Vibratome sezionamento per la Conservazione avanzata del citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere immagini dell'organo del Corti con la massima conservazione dell'architettura cellulare. Questo risultato si ottiene sezionando, mediante vibratomo, orecchi interni fissati e dissezionati, al fine di ottenere sezioni spesse riducendo al minimo il numero di superfici tagliate per coclea. Le sezioni ottenute con il vibratomo vengono quindi colorate mediante immunohistochimica, tecnica che consente l'identificazione di diversi tipi cellulari e strutture cellulari all'interno dell'organo del Corti.

Successivamente, le sezioni vengono montate e analizzate mediante microscopia confocale al fine di ottenere immagini ad alta risoluzione che definiscano le posizioni in Z attraverso ogni sezione spessa di Vibram. I risultati ottenuti permettono l'analisi confocale delle cellule e delle strutture dell'organo del Corti con un minimo di disturbo dovuto al processo di sezionamento. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la paraffinazione e la crio-sezionatura, consiste nel fatto che i danni fisici al coclea sono ridotti al minimo, consentendo una migliore conservazione dell'architettura cellulare dell'organo del Corti. Per isolare l'orecchio interno, decapitare innanzitutto un topo adulto sacrificato utilizzando una lametta.

Aprire il cranio lungo la linea mediana, quindi rimuovere il cervello per esporre ogni orecchio utilizzando pinzette con attenzione, estrarre entrambe le orecchie interne. Immergere le orecchie interne in una provetta criogenica contenente paraformaldeide fresca al 4%, e agitare delicatamente durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare via il fissativo con tre cambi di soluzione salina fosfato tamponata una volta, decalcificare il tessuto adulto incubandolo in EDTA al 10% a quattro gradi Celsius per cinque giorni.

Risciacquare e conservare i bulbi oculari in PBS 1x fino al momento dell'elaborazione. Preparare l'agarosio a basso punto di fusione al 4% aggiungendo l'agarosio a PBS 1x e riscaldando al microonde fino a completa solubilizzazione. Mantenere l'agarosio fuso in un bagnomaria a 55 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Rimuovere l'orecchio interno dal PBS usando pinzette e posizionarlo sul fondo di uno stampo da distaccare. Rimuovere con una pipetta qualsiasi liquido residuo, quindi riempire lo stampo con mol e aros coprendo completamente l'orecchio interno per ottenere sezioni trasversali dell'organo del Corti. Posizionare l'orecchio interno in modo che sia visualizzato in vista laterale con il canale semicircolare laterale.

Angolo visibile, l'orecchio interno in modo che la linea formata dalla regione posteriore più esterna della coclea formi un angolo di 45 gradi rispetto al piano previsto di sezionamento. Una volta che l'agros si è solidificato, rimuovere delicatamente lo stampo di plastica. Utilizzare una lametta per tagliare l'eccesso di aros e creare un cubo.

Assicurandosi di lasciare abbastanza agarosio circostante per mantenere il tessuto ben supportato. Durante il sezionamento, attaccare la base del cubo di agarosio alla superficie di taglio del vibratomo utilizzando colla istantanea, sezionare in spessori compresi tra 40 e 100 micron e raccogliere le sezioni in una piastra contenente PBS 1x con 0,1% di Triton X-100, utilizzando pinzette.

Dissezionare gli aros dai preparati istologici. Trasferire i preparati in una piastra contenente PBS fresco 1X con 0,1% di Triton X-100, utilizzando una punta di pipetta con un'apertura larga, e procedere con la colorazione anticorpale in una piastra per colture cellulari. Al termine della colorazione anticorpale, i preparati istologici vengono montati su un vetrino da microscopio.

Per evitare di schiacciare le sezioni di tessuto spesse, posizionare uno strato di grasso da vuoto in forma quadrata attorno alla sezione, in modo da creare uno spazio tra il coprioggetto e il vetrino. Trasferire la sezione di tessuto su un vetrino da microscopio. Premere saldamente i bordi del coprioggetto per creare una sigillatura.

In alternativa, applicare con una pipetta un punto di un microlitro di resina per cromatografia aros di dimensione mesh nota in ciascuno dei quattro angoli in cui poggerà il coprioggetto, posizionare il coprioggetto e sigillare i bordi con smalto per unghie prima dell'acquisizione dell'immagine iniziale al microscopio confocale di una sezione trasversale di un organo di Corti. Nella prima immagine, le cellule ciliate interne, le cellule ciliate interne adiacenti, le cellule ciliate esterne e le cellule di Deiters sono visibili. Con la colorazione nucleare, le cellule pilastri sono visibili mediante colorazione con anticorpo S100 e appaiono gialle. Man mano che il microscopio confocale prosegue attraverso la sezione con passi di tre micron, il numero di cellule pilastri può essere determinato osservando la comparsa e la scomparsa dei loro nuclei.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sezionare l'orecchio interno mediante vibram, eseguire l'immunohistochemia su questi tagli e quindi acquisire le immagini mediante microscopia confocale. Questa procedura semplice, applicabile a qualsiasi anticorpo, garantisce la massima conservazione dell'organizzazione cellulare dell'organo del Corti.