Name: Un saggio gratuito Cell System Stima della capacità neutralizzante di GM-CSF utilizzando anticorpi ricombinanti solubili GM-CSF Receptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Impara un saggio cellulare libero per quantificare la capacità neutralizzante degli autoanticorpi GM-CSF utilizzando recettori ricombinanti SGMR alpha. Questo metodo offre alta riproducibilità per studi immunologici.

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Siamo molto grati a K. Nakagaki, Dr. H. Ishii, il Dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa per i loro preziosi contributi.

1. Produzione e purificazione di sGMRα <ol><li> Amplifica cDNA di sGMRα da placenta umana biblioteca di cDNA mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). </li><li> Aggiungere 50 di base 5'-UTR sequenza di fine baculovirus polyhedrin e 27 RGS base di codifica His-tag per terminare il 3 'per l'amplicone PCR da un altro PCR. </li><li> Inserire il prodotto amplificato di PCR in un pMSG1.1MG plasmide. </li><li> Iniettare il psGMR/M1.1MG costruire con il vettore helper pHA3PIG in uova di baco da seta PND-w1 ceppo. </li><li> Posteriore nati G0 larve di lepidotteri a 25 ° C. Schermo embrioni G1 ottenuto con l'accoppiamento tra fratelli o con PND-w1 MGFP di espressione negli occhi di ottenere bachi da seta transgenici recanti il ​​gene sGMRα. </li><li> Estratto ricombinante sGMRα da bozzoli di bachi da seta transgenici con tampone contenente fosfato-500mm NaCl e mescolare a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Centrifugare campione a 20000 g per 15 minuti per rimuovere un precipitati. </li><li> Applicare supernatante in una nichel-affinità delle colonne. </li><li> Lavare la colonna con 10 mM imidazolo, 500mm e fosfato di sodio NaCl 20 mM, pH6.3, ed eluire con un gradiente lineare di imidazolo da 10mm a 250mm. In comune le frazioni contenenti i sGMRα purificata e Dializzare contro PBS (pH7.4) (PBS). </li></ol> 2. Biotinilazione ricombinante di GM-CSF <ol><li> Rimuovere preparazione sorbitolo con la dialisi contro PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di 20 mM freddo sodio meta-periodato soluzione a 4 ° C per la soluzione su ghiaccio. </li><li> Incubare il campione per 30 minuti sul ghiaccio nel buio. </li><li> Aggiungere alla soluzione di glicerolo ad una concentrazione finale di 15 mm. </li><li> Dializzare la soluzione tampone contro 100mM acetato di sodio (pH5.5) </li><li> Aggiungi idrazide biotina alla soluzione ad una concentrazione finale di 5 mm e continuamente agitare la soluzione per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il materiale non ha reagito con la dialisi contro PBS, pH7.4. </li></ol> 3. Una cellula priva di GM-CSF recettore-ligando-binding assay <ol><li> Cappotto micropiastra con 50μl di anticorpo monoclonale anti-polyHistidine anticorpi notte a 4 ° C. </li><li> Lavare cinque volte con 500μl di PBST. </li><li> Aggiungere 100μl di una soluzione di saturazione e incubare per 3 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare cinque volte con 500μl di PBST. </li><li> Aggiungere 50μl di sGMRα nella soluzione di blocco e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare cinque volte con 500μl di PBST. </li><li> Aggiungere 25μl dei campioni contenenti GM-CSF autoanticorpi e poi 25μl di biotinilato GM-CSF. Incubare per 1h a 4 ° C per formare sGMRα-GM-CSF complesso. </li><li> Lavare cinque volte con 500μl di PBST. </li><li> Aggiungere 50μl di fosfatasi alcalina 0.4mm streptavidina per 1 ora a 4 ° C per rilevare la biotinilato GM-CSF legato sGMRα. </li><li> Lavare cinque volte con 500μl di PBST. </li><li> Aggiungere 50μl di un substrato chemiluminescente alla soluzione e incubati per 1h a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzando un lettore di piastre chemiluminescenza, rilevare l'attività chemiluminescenza. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Il primo passo per il GM-CSF via di trasduzione del segnale del recettore è il legame di GM-CSF a GM-CSF alfa recettore sulla superficie delle cellule. Perché GM-CSF autoanticorpi lega in modo specifico GM-CSF e bloccare il suo legame al recettore in vitro 16,17, abbiamo ipotizzato che gli autoanticorpi inibire questa reazione prima direttamente vincolanti a GM-CSF. Come descritto in precedenza (rif. 9-15), abbiamo applicato la tecnologia transgenica baco da seta per ottenere una grande quantità di sGMRα ricombinante con elevata purezza. Quando il baco da seta derivato sGMRα ricombinante è stato caricato su SDS-PAGE in condizioni non riducenti, l'ha dimostrato sia sGMRα monomerico (45 kDa) e dimerica (90 kDa) le forme, mentre solo la forma monomerica è stato rilevato in condizioni di riduzione (Figura 1B) , indicando che la sGMRα ricombinante era una miscela di monomeri e disolfuro-linked dimmer 18. Utilizzando il sistema acellulare (Fig. 2A), abbiamo valutato l'inibizione di GM-CSF legame sGMRα da GM-CSF autoanticorpi (Fig. 2B e fig. 2C). Questi metodi sono stati descritti in riferimento 19 da Urano et al. L'inibizione della crescita è strettamente correlata con l'inibizione vincolante (r = 0,988, p = 0,002) a diverse concentrazioni del GM-CSF autoanticorpi (Fig. 3A) 19. Allo stesso modo, l'inibizione vincolante è risultata significativamente correlata con l'inibizione della crescita. L'inibizione vincolante aumentata in modo dose-dipendente da GM-CSF autoanticorpi (Fig. 3B) 19. Questi due parametri per le frazioni IgG sieriche di diversi pazienti sono stati correlati tra loro (r = 0,589 p = 0,006, fig. 3C). Né vincolante né inibizione della crescita correlata con i valori di Kd, e quindi, entrambi i parametri è stata influenzata dalla affinità di legame 19. Di conseguenza, la riproducibilità dei dati tra vincolanti e ginibizione rescita ottenuto attraverso tre esperimenti indipendenti su tre diversi campioni è stata valutata. Il coefficiente di variazione indicato che il sistema acellulare era più eccellente di quello del biologico (tabella 1). <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso della procedura per la produzione di sGMRα utilizzando transgenici bachi da seta. A) Le strutture dei vettori di trasformazione 9-11. B) SDS-PAGE e Coomassie Brilliant Blue-colorazione del sGMRα purificata sotto riducendo e non riducendo le condizioni. sGMRα, GM-CSF solubile del recettore alfa; MGFP, mostro verde fluorescente proteine; BmNPVpol5'-UTR, 5'-non tradotta sequenza regione di Bombyx mori nucleare poliedrosi virus polyhedrin; polyA SV40, SV40 sequenza di segnali polyA P 3xP3, 3xP3 promotore; P ser1, ser1 promotore; FiBL polyA, fibroina L-catena sequenza di segnali polyA; hr3, Bombyx mori nucleare poliedrosi virus hr3 enhancer. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Schema del sistema acellulare test. A) Un saggio di legame competitivo con sGMRα prodotto da baco da seta. B) Effetto di anticorpi neutralizzanti e non neutralizzanti sulla inibizione vincolanti da parte delle cellule senza sistema. C) La differenza di inibizione vincolante tra diverse concentrazioni di anticorpi neutralizzanti e non-anticorpi neutralizzanti. GM-CSF, granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie; sGMRα, GM-CSF solubile del recettore alfa; suo, RGS-His-tag, AP, fosfatasi alcalina. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. GM-CSF inibizione vincolante sGMRα per gli effetti di GM-CSF anticorpi policlonali o le frazioni IgG sieriche di pazienti con PAP autoimmuni. A) Relazione tra l'inibizione vincolanti e inibizione della crescita di GM-CSF autoanticorpi. B) inibizione rilegatura a diverse concentrazioni di GM-CSF autoanticorpi. C) Relazione tra IC 50 per cento inibizione vincolante e inibizione della crescita per cento dal frazioni IgG sieriche 19. IC 50, 50% di concentrazione di inibizione; GM-CSF, granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie. <table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> A </td><td> B </td><td> C </td></tr><tr><td colspan="4"> Inter-saggio </td></tr><tr><td> # Di determinazioni </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Il valore medio (% di inibizione vincolante) </td><td> 61,6 </td><td> 63,8 </td><td> 69,7 </td></tr><tr><td> Valore medio (inibizione della crescita%) </td><td> 21,0 </td><td> 73,4 </td><td> 82,8 </td></tr><tr><td> Coefficiente di variazione (%) (% di inibizione vincolante) </td><td> 6.0 </td><td> 5,6 </td><td> 8,3 </td></tr><tr><td> Coefficiente di variazione (%) (inibizione della crescita%) </td><td> 64,4 </td><td> 18,3 </td><td> 10,4 </td></tr></tbody></table> Entrambi i test sono stati eseguiti a 5 ng / ml di GM-CSF e una concentrazione pari a GM-CSF autoanticorpi. Tabella 1. Confronto del coefficiente di variazione tra vincolante per cento e le inibizioni di crescita ottenuto attraverso tre esperimenti indipendenti.

<ol><li>Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neutralizing+capacity+of+GM-CSF+reflects+disease+severity+in+a+patient+with+pulmonary+alveolar+proteinosis+successfully+treated+with+inhaled+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF.</a> Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).</li>
<li>Tazawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+lung+immunity+in+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).</li>
<li>Inoue, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+large+cohort+of+patients+with+autoimmune+pulmonary+alveolar+proteinosis+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan.</a> Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).</li>
<li>Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+autoantibodies+specifically+eliminate+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+activity+in+the+lungs+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis.</a> Blood. 103, 1089-1098 (2004).</li>
<li>Sakagami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+GM-CSF+autoantibodies+and+reproduction+of+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis.</a> N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).</li>
<li>Raines, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+molecular+cloning+of+a+soluble+human+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).</li>
<li>Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+soluble+form+of+the+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor+alpha+chain+from+a+myelomonocytic+cell+line.+Expression%2C+biologic+activity%2C+and+preliminary+analysis+of+transcript+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution.</a> Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).</li>
<li>Prevost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28GM-CSF%29+and+inflammatory+stimuli+up-regulate+secretion+of+the+soluble+GM-CSF+receptor+in+human+monocytes%3A+evidence+for+ectodomain+shedding+of+the+cell+surface+GM-CSF+receptor+alpha+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit.</a> J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).</li>
<li>Iizuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+recombinant+mouse+monoclonal+antibody+in+transgenic+silkworm+cocoons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons.</a> FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).</li>
<li>Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+enhancement+of+recombinant+protein+synthesis+in+transgenic+silkworms+by+a+5%27-untranslated+region+of+polyhedrin+gene+of+Bombyx+mori+Nucleopolyhedrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus.</a> J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).</li>
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<li>Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+silkworm+that+secretes+recombinant+proteins+in+the+sericin+layer+of+cocoon%3A+production+of+recombinant+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin.</a> J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).</li>
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<li>Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis+as+an+autoimmune+disease+with+neutralizing+antibody+against+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 190, 875-880 (1999).</li>
<li>Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungs+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis+express+a+factor+which+neutralizes+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor.</a> FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).</li>
<li>Brown, C., Pihl, C., Murray, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+soluble+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor%3A+identification+of+the+functional+ligand-binding+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species.</a> Cytokine. 9, 219-225 (1997).</li>
<li>Urano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+assay+to+estimate+the+neutralizing+capacity+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies.</a> J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).</li>
<li>Hayashida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+second+subunit+of+the+receptor+for+human+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28GM-CSF%29%3A+reconstitution+of+a+high-affinity+GM-CSF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).</li>
<li>Hansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+GM-CSF+receptor+complex+reveals+a+distinct+mode+of+cytokine+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation.</a> Cell. 134, 496-507 (2008).</li>
</ol>

Il cell-free saggio stimato la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi con eccellente riproducibilità e rapidità. L&#39;inibizione vincolante da GM-CSF autoanticorpi o frazioni siero del paziente IgG è stata valutata da questa analisi. I dati hanno mostrato una correlazione tra l&#39;inibizione legame della cellula senza test e l&#39;inibizione della crescita di un saggio biologico con cellule TF-1, rispettivamente. Il biologico è stato ampiamente utilizzato, ma nutrito difficoltà inerenti alla comparazione di d...

un saggio gratuito cell system stima della capacità neutralizzante di gm-csf utilizzando anticorpi ricombinanti solubili gm-csf receptor

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

SFONDI: In precedenza, abbiamo dimostrato che la capacità di neutralizzare, ma non la concentrazione di GM-CSF autoanticorpi è stata correlata con la gravità della malattia nei pazienti con autoimmuni proteinosi alveolare polmonare (PAP) 1-3. Come abrogazione di GM-CSF bioattività nel polmone è la causa probabile per PAP autoimmuni 4,5, è promettente per misurare la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi per valutare la gravità della malattia in ogni paziente con PAP. Fino ad oggi, la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi è stata valutata mediante la valutazione della inibizione della crescita di cellule di midollo osseo umano o TF-1 cellule stimolate con GM-CSF 6-8. Nel sistema biologico, tuttavia, è spesso problematico ottenere dati affidabili e di confrontare i dati provenienti da diversi laboratori, a causa delle difficoltà tecniche nel mantenimento delle cellule in una condizione costante. OBIETTIVO: Per simulare GM-CSF legame con GM-CSF recettore sulla superficie cellulare tramite cell-free recettoriale-test. METODI: baco da seta transgenici tecnologia è stata applicata per ottenere una grande quantità di ricombinante solubile GM-CSF recettore alfa (sGMRα) con elevata purezza 9-13. Il sGMRα ricombinante era contenuta negli strati sericina idrofila di fili di seta, senza essere fuse alle proteine ​​della seta, e quindi, si può facilmente estrarre dai bozzoli in purezza buona con neutro soluzioni acquose 14,15. Fortunatamente, le strutture oligosaccaridi, che sono critici per il legame con GM-CSF, sono più simili alle strutture di sGMRα umane rispetto a quelle prodotte da altri insetti o lieviti. RISULTATI: La cella priva di sistema di analisi utilizzando sGMRα dato i dati con elevata plasticità e affidabilità. Vincolanti per sGMRα GM-CSF è stato dose-dipendente inibita da policlonali GM-CSF autoanticorpi in maniera simile al test biologico con cellule TF-1, indicando che il nostro nuovo sistema di test cell-free utilizzando sGMRα è più utile per la misurazione di attività neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi rispetto al sistema biologico utilizzando TF-1 di cellule umane o cellule del midollo osseo. CONCLUSIONI: Abbiamo stabilito una cella priva di test quantificare la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi.

Abbiamo progettato una cella priva di test legame recettore al fine di valutare il legame di granulociti-macrofagi colony-stimulating factor (GM-CSF) ai recettori. Ci permette di valutare inibizione competitiva del biotinilato GM-CSF legame al recettore alfa solubili GM-CSF da GM-CSF autoanticorpi con eccellente riproducibilità.

Un saggio gratuito Cell System Stima della capacità neutralizzante di GM-CSF utilizzando anticorpi ricombinanti solubili GM-CSF Receptor

INTRODUZIONE: In precedenza, abbiamo dimostrato che la capacità neutralizzante, e non la concentrazione dell'autoanticorpo anti-GM-CSF, era correlata alla malattia...

L'obiettivo generale di questo esperimento è stabilire un saggio privo di cellule per quantificare la capacità neutralizzante dell'autoanticorpo anti G-M-C-S-F. Iniziamo ottenendo bachi da seta transgenici. Introduciamo il gene umano SGMR alpha per produrre SGMR alpha ricombinante e procediamo all'etichettatura del G-M-C-S-F umano ricombinante mediante bioTE.Successivamente valutiamo la correlazione tra il sistema acellulare e un saggio biologico tradizionale mediante uno studio sull'inibizione del legame tra G-M-C-S-F e il recettore alpha SGMR da parte di autoanticorpi anti G-M-C-S-F. I risultati ottenuti dimostrano una correlazione significativa tra l'inibizione della crescita nel saggio biologico e l'inibizione del legame nel sistema acellulare mediata da frazioni di IgG sieriche e da autoanticorpi anti G-M-C-S-F purificati. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio biologico TF, è che questo sistema consente un'elevata capacità analitica con buona riproducibilità nella misurazione della capacità neutralizzante degli autoanticorpi anti GM CSF.Dato che l'autoanticorpo contro il GM-CSF causa una prognosi primaria autoimmune, le implicaz

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Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata dagli anticorpi che hanno come destinazione l'emagglutinina del virus dell'influenza. Questo dosaggio può essere adattato anche per valutare la capacità di anticorpi monoclonali o policlonali sieri altre glicoproteine di superficie virale di targeting di indurre immunità Fc.

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

Abbiamo ectopically espresso NR1 subunità del recettore NMDA etichettato come proteina fluorescente verde in cellule embrionali umane (HEK293) come antigene per rilevare autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA nel sangue di pazienti con sospettata con l'encefalite autoimmune. Questo semplice metodo può essere adatto per scopi nelle regolazioni cliniche di screening.

Un semplice Cell-based immunofluorescenza per rilevare autoanticorpi contro il recettore N-metil-D-aspartato (NMDA) nel sangue

Qui presentiamo un metodo di cytometry di flusso basato su cellulare per rilevare anticorpi neutralizzanti o altri fattori che interferiscono con l'assorbimento cellulare di terapie sostitutive enzima in una matrice umana, come un liquido spinale cerebrale (CSF) o siero umano.

Rilevazione degli anticorpi che neutralizzano l'assorbimento cellulare di terapie di sostituzione enzimatica con un'analisi Cell-based

Qui, presentiamo un protocollo per differenziare murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing linfociti T helper (THGM) da cellule T CD4 + ingenuo, incluso l'isolamento delle cellule T CD4 + Naive, differenziazione di THGM, e analisi delle cellule di THGM differenziate. Questo metodo può essere applicato agli studi del regolamento e la funzione delle cellule di THGM.

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM)

Questo studio descrive un metodo per isolare vescicole extracellulari arricchite di esosomi che trasportano fattori di stimolazione delle colonie di macrofagi dei granulociti immunostimoltori da cellule staminali embrionali.

Isolamento di vescicole extracellulari arricchite con esosomi che trasportano il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi da cellule staminali embrionali

Presentiamo un metodo privo di OGM per ottenere cellule con un fenotipo neuronale da cellule del sangue periferiche riprogrammate. L'attivazione di un percorso di segnalazione collegato a nuove proteine umane legate alla GPI rivela un metodo efficiente privo di OGM per ottenere cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione priva di OGM di cellule neuronali derivate dal sangue

L'uso di reagenti di riferimento per il test di rilascio di citochine consente di ottenere profili di sicurezza in vitro più riproducibili e standardizzati degli anticorpi monoclonali immunoterapeutici. Qui descriviamo come i saggi di rilascio di citochine possono essere utilizzati insieme a un pannello di reagenti di riferimento per prevedere la sicurezza di alcuni anticorpi monoclonali terapeutici.

Utilizzo di reagenti di riferimento per confermare la robustezza dei saggi di rilascio di citochine per la previsione della sicurezza degli anticorpi monoclonali

Descriviamo una piattaforma di immunodosaggio di recente sviluppo basata sui principi della biologia sintetica cell-free e sulla tecnica dot-blot per il rilevamento personalizzabile della risposta anticorpale in sieri umani e animali.

Cell-Free Dot Blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali

Impara un saggio cellulare libero per quantificare la capacità neutralizzante degli autoanticorpi GM-CSF utilizzando recettori ricombinanti SGMR alpha. Questo metodo offre alta riproducibilità per studi immunologici.

Un saggio gratuito Cell System Stima della capacità neutralizzante di GM-CSF utilizzando anticorpi ricombinanti solubili GM-CSF Receptor (Video) | JoVE Journal

Un saggio gratuito Cell System Stima della capacità neutralizzante di GM-CSF utilizzando anticorpi ricombinanti solubili GM-CSF Receptor

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