Name: Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Impara a generare linfociti T citotossici multivirus-specifici per trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo GMP rapido e conveniente facilita l'immunoterapia cellulare.

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Questo lavoro è supportato da una produzione di assistenza per le terapie cellulari (contratto NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), un centri specializzati per la terapia cellulare di Grant NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), una ASBMT Investigator Award giovani (UG e JV), una società Leukemia and Lymphoma Fellow Award speciale in Ricerca Clinica (UG) e un Amy Strelzer Scholar Award Manasevit (AML).

1. DC nucleofection <ol><li> Harvest DC derivate da monociti, che sono stati arricchiti con l'adesione di plastica, colta per 5 giorni utilizzando cellule Genix multimediale integrato con IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) e ulteriormente stagionato per 24 ore utilizzando le citochine maturazione DC IL4 (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml e PGE2 (1μg/ml) 1, dalla risospensione dolce con una pipetta di trasferimento da 3 ml. </li><li> Conte DC praticabile con trypan blu, trasferimento in 3x tubi 15ml con non meno di 0.5x10 6 e non più di 2x10 6 cellule / tubo. </li><li> Centrifugare per 10 minuti DC @ 200g. Durante questo periodo di pre-riscaldare cella Genix multimediali integrate con citochine maturazione della DC (media maturazione DC) - 2ml/well in tre pozzi di un 12-e colture di tessuti trattati piastra a 37 ° C / 5% CO 2 incubatore. </li><li> Una volta che le cellule hanno finito di girare, aspirare il supernatante e aggiungere i plasmidi DNA relativi a ciascuno dei tubi in una concentrazione finale di DNA 5μg / tubo. In questo caso aggiungere la codifica plasmide IE1-pp65 al tubo # 1, Hexon-Penton al tubo # 2, e EBNA1-LMP2-BZLF1 per tubo # 3. </li><li> Risospendere DC e del DNA con 100μl di soluzione nucloefection Amaxa, mescolare bene e trasferimento in cuvette nucleofection. </li><li> Cuvette posto nella nucleofector 4D, scegliete programma CB150 (Amaxa / Lonza), e premere start. </li><li> Immediatamente dopo nucleofection aggiungere 500μl di 2 ml preriscaldata cella Genix dei media maturazione DC alla cuvetta, mescolare delicatamente pipettando su e giù per 2-3 volte, e DC trasferimento nucleofected al preparato 12-pozzetti contenenti il ​​restante 1,5 ml di preriscaldata DC maturazione media. Trasferimento ai 37 ° C / 5% CO 2 incubatore per un ulteriore 12-18hrs. </li></ol> 2. Stimolazione delle cellule T <ol><li> Raccolta e il conteggio DC nucleofected, e irradiare a 30Gy. Lavare una volta con 10 ml di medium CTL (45% RPMI, 45% clic EHAA, 10% FBS, 2mM Glutamax) e risospendere @ 3 x 10 5 DC per ml di mezzi di CTL. </li><li> Piscina un minimo di 7.5x10 5 (2,5 ml) e un massimo di 15x10 5 (5 ml) di DC contenenti ognuno dei plasmidi e trasferire la DC in pool per la G-Rex dispositivo che sarà posto in incubatrice. </li><li> Per la preparazione delle cellule responder utilizzare PBMC precedentemente congelate o cellule mononucleari non aderente che rimangono dopo la selezione DC (aderenza o CD14 selezione). Scongelare le cellule, trasferimento al terreno di coltura preriscaldata, lavare una volta con i media CTL. Risospendere le cellule in Media CTL, contare le cellule e portarli a una concentrazione di 2x10 6 cellule per ml. Prendere 15x10 6 celle o 7.5ml e integrare con 30000U IL4 (1000U/ml -. Conc finale) e 300ng IL7 (10ng/ml - conc finale.). </li><li> Trasferimento 7.5ml di PBMC (15x10 6 celle) al G-Rex e rabboccare il bioreattore con i media CTL per un volume totale di 30ml. </li><li> Cultura del G-Rex per 6-7 giorni a 37 ° C / 5% CO 2 incubatore umidificato. </li></ol> 3. L'espansione delle cellule T <ol><li> Il giorno di 6-7, 10ml aspirato di media, poi mescolare le cellule del restante 20 ml di media con una pipetta da 10 ml e conta delle cellule vitali con trypan blu. Se ci sono &lt;50x10 6 ricostituire con mezzi freschi + citochine. Se ci sono&gt; 50x10 6 celle rimuovere 10 ml di sospensione cellulare, trasferimento in un nuovo G-Rex, e quindi alimentazione sia G-Rexs fresca mezzi CTL + citochine. </li><li> Cultura per altri 4-6 giorni. Una volta che le cellule sufficiente sono stati ampliati, eseguire la caratterizzazione fenotipica e funzionale del CTL in eccesso e crioconservare per un uso futuro. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Uno schema del nostro approvato dall'FDA multivirus specifico processo di generazione CTL è illustrato nella figura 1. A differenza di convenzione multivirus CTL protocolli che utilizzano adenovectors e EBV-LCL per stimolare virus cellule T reattive 2 abbiamo sostituito con materiale infetto da virus plasmidi DNA che codificano antigeni multipli derivati ​​da ciascuno dei virus 3. Per stimolare CTL trivirus abbiamo progettato tre multicistronic plasmidi codifica Hexon e Penton di adenovirus, IE1 e pp65 del CMV, e EBNA1, LMP2 e BZLF1 di EBV. Questi antigeni sono stati scelti sulla base di incoraggianti risultati clinici del nostro e di altri gruppi che mostrano che le cellule T diretta contro Adv-hexon e Penton 2,4-6, e di CMV-1E1 e per CMV pp65 sono protettivi in vivo 7. Per EBV, EBNA1 è un immunodominanti CD4 + antigene delle cellule T obiettivo espresso in tutte le neoplasie EBV-associati e in normali cellule infettate da EBV-B 8,9, LMP2 è immunogenico per tutti i tipi HLA più ed espresse nella maggior parte dei tumori EBV, 10,11 mentre BZLF1 codifica un immunodominanti, immediato antigene precoce ciclo litico che stimola sia CD4 + e CD8 + T dalla maggior parte degli individui ed è probabile che importante per la control di cellule replicazione del virus 12. Per ottimizzare ulteriormente i nostri metodi di produzione abbiamo collaborato con la tecnologia che la Natura ha generato minimizzato, antibiotico-free (FDA-compliant) plasmidi per la stimolazione CTL 13,14. Utilizzando questa strategia abbiamo sempre raggiungere efficienze nucleofection del&gt; 35%, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule (dati non riportati) 3. La figura 2 mostra che la frequenza del virus-specifiche cellule T in risposta a plasmidi DNA ottimizzato come misurato da IFNγ ELISPOT, era maggiore che in risposta a pShuttle tradizionali a base di plasmidi di espressione che esprimono gli stessi antigeni (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV e EBV n = 2). Il rapporto ottimale tra DC: PBMC è stata importante per la potente stimolazione delle cellule T, come mostrato nella Figura 3, dove un rapporto di 1:50 prodotta sub-ottimali di attivazione rispetto a S 1:20 a: rapporto R (n = 2 donatori). Produzione di sufficiente numero di CTL con specificità antigenica ampio è un pre-requisito per l'efficacia clinica nei confronti di tutti e tre i virus. Questo risultato è ottenuto dalla cultura CTL nel G-Rex, che supporta l'espansione delle cellule T superiore rispetto ai tradizionali 24 pozzetti (Figura 4A) 15, mentre l'aggiunta di IL4 e IL7 ad aumenti delle culture del repertorio e la specificità come mostrato nella Figura 4B dove la frequenza di cellule T reattive contro il CMV pp65-derivati ​​HLA-A2 resticted NLV peptide è stata valutata nelle culture generate in presenza o assenza di IL4 e / o IL7 16,17. Per valutare la capacità fenotipo e funzionale delle cellule espanse che effettuare analisi citometria a flusso, intracellulare di citochine colorazione / IFNγ ELISPOT, e Cr 51 saggi di rilascio del prodotto finale per la crioconservazione / infusione. Tipicamente le cellule generate sono policlonali con una popolazione mista di cellule CD4 + e CD8 + T con l'antigene-specificità rilevabili in entrambi i comparti delle cellule T. Il CTL sono in grado di uccidere che esprimono l'antigene virale cellule bersaglio del virus, ma non negativo parzialmente HLA obiettivi abbinati, ad indicare che non devono indurre graft-versus-host disease (GvHD) in vivo (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Protocollo generazione RCtl. In primo luogo, DC sono nucleofected con l'antigene virale codifica plasmidi e poi mescolato con PBMC autologo a R: S di 10 o 20:1. Le cellule vengono espanse nel G-Rex per 10-14 giorni in presenza di IL4 e IL7, poi raccolte, contate, testato per la funzione, l'identità e la sterilità, e poi crioconservati per uso clinico. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Plasmidi DNA Ottimizzato indurre superiore attivazione delle cellule T in vitro. DC sono stati ottimizzati con nucleofected, FDA-compliant plasmidi codifica Hexon e Penton (Adv), IE1 e pp65 (CMV), e EBNA1, LMP2, e BZLF1 (EBV) o plasmidi pShuttle convenzionale codifica gli stessi antigeni. Questi sono stati utilizzati per stimolare le cellule T e la specificità è stata analizzata da ELISPOT IFNγ 10 giorni post-stimolazione. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 CC ottimale:. Ratio per l'attivazione delle cellule T CTL. DC da 2 donatori erano nucleofected con tutti e tre i plasmidi ottimizzato e poi utilizzati per stimolare PBMC autologhi a 1:20 o 1:50 DC: rapporto di PBMC. La frequenza di cellule T è stata valutata riattivato il giorno 10 da IFNγ ELISPOT. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Espansione delle cellule T nel G-Rex con citochine migliorare. Un pannello mostra la G-Rex dispositivo, nonché l'aspetto CTL sulla membrana permeabile ai gas, valutata al microscopio. Un confronto tra la produzione delle cellule ottenuti in colture di tessuti trattati convenzione piatti vs G-Rex è anche mostrato. Pannello B mostra la frequenza del CTL CMV pentamero positivi ottenuti in colture espanse in presenza di nessuna delle citochine, IL4 solo, IL7 solo e IL4 + IL7. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Fenotipo e la funzione del CTL ampliato. Panel A presenta un esempio rappresentativo del fenotipo del CTL ampliato multivirus, che sono policlonali con una miscela di CD4 + (45% - helper) e CD8 + (42% - citotossici) cellule T, di cui la maggioranza (95%) ha espresso il memoria marcatore CD45RO + / CD62L +. pannello B mostra che queste cellule sono specifici per tutti gli antigeni stimolante e sono polifunzionali come valutato dalla colorazione delle citochine intracellulari di rilevare la produzione di IFNΓ e TNFa dopo la stimolazione antigene. Panel C mostra che il CTL espanse sono funzionali misurate da Cr 51 test. Autologo LCL, da solo o trasdotte con un vettore nullo o un vettore adenovirale che esprime CMV pp65 sono state usate come catrameottiene. Alloreattività è stata valutata utilizzando allogenico esplosioni PHA come bersaglio.

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</ol>

Juan F. Vera è un consulente per la produzione di Wilson Wolf. Gli altri autori non hanno informazioni rilevanti.

Le infezioni virali rappresentano morbilità e mortalità nei pazienti immunocompromessi a causa della malattia o il suo trattamento. Dopo trapianto, per esempio, infezioni causate da herpes virus persistente come EBV e CMV, oltre che da virus respiratori quali virus respiratorio sinciziale (RSV), sono ben noti, mentre l&#39;importanza delle infezioni causate da Adv, virus BK e umano herpesvirus (HHV) -6 hanno più recentemente apprezzato. Mentre gli agenti farmacologici sono la terapia standard per alcune infezioni, hanno tossicità sostanziale, generare varianti resistenti, e sono spesso inefficaci. Al contrario, i virus-cellule T specifiche derivate da donatori di cellule staminali hanno dimostrato sicuro ed efficace per la prevenzione e il trattamento di infezioni virali o malattie il trapianto di cellule staminali emopoietiche (HSCT) impostazione 2,5,6,18-21. Tuttavia, l&#39;applicazione più ampio di immunoterapia delle cellule T è in ultima analisi, limitate dalla complessità dei costi, e il tempo necessario per la produzione di CTL. Il nostro approccio nuovo e rapido per generare multivirus CTL, descritti nel manoscritto attuale, dovrebbe aumentare notevolmente la fattibilità della terapia delle cellule T citotossiche per le malattie virali, che permette la strategia per diventare uno standard di cura per l&#39;ospite immunocompromessi. L&#39;uso del plasmide DC nucleofected come APC consente la presentazione dell&#39;antigene da entrambe le MHC di classe I e II, senza la concorrenza dei vettori virali o addirittura provenienti da molteplici antigeni virali viene espressa all&#39;interno di una singola cella in quanto diverse popolazioni di DC sono utilizzati per ogni plasmide 3. L&#39;impiego di IL-4 / 7 aumenta la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T, che aiuta di conseguenza aumentare la frequenza e repertorio di risposta antigene-specifica delle cellule T 16,17. Infine, la cultura del G-Rex riduce drasticamente l&#39;apoptosi delle cellule T in coltura. Scambio di gas (O 2 e CO 2 out) si verifica attraverso una membrana permeabile al silicio gas alla base del pallone, impedendo l&#39;ipossia, consentendo una maggiore profondità di media sopra le cellule, fornendo più sostanze nutritive e la diluizione di prodotti di scarto. Questa piattaforma può essere esteso anche ai virus aggiuntivi come quando antigeni protettivi vengono identificati.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> Peprotech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> Siero umano AB </td><td> Valle Biomedical Inc. </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> AAF-1001B e AAF-1001X </td></tr><tr><td> Nucleofection Kit </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP-3012 </td></tr><tr><td> Plasmidi </td><td> NTC </td><td> n / a </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> R &amp; S </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R &amp; S </td><td> 201-LB-025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R &amp; S </td><td> 206-IL-CF </td></tr><tr><td> TNFa </td><td> R &amp; S </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> Sigma </td><td> P6532-1MG </td></tr><tr><td> G-Rex </td><td> Wilson Lupo Produzione </td><td> AY11-00027 </td></tr></tbody></table>

generazione di multivirus-cellule t specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Le infezioni virali causare morbilità e mortalità nei trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT). Noi e gli altri sono riusciti a generare e infuse cellule T specifiche per il virus di Epstein Barr (EBV), citomegalovirus (CMV) e Adenovirus (Adv) utilizzando monociti e EBV-trasformate linfoblastoidi (EBV-LCL) gene modificato con un vettore adenovirus come cellule presentanti l&#39;antigene (APC). Da un minimo di 2x10 5 / kg trivirus specifici linfociti T citotossici (CTL) proliferavano in base ai registri diversi dopo l&#39;infusione e apparve per prevenire e curare anche una grave malattia virale resistente ad altre terapie disponibili. L&#39;applicazione più ampio di questo approccio incoraggiante è limitata da alti costi di produzione, la complessità della produzione e del tempo prolungato (4-6 settimane per EBV-LCL generazione, e 4-8 settimane per la produzione di CTL - totale 10-14 settimane) per la preparazione. Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo di GMP CTL di produzione. In primo luogo, al posto di adenovectors per stimolare le cellule T si usa cellule dendritiche (DC) nucleofected con DNA plasmidi codifica LMP2, EBNA1 e BZLF1 (EBV), Hexon e Penton (Adv), e pp65 e IE1 (CMV) che presentano l&#39;antigene cellule. Queste APC riattivare le cellule T specifiche per tutti gli antigeni stimolante. In secondo luogo, la cultura di cellule T attivate in presenza di IL-4 (1.000 U / ml) e IL-7 (10ng/ml) aumenta e sostiene il repertorio e la frequenza di cellule T specifiche nelle nostre linee. In terzo luogo, abbiamo utilizzato un nuovo dispositivo di cultura gas-permeabili (G-Rex) che promuove l&#39;espansione e la sopravvivenza dei numeri a grandi cellule dopo un singolo stimolo, eliminando così la necessità di EBV-LCLs e riducendo l&#39;intervento tecnico. Mediante l&#39;attuazione di questi cambiamenti possiamo produrre CTL multispecifico targeting EBV, CMV, e Adv ad un costo per 10 6 cellule che si riduce&gt; 90%, e in soli 10 giorni invece di 10 settimane con un approccio che può essere esteso a ulteriori protezione antigeni virali. Il nostro FDA ha approvato l&#39;approccio deve essere di valore per le applicazioni di profilassi e di trattamento per i destinatari alto rischio HSCT allogenico.

Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l&#39;applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Le infezioni virali causano morbilità e mortalità nei riceventi di trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT). Noi e altri ricercatori abbiamo implementato con successo...

L'obiettivo generale della seguente procedura è generare rapidamente linfociti T citotossici specifici per virus, o CTL, derivati da donatore, adatti al trasferimento adottivo a riceventi di trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche o HSCT. Questo risultato si ottiene innanzitutto introducendo mediante nucleofezione cellule dendritiche o DC con plasmidi codificanti antigeni virali, per attivare le cellule alla presentazione dell'antigene. Come secondo passaggio, le DC nucleofezionate vengono utilizzate per stimolare linfociti T specifici per l'antigene, che successivamente vengono espansi in presenza di IL-4 e IL-7 in un dispositivo di coltura permeabile ai gas chiamato GRE.Successivamente, dopo sette giorni di coltura, le cellule vengono suddivise e ripiagate e il loro mezzo viene rinnovato per sostenere la massima espansione in vitro dei linfociti T citotossici (CTL). Infine, al giorno 12, le cellule vengono raccolte e sottoposte a test per verificarne la purezza, potenza e sicurezza, quindi congelate per un uso clinico successivo. In definitiva, è possibile generare linee di CTL con specificità multi-virale e minima reattività alloreattiva, come dimostrato dalla colorazione intracellulare delle citochine, dalla produzione di interferone gamma e dalla citotossicità.La produzione di linee di linfociti T citotossici specifici per multi virus richiede molto tempo ed è complessa. Richiede l'uso di linee cellulari B trasformate dal virus Epstein-Barr EP e vettori adenovirali, e il procedimento richiede circa tre mesi. Il nostro nuovo metodo non utilizza vettori virali.Le cellule crescono in modo esponenziale in coltura con perdita cellulare minima e pertanto la procedura è rapida ed economica. A dimostrare questa procedura è Eureka Gerdeman, fellow clinica nel laboratorio Harvest, che ha generato DCs derivate da monociti in un mezzo Cellgenic, integrato con IL-4 e G-M-C-S-F, e successivamente maturate per 24 ore in citochine di maturazione mediante risospensione delicata con una pipetta di trasferimento da tre millilitri. Utilizzare il blu di tripano per contare le DCs e quindi trasferirle in tre provette da 15 millilitri con non meno di 0,5 × 10⁶ e non più di 2 × 10⁶ cellule per provetta.Successivamente, centrifugare il DCS per 10 minuti a 200 ×g. Nel frattempo, preparare sei millilitri di mezzo Cell Genix integrato con lo stesso cocktail di citochine per la maturazione delle DC utilizzato in precedenza e distribuire due millilitri in tre pozzetti di una piastra da coltura tissutale a 12 pozzetti; riempire i pozzetti non utilizzati con due millilitri di acqua sterile. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% CO2 per il preriscaldamento.Una volta terminate la centrifugazione delle cellule, aspirare i soprannatanti e aggiungere i plasmidi di DNA pertinenti a ciascun tubo a una concentrazione finale di cinque microgrammi di DNA per tubo. Qui, il plasmide che codifica per IE uno PP 65 viene aggiunto al tubo numero uno, heon penton al tubo numero due ed E BNA uno LMP due BZ F1 al tubo numero tre reus. Sospendere le DCS e il DNA con 100 microlitri di soluzione di trasfezione nucleare.Mescolare bene e trasferire la miscela in cuvette per affezione nucleare NU. Posizionare le cuvette nel quattro D nucleo effettore. Selezionare il programma CB uno 50 e premere immediatamente start dopo l'affezione nucleare.Aggiungere 500 microlitri del mezzo di maturazione PREWARM CELLGENIC DC a ogni vial, mescolare delicatamente le cellule aspirando e dispensando due o tre volte con una pipetta e trasferire le DC nucleo-affette nella piastra da 12 pozzetti preparata contenente i rimanenti 1,5 millilitri di mezzo di maturazione DC pre-riscaldato. Trasferire la piastra nell’incubatore per ulteriori 12-18 ore, raccogliere, contare e quindi irradiare le DC nucleo-affette. Lavare le cellule una volta con 10 millilitri di mezzo CTL e quindi risospendere a 3 × 10⁵ DC per millilitro di mezzo. Raccogliere un minimo di 7,5 × 10⁵ (ovvero 2,5 millilitri) e un massimo di 15 × 10⁵ (ovvero 5 millilitri) di DC provenienti da tutte e tre le nucleo-infrazioni e trasferire le DC transfectate con plasmide raggruppate nel dispositivo G Rex.Quindi posizionare il dispositivo nell'incubatore per la preparazione delle cellule risponditrici. Utilizzare le cellule mononucleate non aderenti che rimangono dopo la selezione delle DC. Trasferire i risponditori nella soluzione di coltura pre-riscaldata.Lavarli una volta con il mezzo CTL. Sospendere le cellule nel mezzo CTL. Contare le cellule e portarle a una concentrazione di due volte 10 alla sesta cellule per millilitro.Prelevare 15 volte 10 alla sesta cellule oppure 7,5 millilitri e integrare con le citochine IL-4 e IL-7. Trasferire 7,5 millilitri di PBMC nel G Rex e completare il biorreattore con mezzo CTL fino a un volume totale di 30 millilitri. Infine, posizionare il G Rex nell'incubatrice per sei-sette giorni; al giorno sei-sette, aspirare 10 millilitri del mezzo.Quindi mescolare i restanti 20 millilitri di terreno con una pipetta da 10 millilitri. Utilizzare il trian blu per contare le cellule se sono presenti meno di 50 volte 10 alla sesta cellule. Rifornire la coltura con terreno e citochine freschi.Se sono presenti più di 50 volte 10 alla sesta cellule, rimuovere 10 millilitri della sospensione cellulare, trasferire le cellule in un nuovo G rex e quindi aggiungere mezzo CTL fresco con citochine in entrambi i G rex, coltivando le cellule per ulteriori quattro-sei giorni per espandere il numero cellulare. Raccogliere e contare le cellule. Successivamente, criopreservare tutte le cellule non utilizzate per analisi fenotipiche o funzionali, per un uso futuro. Risultati rappresentativi mostrano che i plasmidi multicianici di DNA inducono cellule T specifiche per più virus, come misurato dal saggio ELISpot per l'interferone gamma, e che la frequenza di cellule reattive è superiore rispetto a quella delle linee generate utilizzando plasmidi convenzionali PHU che esprimono gli stessi antigeni.Il rapporto ottimale tra DC e PBMC è importante per una potente stimolazione dei linfociti T, come mostrato in questa figura, dove un rapporto di uno a 50 produce una riattivazione subottimale rispetto a un rapporto stimolatore:risponditore di uno a 20. La coltura CTL nel G rex, come osservato in questa figura, favorisce un'espansione superiore dei linfociti T rispetto alle piastre tradizionali a 24 pozzetti. L'aggiunta di IL-4 e IL-7 alle colture aumenta il repertorio e la specificità delle cellule espanse, come mostrato qui, dove la frequenza di linfociti T reattivi contro il peptide NLV, derivato dalla CMV pp65 e ristretto all'HLA-A*02, è stata valutata in colture generate in presenza o assenza di IL-4 e/o IL-7. Questa figura mostra un campione rappresentativo del fenotipo dei linfociti CTL multivirali rapidamente espansi, che sono policlonali e composti da una miscela di linfociti T CD4-positivi e CD8-positivi, nella maggior parte dei quali sono espressi i marcatori di memoria CD45RO e CD62L. I linfociti CTL espansi sono specifici per tutti gli antigeni stimolanti e sono polifunzionali, come valutato mediante colorazione intracellulare per citochine per rilevare la produzione di interferone gamma e TNF-alfa dopo stimolazione antigenica, nonché mediante saggio di rilascio del cromo.I CTL espansi sono in grado di uccidere specificamente bersagli virali, ma non mostrano attività non specifica contro bersagli non virali con incompatibilità HLA, un aspetto cruciale per la sicurezza. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre rapidamente linee cellulari citotossiche T specifiche per più virus, compatibili con le GNP e adatte al trasferimento adottivo in pazienti affetti da malattie associate a virus. La semplificazione di questa procedura dovrebbe facilitarne l'estensione al di là delle strutture specializzate di produzione, permettendo alla procedura di diventare standard di cura per i pazienti immunocompromessi e altamente suscettibili a malattie associate a virus.

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Immunologia e Infezioni

Questo documento descrive una semplice tecnica per indurre alloantigen specifiche anergia nelle cellule mononucleari del sangue periferico. La tecnica può essere applicata clinicamente per generare non alloreactive cellule del donatore. L'infusione di queste cellule potrebbero migliorare la ricostituzione immunitario e ridurre la tossicità dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche.

L&#39;induzione di anergia Alloantigen specifici nelle cellule mononucleari del sangue periferico di stimolazione Alloantigen con co-stimolatorie blocco del segnale

Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Il video mostra un test che utilizza cellule T CD8+ derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) per inibire la replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi. Queste cellule T, ingegnerizzate con recettori HBV-specifici, vengono trasferite in topi transgenici. I plasmidi del genoma dell'HBV competenti per la replicazione vengono quindi iniettati direttamente nel fegato, consentendo l'assorbimento del DNA virale. Una volta che gli antigeni virali sono espressi e...

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L'obiettivo di questo protocollo è produrre cellule T di grado clinico specifiche per i patogeni utilizzando un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione automatizzato da banco che incorpora un sistema chiuso di cattura delle citochine e non richiede personale dedicato o l'uso di una struttura GMP. Le cellule T specifiche per il citomegalovirus pp65 generate possono essere somministrate direttamente ai pazienti.

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Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Impara a generare linfociti T citotossici multivirus-specifici per trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo GMP rapido e conveniente facilita l'immunoterapia cellulare.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (Video) | JoVE Journal

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

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