Un saggio gratuito Cell System Stima della capacità neutralizzante di GM-CSF utilizzando anticorpi ricombinanti solubili GM-CSF Receptor

L'obiettivo generale di questo esperimento è stabilire un saggio privo di cellule per quantificare la capacità neutralizzante dell'autoanticorpo anti G-M-C-S-F. Iniziamo ottenendo bachi da seta transgenici. Introduciamo il gene umano SGMR alpha per produrre SGMR alpha ricombinante e procediamo quindi ad etichettare il G-M-C-S-F umano ricombinante mediante bioTE.

Successivamente valutiamo la correlazione tra il sistema acellulare e un saggio biologico tradizionale mediante uno studio sull'inibizione del legame tra G-M-C-S-F e il recettore alpha SGMR da parte di autoanticorpi anti G-M-C-S-F. I risultati ottenuti dimostrano una correlazione significativa tra l'inibizione della crescita nel saggio biologico e l'inibizione del legame nel sistema acellulare indotta da frazioni di IgG sieriche e da autoanticorpi anti G-M-C-S-F purificati. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio biologico TF, è che questo sistema consente un'elevata capacità analitica con buona riproducibilità nella misurazione della capacità neutralizzante degli autoanticorpi anti GM CSF.

Dato che l'autoanticorpo contro GM-CSF causa una prognosi complessiva autoimmune primaria, le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi. Può inoltre essere applicata a saggi di legame competitivi al tib utilizzando recettori citochinici ricombinanti, come i recettori per BEGF e TNFA. La procedura sarà dimostrata da uno studente di dottorato del mio laboratorio, che ha sviluppato per primo questo sistema privo di pH.

Questo video mostra il baco da seta utilizzato per la produzione del SGMR alfa ricombinante. Il primo passaggio consiste nell'amplificare il cDNA per il SGMR alfa a partire da una libreria di cDNA di placenta umana mediante reazione a catena della polimerasi, ottenendo l'amplicone PCR risultante. Eseguire una seconda PCR per aggiungere una sequenza di 50 basi di regione UTR al 5' del poliadenilato del virus ULA all'estremità 5'.

E per marcare un R RRGs, aggiungere il suo marcatore all'estremità tre prime, clonare il prodotto R della PCR amplificato nel plasmide P MSG uno uno mg, co-iniettare il costrutto PS GMR/ M1 uno mg insieme al vettore helper PHA tre pig in uova di baco da seta della linea PNDW uno. Allevare le larve G zero schiuse fino a diventare farfalle a 25 gradi Celsius. Successivamente, analizzare gli embrioni G uno accoppiando individui della stessa nidiata oppure con PNDW uno, mediante l'espressione di MG FP negli occhi, indicativa di bachi da seta transgenici portatori.

Il gene SGMR alfa procede all'estrazione della proteina ricombinante SGMR alfa dai bozzoli di bachi da seta transgenici utilizzando un buffer fosfato contenente cloruro di sodio 500 millimolare, agitando a quattro gradi Celsius per 24 ore. Centrifugare i campioni a 20.000 ×g per 15 minuti. Per rimuovere i precipitati, applicare il liquido sovranatante su una colonna a affinità per il nickel.

Lavare la colonna e diluire le proteine con un gradiente lineare di ole da 10 millimolari a 250 millimolari. Raccogliere le frazioni contenenti l'SGMR alfa purificato e dializzare contro soluzione salina tampone fosfato. Eseguire innanzitutto la dialisi dei campioni con PBS.

Per rimuovere il sorbitolo dalla preparazione G-M-C-S-F, aggiungere un millilitro di soluzione fredda di sodio meta date 20 millimolare e incubare il campione per 30 minuti sul ghiaccio al buio. Aggiungere quindi glicerolo fino a una concentrazione finale di 15 millimolare ed eseguire una dialisi contro tampone di acetato di sodio 100 millimolare. Per procedere, aggiungere azide biotinilica alla soluzione fino a una concentrazione finale di cinque millimolare e mescolare per due ore a temperatura ambiente.

Infine, rimuovere il materiale non reattivo mediante dialisi contro PBS, ricoprire una piastra microtitolata con 50 microlitri di anticorpo monoclonale anti-polyhis e lasciare incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Lavare cinque volte con PBST. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di soluzione bloccante e incubare per tre ore a quattro gradi Celsius.

Di nuovo, lavare cinque volte con PBST. Aggiungere 50 microlitri di SGMR alpha nella soluzione di blocco e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius dopo cinque lavaggi con PBST. Aggiungere 25 microlitri dei campioni contenenti l'autoanticorpo G-M-C-S-F e quindi 25 microlitri di G-M-C-S-F biotinilato, incubare per un'ora a quattro gradi Celsius.

Per formare il complesso SGMR alfa G-M-C-S-F, continuare a lavare cinque volte con PBST, quindi aggiungere 50 microlitri di streptavidina fosfatasi alcalina per un'ora a quattro gradi Celsius per rilevare il G-M-C-S-F biotinilato legato a SGMR alfa. Lavare cinque volte con PBST e aggiungere 50 microlitri di un substrato chemiluminescente alla soluzione, incubare per un'ora a temperatura ambiente e determinare l'attività chemiluminescente utilizzando un lettore di piastre. Nell'analisi SDS-PAGE, la forma ricombinante di SGMR alfa ottenuta dal baco da seta è presente sia nella forma monomerica che in quella DME in condizioni non riducenti, ma soltanto nella forma monomerica in condizioni riducenti.

Questa miscela ricombinante di monomeri e dimeri legati da ponti disolfuro di SGMR alfa è funzionale in un saggio di legame competitivo. Il complesso tra G-M-C-S-F biotinilata e SGMR alfa mostra specificità, poiché può essere dissociato aggiungendo diverse concentrazioni di anticorpo neutralizzante, ma non di anticorpo non neutralizzante. Inoltre, concentrazioni crescenti di anticorpi neutralizzanti contro G-M-C-S-F correlano positivamente con un aumento percentuale dell'inibizione del legame in maniera dose-dipendente.

Come previsto, l'inibizione del legame degli anticorpi non neutralizzanti contro G-M-C-S-F non era dipendente dalla dose. Questo sistema privo di cellule dimostra una stretta correlazione tra l'inibizione del legame di G-M-C-S-F al recettore alpha di SGMR mediata dagli autoanticorpi anti G-M-C-S-F e i valori calcolati di r pari a 0,988 e valore di P di 0,002. L'inibizione del legame è aumentata in maniera dipendente dalla dose in presenza di autoanticorpi anti G-M-C-S-F.

Allo stesso modo, l'inibizione della legatura ha mostrato una correlazione significativa con l'inibizione della crescita dell'importazione. Questo saggio presenta utilità e analisi delle frazioni di IgG sieriche provenienti da pazienti affetti da PAP autoimmune, come dimostrato qui dalla relazione tra la IC50 per la percentuale di inibizione della legatura e la percentuale di inibizione della crescita indotta dalle frazioni di IgG sieriche. Inoltre, il coefficiente di variazione tra esperimenti indica un vantaggio del sistema privo di cellule rispetto al saggio biologico di inibizione della crescita.

Una volta padroneggiato, questo saggio di legame ligando-recettore GM GSF privo di cellule può essere completato con successo in 38 ore. È importante ricordare di mantenere costanti la reazione, la temperatura e il tempo di incubazione. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello screening delle attività biologiche di farmaci anticorpali nobili, in alternativa ai saggi biologici convenzionali.