Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

L'obiettivo generale della seguente procedura è generare rapidamente linfociti T citotossici specifici per virus, o CTL, derivati da donatore, adatti al trasferimento adottivo a riceventi di trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche o HSCT. Questo risultato si ottiene innanzitutto introducendo mediante nucleofezione cellule dendritiche o DC con plasmidi codificanti antigeni virali, per attivare le cellule alla presentazione dell'antigene. Come secondo passaggio, le DC nucleofezionate vengono utilizzate per stimolare linfociti T specifici per l'antigene, che successivamente vengono espansi in presenza di IL-4 e IL-7 in un dispositivo di coltura permeabile ai gas chiamato GRE.

Successivamente, dopo sette giorni di coltura, le cellule vengono suddivise e ripiagate e il loro mezzo viene rinnovato per sostenere la massima espansione in vitro dei linfociti T citotossici (CTL). Infine, al giorno 12, le cellule vengono raccolte e sottoposte a test per verificarne la purezza, potenza e sicurezza, quindi congelate per un uso clinico successivo. In definitiva, è possibile generare linee di CTL con specificità multi-virale e minima reattività alloreattiva, come dimostrato dalla colorazione intracellulare delle citochine, dalla produzione di interferone gamma e dalla citotossicità.

La produzione di linee di linfociti T citotossici specifici per multi virus richiede molto tempo ed è complessa. Richiede l'uso di linee cellulari B trasformate dal virus Epstein-Barr EP e vettori adenovirali, e il procedimento richiede circa tre mesi. Il nostro nuovo metodo non utilizza vettori virali.

Le cellule crescono in modo esponenziale in coltura con perdita cellulare minima e pertanto la procedura è rapida ed economica. A dimostrare questa procedura è Eureka Gerdeman, fellow clinica nel laboratorio Harvest, che ha generato DCs derivate da monociti in un mezzo Cellgenic, integrato con IL-4 e G-M-C-S-F, e successivamente maturate per 24 ore in citochine di maturazione mediante risospensione delicata con una pipetta di trasferimento da tre millilitri. Utilizzare il blu di tripano per contare le DCs e quindi trasferirle in tre provette da 15 millilitri con non meno di 0,5 × 10⁶ e non più di 2 × 10⁶ cellule per provetta.

Successivamente, centrifugare il DCS per 10 minuti a 200 ×g. Nel frattempo, preparare sei millilitri di mezzo Cell Genix integrato con lo stesso cocktail di citochine per la maturazione delle DC utilizzato in precedenza e distribuire due millilitri in tre pozzetti di una piastra da coltura tissutale a 12 pozzetti; riempire i pozzetti non utilizzati con due millilitri di acqua sterile. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% CO2 per il preriscaldamento.

Una volta terminate la centrifugazione delle cellule, aspirare i soprannatanti e aggiungere i plasmidi di DNA pertinenti a ciascun tubo a una concentrazione finale di cinque microgrammi di DNA per tubo. Qui, il plasmide che codifica per IE uno PP 65 viene aggiunto al tubo numero uno, heon penton al tubo numero due ed E BNA uno LMP due BZ F1 al tubo numero tre reus. Sospendere le DCS e il DNA con 100 microlitri di soluzione di trasfezione nucleare.

Mescolare bene e trasferire la miscela in cuvette per affezione nucleare NU. Posizionare le cuvette nel quattro D nucleo effettore. Selezionare il programma CB uno 50 e premere immediatamente start dopo l'affezione nucleare.

Aggiungere 500 microlitri del mezzo di maturazione PREWARM CELLGENIC DC a ogni vial, mescolare delicatamente le cellule aspirando e dispensando due o tre volte con una pipetta e trasferire le DC nucleo-affette nella piastra da 12 pozzetti preparata contenente i rimanenti 1,5 millilitri di mezzo di maturazione DC pre-riscaldato. Trasferire la piastra nell’incubatore per ulteriori 12-18 ore, raccogliere, contare e quindi irradiare le DC nucleo-affette. Lavare le cellule una volta con 10 millilitri di mezzo CTL e quindi risospendere a 3 × 10⁵ DC per millilitro di mezzo. Raccogliere un minimo di 7,5 × 10⁵ (ovvero 2,5 millilitri) e un massimo di 15 × 10⁵ (ovvero 5 millilitri) di DC provenienti da tutte e tre le nucleo-infrazioni e trasferire le DC transfectate con plasmide raggruppate nel dispositivo G Rex.

Quindi posizionare il dispositivo nell'incubatore per la preparazione delle cellule risponditrici. Utilizzare le cellule mononucleate non aderenti che rimangono dopo la selezione delle DC. Trasferire i risponditori nella soluzione di coltura pre-riscaldata.

Lavarli una volta con il mezzo CTL. Sospendere le cellule nel mezzo CTL. Contare le cellule e portarle a una concentrazione di due volte 10 alla sesta cellule per millilitro.

Prelevare 15 volte 10 alla sesta cellule oppure 7,5 millilitri e integrare con le citochine IL-4 e IL-7. Trasferire 7,5 millilitri di PBMC nel G Rex e completare il biorreattore con mezzo CTL fino a un volume totale di 30 millilitri. Infine, posizionare il G Rex nell'incubatrice per sei-sette giorni; al giorno sei-sette, aspirare 10 millilitri del mezzo.

Quindi mescolare i restanti 20 millilitri di terreno con una pipetta da 10 millilitri. Utilizzare il trian blu per contare le cellule se sono presenti meno di 50 volte 10 alla sesta cellule. Rifornire la coltura con terreno e citochine freschi.

Se sono presenti più di 50 volte 10 alla sesta cellule, rimuovere 10 millilitri della sospensione cellulare, trasferire le cellule in un nuovo G rex e quindi aggiungere mezzo CTL fresco con citochine in entrambi i G rex, coltivando le cellule per ulteriori quattro-sei giorni per espandere il numero cellulare. Raccogliere e contare le cellule. Successivamente, criopreservare tutte le cellule non utilizzate per analisi fenotipiche o funzionali, per un uso futuro. Risultati rappresentativi mostrano che i plasmidi multicianici di DNA inducono cellule T specifiche per più virus, come misurato dal saggio ELISpot per l'interferone gamma, e che la frequenza di cellule reattive è superiore rispetto a quella delle linee generate utilizzando plasmidi convenzionali PHU che esprimono gli stessi antigeni.

Il rapporto ottimale tra DC e PBMC è importante per una potente stimolazione dei linfociti T, come mostrato in questa figura, dove un rapporto di uno a 50 produce una riattivazione subottimale rispetto a un rapporto stimolatore:risponditore di uno a 20. La coltura CTL nel G rex, come osservato in questa figura, favorisce un'espansione superiore dei linfociti T rispetto alle piastre tradizionali a 24 pozzetti. L'aggiunta di IL-4 e IL-7 alle colture aumenta il repertorio e la specificità delle cellule espanse, come mostrato qui, dove la frequenza di linfociti T reattivi contro il peptide NLV, derivato dalla CMV pp65 e ristretto all'HLA-A*02, è stata valutata in colture generate in presenza o assenza di IL-4 e/o IL-7. Questa figura mostra un campione rappresentativo del fenotipo dei linfociti CTL multivirali rapidamente espansi, che sono policlonali e composti da una miscela di linfociti T CD4-positivi e CD8-positivi, nella maggior parte dei quali sono espressi i marcatori di memoria CD45RO e CD62L. I linfociti CTL espansi sono specifici per tutti gli antigeni stimolanti e sono polifunzionali, come valutato mediante colorazione intracellulare per citochine per rilevare la produzione di interferone gamma e TNF-alfa dopo stimolazione antigenica, nonché mediante saggio di rilascio del cromo.

I CTL espansi sono in grado di uccidere specificamente bersagli virali, ma non mostrano attività non specifica contro bersagli non virali con incompatibilità HLA, un aspetto cruciale per la sicurezza. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre rapidamente linee cellulari citotossiche T specifiche per più virus, compatibili con le GNP e adatte al trasferimento adottivo in pazienti affetti da malattie associate a virus. La semplificazione di questa procedura dovrebbe facilitarne l'estensione al di là delle strutture specializzate di produzione, permettendo alla procedura di diventare standard di cura per i pazienti immunocompromessi e altamente suscettibili a malattie associate a virus.