><li> Per convertire i video nel formato di pubblicazione, importare il video nel pacchetto software FIJI ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), un ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) distribuzione, usando il plugin Bioformats da LOCI ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Regolare le impostazioni di luminosità e il contrasto per bilanciare i segnali verde e rosso e il frame rate è stato fissato a 2 fotogrammi / secondo utilizzando il menu opzioni di animazione. </li><li> Ritagliare il video a 512 x 512 pixel ed esportare come un file AVI non compresso. </li><li> Aprire questo file AVI nel software QuickTime 7 (computer Apple, Cupertino, CA) e comprimere e di esportazione nel formato aperto di file video H264/MPEG-4 a 1200 kbs / secondo. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Un risultato rappresentativo di 51 test Cr CML. La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo di un saggio in cui CML lisi specifiche per cento (asse Y) aumenta con l'Effector: rapporto di destinazione (asse X) aumenta. Cellule bersaglio sono isolotti primarie isolate da immunodeficienti NOD RAG1-/ -. Topi ed etichettato con 51 Cr. Splenociti da topi transgenici NOD.AI4α / β sono isolati e attivata come descritto al punto 2. Obiettivi e effettori sono stati co-coltura per 16 ore. Lisi specifiche per cento è calcolato come descritto al punto 3.11. </li><li> Due rappresentative (positivi e negativi) i risultati di una T cellulo-mediata della membrana delle cellule beta dissipazione mitocondriale potenziali sono presentati. Le cellule sono colorate e le reazioni sono registrate come descritte ai punti 4, 5 e 6 di cui sopra, i file video sono creati come al punto 7. Video 1: La versione beta linea di topi cellule NIT-1 è stato macchiato il potenziale di membrana mitocondriale TMRM colorante (rosso). Attivato, autoreattivi delle cellule T CD8 + AI4 (verde tinto con PicoGreen) sono stati co-coltura con queste NIT-1 le cellule a E: T rapporto di 50:1. NIT-1 potenziale della membrana mitocondriale dissipata gradualmente nel corso di 400 minuti di durata, ma solo nei distretti che sono stati interagendo con le cellule T AI4. Video 2: Come esperimento di controllo, NIT-1 le cellule sono state colorate con TMRM e co-coltura con cellule Jurkat PicoGreen colorate a E: T rapporto di 50:1. Cellule Jurkat sono un essere umano linea di cellule T che è MHC non corrispondenti. NIT-1 le cellule mantenuto il potenziale della membrana mitocondriale per tutta la durata dei 400 minuti di co-incubazione. Cellule Jurkat non hanno interagito con NIT-1 cluster e quindi non provocare l'uccisione. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1 risultato Rappresentante della LMC utilizzando come isolotti cellule bersaglio primario isolate da immunodeficienza NOD.Rag1-/ -. Topi e splenociti da topi transgenici NOD.AI4α / β. Obiettivi e effettori sono stati co-coltura per 16 ore. Lisi per cento specifica aumenta con l'Effector: aumenta il rapporto di destinazione. Video 1. Linea di cellule beta del mouse NIT-1 è stato macchiato il potenziale della membrana mitocondriale TMRM colorante (rosso). Attivato autoreattivi delle cellule T CD8 + AI4 (verde tinto con PicoGreen) sono stati co-coltura con queste NIT-1 le cellule in E: rapporto T di 50:1. NIT-1 potenziale di membrana mitocondriale dissipazioneTed gradualmente nel corso di 400 minuti di durata, ma solo nei distretti che sono stati interagendo con verde AI4 cellule T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Clicca qui per vedere il video</a> . Video 2. NIT-1 le cellule sono state colorate identiche a quelle descritte nel video 1 e co-coltura con PicoGreen macchiata linea di cellule umane Jurkat T. NIT-1 le cellule erano in grado di mantenere il potenziale della membrana mitocondriale pensato la durata di 400 minuti. Cellule Jurkat non hanno interagito con NIT-1 cluster e quindi non provocare l'uccisione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Clicca qui per vedere il video</a> .

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dalla University of Animal Care Florida e del Comitato Istituzionale Usa.

Cellule T citotossiche mediate la morte delle cellule beta è la fisiopatologia principale di diabete di tipo 1 5. Saggi di CML con 51 rilascio Cr ci permettono di studiare il grado di effettrici bersaglio risposta 6. Tuttavia, il processo dettagliate e percorsi di T mediata dalle cellule morte delle cellule beta non è ancora pienamente compreso. Dal momento che i mitocondri sono fondamentali per la funzione delle cellule beta e la morte 7, ci siamo concentrati sui cambiamenti ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> CR-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrametil rodamina estere metilico (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotopo </td><td> mimotopes.com </td><td> aminoacido sequenza: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; S </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminoacidi non essenziali </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gemelli </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso fenolo senza DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HERAcell 150i </td><td> Mantenuto sterile per colture cellulari </td></tr><tr><td> Cappa di sicurezza biologica </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi cultura usa e getta, 6x50 millimetri di vetro Lime </td><td> Pescatore </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> Gamma contatore </td><td> Perkin Elmer </td><td> Wizard 1470 Gamma contatore automatico </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td> Confocale LSM 510 Meta </td><td> Con stadio motorizzato e la camera di cellule vive </td></tr><tr><td> Pipetta (1 ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubi (Ambra) </td><td> Pescatore </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Sorvall Legenda RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio verticale </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Mice </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Mice </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / mice β F1 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Impianto di animali allevati in UF </td></tr></tbody></table>

metodi per valutare la morte delle cellule beta mediata da linfociti t citotossici

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Diabete di tipo 1 (T1D) è una malattia mediata da cellule T autoimmuni. Durante la patogenesi, i pazienti diventano progressivamente più insulinopenic come la produzione di insulina è perso, probabilmente questa è dovuta alla distruzione delle cellule beta pancreatiche da parte delle cellule T. La comprensione dei meccanismi di morte delle cellule beta durante lo sviluppo del diabete di tipo 1 fornirà spunti per generare una cura efficace per questa malattia. Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC), saggi, storicamente, hanno utilizzato il radionuclide cromo 51 (51 Cr) per etichettare le cellule bersaglio. Questi obiettivi sono quindi esposti alle cellule effettrici e il rilascio di 51 Cr da cellule bersaglio viene letto come un&#39;indicazione di mediata dai linfociti morte cellulare. Inibitori di conseguenza la morte cellulare in versione ridotta di 51 Cr. Come cellule effettrici, abbiamo utilizzato un autoreattivi attivati ​​popolazione clonale di CD8 + linfociti T citotossici (CTL) isolato da un topo transgenico magazzino sia per l&#39;alfa e catene beta del recettore AI4 delle cellule T (TCR). AI4 cellule T attivate sono state co-coltura con 51 cellule bersaglio Cr etichettati NIT per 16 ore, il rilascio di 51 Cr è stato registrato per calcolare lisi specifiche Mitocondri partecipare a molti eventi fisiologici importanti, come la produzione di energia, regolazione della trasduzione del segnale, e l&#39;apoptosi. Lo studio delle cellule beta cambia mitocondriale funzionale durante lo sviluppo di diabete di tipo 1 è una zona nuova della ricerca. Utilizzando il potenziale di membrana mitocondriale colorante tetrametile rodamina estere metilico (TMRM) e confocale di immagini microscopiche cellule vive, abbiamo monitorato il potenziale della membrana mitocondriale nel corso del tempo nella linea di cellule beta NIT-1. Per gli studi di imaging, le cellule T effettrici AI4 sono stati etichettati con il colorante fluorescente nucleare colorazione PicoGreen. NIT-1 le cellule e le cellule T sono state co-coltura in chambered coprioggetti e montato sul palco microscopio dotato di una camera di cellule vive, controllata a 37 ° C, con il 5% di CO 2, e umidificata. Durante questi esperimenti immagini sono state prese di ogni cluster ogni 3 minuti per 400 minuti. Più di un corso di 400 minuti, abbiamo osservato la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale in NIT-1 gruppi di cellule in cui sono state allegate AI4 cellule T. Nell&#39;esperimento controllo simultaneo in cui NIT-1 cellule sono state co-coltura con MHC mis-matched cellule umane Jurkat linfociti, potenziale di membrana mitocondriale è rimasto intatto. Questa tecnica può essere usata per osservare in tempo reale i cambiamenti del potenziale di membrana mitocondriale nelle cellule sotto l&#39;attacco dei linfociti citotossici, citochine o altri reagenti citotossici.

Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC) test può essere usato per testare le risposte autoreattivi e lo studio dei meccanismi di morte cellulare in vitro. Tuttavia, utilizzando tecniche confocale live-cell immagini microscopiche con coloranti fluorescenti, il tipo e la cinetica di morte cellulare così come i percorsi utilizzati possono essere studiati in maggiore dettaglio.

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Il diabete di tipo 1 (T1D) è una malattia autoimmune mediata dalle cellule T. Durante la patogenesi, i pazienti diventano progressivamente più insulinopenici man mano che l'insulina...

Il diabete di tipo uno è una malattia autoimmune in cui le cellule beta pancreatiche, responsabili della secrezione di insulina, vengono distrutte da linfociti T autorreattivi. Comprendere i meccanismi coinvolti fornirà indicazioni utili per sviluppare una terapia efficace contro questa patologia. Di seguito vengono descritti due metodi per osservare in vitro la distruzione specifica delle cellule beta pancreatiche mediata da linfociti T CD8 positivi: un saggio di linfoctossicità mediata da cellule, o CML, basato sul cromo 51 e un saggio CML visivo, per entrambi i metodi.I linfociti T effetori CD8 positivi vengono prima preparati da milze di topo per eseguire un saggio CML; cellule beta bersaglio knit one o knit four vengono marcate con cromo 51 e co-colture con cellule effettrici. Quando le cellule beta bersaglio vengono uccise, il cromo 51 viene rilasciato. I soprannatanti e i lisati cellulari vengono quindi raccolti e i livelli di radioattività, che indicano l'entità della morte cellulare, vengono misurati utilizzando un contatore gamma per eseguire un saggio CML visuale; cellule beta bersaglio knit one e knit four vengono marcate con il colorante per il potenziale mitocondriale TM RM, le cellule effettrici vengono marcate con pico green.Le cellule vengono combinate e viene eseguita un'analisi con imaging di cellule vive per esaminare la velocità di morte cellulare indicata dalla dissipazione del potenziale della membrana mitocondriale. Il vantaggio principale di questo saggio rispetto ai saggi tradizionali, come il saggio di rilascio del cromo, è che possiamo osservare la morte delle cellule beta in tempo reale. Altri vantaggi includono la possibilità di determinare se la morte delle cellule beta mediata dai linfociti T CD8 dipende dal contatto diretto e, inoltre, questo saggio può essere ampliato utilizzando indicatori fluorescenti per mappare le vie della morte delle cellule beta.Questo metodo può rispondere a domande fondamentali sulla patogenesi di qualsiasi malattia in cui i linfociti T citotossici svolgano un ruolo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e possibilmente alla diagnosi, poiché la funzione mitocondriale è essenziale sia per la sopravvivenza sia per la fisiologia delle cellule beta. Jing Chen e io illustreremo questa procedura.Le cellule bersaglio utilizzate in questa dimostrazione sono le linee cellulari di beta cellule murine, knit one e knit four, e la linea cellulare di linfociti umani CD3+, che non riconosce né uccide le beta cellule murine, utilizzata come controllo negativo per le cellule effettrici. Qui sono riportate cellule T autoreattive CD8 positive ottenute dai milzi di topi NOD AI4αβF1 di età compresa tra tre e quattro settimane. Per ottenere le cellule, iniziare posizionando i milzi in un omogenizzatore in vetro da sette millilitri contenente cinque millilitri di HBSS ghiacciato. Omogeneizzare i milzi utilizzando un omogenizzatore Dounce, quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica e centrifugare a 250 ×g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante; quindi, per rimuovere i globuli rossi, risospendere il pellet in cinque millilitri di soluzione ipotonica per ogni milza. Incubare per cinque minuti sul ghiaccio.Dopo l'incubazione, lavare il pellet cellulare due volte con 10 millilitri di HBSS freddo di ghiaccio, centrifugando. Tra ogni lavaggio, risospendere il sospensione cellulare in 10 millilitri di HBSS freddo di ghiaccio. Quindi, utilizzando un emocitometro, contare le cellule dopo aver determinato i conteggi cellulari.Centrifugare nuovamente, quindi risospendere le cellule in RPMI 1640 integrato a una densità di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro; seminare le cellule a una densità di cinque volte 10 alla sesta per millilitro in un’alveola T75. Infine, per attivare le cellule, aggiungere all’alveola AI quattro miopene e IL due alle concentrazioni finali rispettivamente di 0,1 micromolare e 25 unità per millilitro, e incubare l’alveola in un incubatore con 5% CO₂ a 37 gradi Celsius per tre giorni. Le cellule attivate possono ora essere utilizzate per un saggio CML basato su ACROMIUM 51 oppure per un saggio CML visivo.Il saggio di citotossicità linfocitaria mediata da cellule, o CML, utilizza qui il rilascio di cromo 51 dalle cellule bersaglio come indicatore della morte delle cellule beta mediata da CD8. Per etichettare le cellule beta bersaglio di tipo knit one o knit four con cromo 51, iniziare seminandole a una densità di cinque volte 10 alla quarta cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in 200 microlitri di DMEM integrato, quindi incubare a 37 gradi Celsius e 5% CO2 per 24 ore. Il giorno successivo, diluire il cromo 51 in DMEM integrato fino a una concentrazione di un microcurie per 20 microlitri.Successivamente, aggiungere 20 microlitri di cromo 51 diluito in ciascun pozzetto contenente le cellule beta bersaglio, al fine di ottenere un microcurie per pozzetto. Collocare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5%CO2 e incubare per tre ore. Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo e lavare le cellule tre volte con mezzo di coltura fresco.Successivamente, aggiungere mezzo alle cellule effettrici CD8 positive attivate in modo che il volume finale aggiunto a ciascun pozzetto sia di 200 microlitri. Combinare le cellule effettrici con le colture di cellule beta bersaglio ai rapporti desiderati E:T; in questo caso, vengono utilizzati rapporti di 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 e 0,25:1 per preparare i controlli di lisi spontanea. Aggiungere mezzo fresco a sei pozzetti delle cellule beta bersaglio.Quindi posizionare la piastra nell'incubatore e co-colture le cellule effettrici e bersaglio per 16 ore. Il giorno successivo utilizzare una pipetta multicanale per trasferire il sopranatante in sei provette di vetro al calce da 50 millimetri. Quindi aggiungere al piatto cento microlitri di SDS al 2% per lisare le cellule e pipettare delicatamente su e giù per diverse volte.Trasferire il lisato cellulare in un nuovo set di sei provette in vetro al calce da 50 millimetri. Quindi, per assicurarsi che tutto il lisato cellulare venga raccolto, aggiungere cento microlitri di acqua sterile in ciascun pozzetto, aspirare e dispensare più volte e aggiungere il contenuto alle provette del lisato cellulare per determinare il grado di distruzione delle cellule beta. Misurare la radioattività nel sopranatante e nel lisato utilizzando un contatore a gamma una volta eseguiti i conteggi.Determinare la lisi specifica sottraendo la percentuale di conteggi nei supernatanti del controllo di lisi spontanea dalla percentuale di conteggi nei supernatanti sperimentali, come mostrato in questa equazione. Per esaminare la morte delle cellule beta mediata dai linfociti T in tempo reale, il potenziale della membrana mitocondriale viene monitorato mediante imaging in tempo reale di colture co-incidenti di cellule bersaglio ed effettori.Per preparare il campione per la microscopia, osservare le cellule beta bersaglio su vetrini a otto pozzetti modificati e sterilizzati, con una densità di cinque per 10 alla quarta cellule per pozzetto. Posizionare i vetrini in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% CO2 e lasciare crescere le cellule per 48 ore. Nel giorno dell'esperimento, aggiungere il colorante per il potenziale della membrana mitocondriale, tetraetilrodamina metil estere (TMRM), a 25 nanomolari e il mezzo DMEM privo di rosso fenolo e supplementato; incubare per 30 minuti.Dopo aver colorato le cellule con TMRM, sostituire il mezzo con del mezzo fresco contenente cinque nanomolar di TM RM per mantenere la distribuzione di equilibrio del colorante. Successivamente, contare le cellule T effettrici attivate AI quattro o le cellule di controllo jerk it mediante un emocitometro; sospendere le cellule in DMEM integrato privo di fenolo rosso in provette coniche da 15 millilitri alla concentrazione appropriata. In seguito, aggiungere il pico green alle cellule effettrici attivate o alle cellule di controllo jerk it fino a una concentrazione finale di un microlitro per millilitro.Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce, quindi incubare per cinque minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione. Lavare le cellule tre volte aggiungendo DMEM privo di rosso fenolo, mescolando brevemente e centrifugando a 250 ×g per cinque minuti. Per raccogliere le cellule da sottoporre a imaging, posizionare la camera da microscopia sul portacampioni di un microscopio confocale dotato di un portacampioni motorizzato e di una camera per imaging cellulare in condizioni di umidità controllata a 37 gradi Celsius e 5% CO₂.Aggiungere le cellule effettrici marcate con pico verde attivato nelle camere, utilizzando il rapporto effettrice:bersaglio da valutare. Il rapporto ET acquisito sarà di 50:1; impostare il software di acquisizione immagini per raccogliere immagini in quattro pozzetti con tre posizioni ciascuno ogni tre minuti, per un totale di 300 fotogrammi per posizione e con eccitazione mediante i set di filtri appropriati per TMRM e Pico Verde. Una volta raccolte tutte le immagini, queste devono essere convertite per la pubblicazione.Fiji e ImageJ vengono utilizzati con un plugin bioformats proveniente da loci. Maggiori dettagli sulla conversione dei video sono disponibili nel testo scritto allegato. È stato eseguito un saggio di citotossicità linfocitaria mediata da cellule o CML utilizzando il cromo 51, come descritto in questo video.Come mostrato qui, la percentuale di lisi specifica riportata sull'asse Y aumenta all'aumentare del rapporto effettore:bersaglio riportato sull'asse X. Per valutare la morte cellulare mediante imaging di cellule vive, la linea cellulare di beta cellule murine knit one è stata marcata con un colorante per il potenziale della membrana mitocondriale, TMRM, mostrato in rosso. Le cellule T autoreattive I four CD8 positive sono state marcate in verde con pico green e i due tipi cellulari sono stati coltivati in co-coltura a un rapporto E:T di 50:1, come si può vedere qui. Il potenziale della membrana mitocondriale delle knit one si è dissipato gradualmente nel corso di 400 minuti, ma soltanto negli aggregati che interagivano con le cellule T verdi AI four. Come esperimento di controllo, le cellule knit one marcate sono state invece coltivate con cellule T umane jerk at non compatibili per il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), marcate con pico green, come mostrato qui.Le cellule knit one sono state in grado di mantenere il potenziale della membrana mitocondriale per tutta la durata di 400 minuti. Le cellule circuit non hanno interagito con gli aggregati di knit one e quindi non hanno indotto la morte cellulare. Una volta padroneggiate.Questa tecnica richiede circa cinque giorni, inclusa la preparazione delle cellule. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come il potenziale di membrana delle cellule beta cambia quando sono attaccate da linfociti T autoreattivi. Non dimenticare che lavorare con radioisotopi può essere pericoloso e che si dovrebbe ricevere un'adeguata formazione e adottare le opportune precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.

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