Name: Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri la visualizzazione delle reti di cellule interstiziali di Cajal nel tratto gastrointestinale di topo mediante immunofluorescenza. Questo metodo consente di analizzare l'architettura cellulare e i fattori genetici che influenzano la motilità intestinale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute (K08CA140946, a YC), (5F32CA130372, per PC), (R01CA102774 e R01HL055748 a PB), il Dipartimento della Difesa (PC094302 a YC), il Fondo Famiglia Shuman per la Ricerca GIST (a PC), e il Consorzio Cancro Starr (per PC, YC, CLS e PB). Vorremmo ringraziare Katia Manova, Fan Ning, e Mesurh Turkekul della struttura molecolare di base MSKCC Citologia aiuto per criosezionamento e immunocolorazione.

1. Dissezione di mouse tratto gastrointestinale <ol><li> Topi da locali in materia di eutanasia IUCAC </li><li> Pin ogni arto sulla superficie di polistirolo e risciacquare superficie addominale con il 70% di etanolo. Aprire cavità addominale con incisione lungo la linea mediana dal diaframma al pube. Fare un'alzata al esofago distale e un secondo taglio a livello intestinale distale di grandi dimensioni e rimuovere il tratto gastrointestinale dallo stomaco all'ano in blocco, con attenzione al taglio dei legamenti del duodeno e cieco con piccole forbici. Luogo tratto gastrointestinale in una piastra di Petri con PBS. Sezionare via mesentere con pinzette (Figura 1). Per separare stomaco, intestino tenue e intestino crasso, tagliato a piloro e la giunzione ileocecale. Sciacquare il lume di ogni parte del tratto gastrointestinale con PBS usando una siringa da 5 ml collegata ad un ago di alimentazione (topi più anziani) o un ago senza punta (più giovani topi). </li><li> Stomaco aperto, intestino tenue e intestino crasso, lungo il confine mesenterica. Tagliate due pezzi per ogni parte del tratto gastrointestinale, una per la visualizzazione montare tutto e uno per cryosection. </li></ol> 2. Tutto montare la preparazione del campione e immunocolorazione <ol><li> Posizionare il pezzo intero di ogni parte del tratto gastrointestinale in un tubo di 1,5 centimetri microcentrifuga riempito con 1,0 ml di acetone ghiacciate e campioni correzione per almeno 1 ora a 4 ° C. I campioni possono essere conservati per un massimo di 1 settimana a -20 ° C. Noi di solito conservare i campioni in acetone e procedere per preparare cyrosections. </li><li> Lavare 2X campione con PBS. Collocare il campione in capsula di Petri con PBS. Sotto dissezione miscroscope, con attenzione raschiare strato mucoso con un bisturi tenendo una estremità con un paio di pinzette, lascia la tonaca muscolare. </li><li> Muscolo può essere tagliato in pezzi 5mm per colorazione con anticorpi diversi. Non conservare per più di 2 giorni in PBS prima della colorazione. </li><li> Passi blocco e l'incubazione può essere fatto in un pozzetto di un 24-pozzetti o in una provetta per microcentrifuga 1,5 ml. Blocco con 0,5 ml di tampone di bloccaggio (siero di capra al 5%, 0,1% Triton X-100 in PBS per 1 ora a 4 ° C). </li><li> Incubare con l'anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio e ruotare la notte a 4 ° C. Abbiamo utilizzato con successo ACK-2 Kit anti-ratto, coniglio anti-Ano1, e di coniglio anti-PGP9.5 anticorpi per immunostaining monte tutto. </li><li> Lavare per almeno 2X 5 con PBS sul rotore a temperatura ambiente. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente su rotatori. Noi in genere utilizzano Alexa Fluor 488 anti-coniglio e Alexa Fluor 594 anticorpi anti-topo. </li><li> Lavare per 15 minuti 3 volte con PBS su rotatori a temperatura ambiente. </li><li> Montare sulla slitta, lato sierose sulla parte superiore per garantire l'orientamento del tessuto durante la microscopia. Questo orientamento garantirà il lato sierose per affrontare il coprioggetto ed essere incontrati prima come ci si concentra nella diapositiva su un microscopio. Facciamo questo in un microscopio da dissezione. A volte, abbiamo brevemente esaminare il tessuto al microscopio a fluorescenza per orientare correttamente. Al microscopio a fluorescenza per visualizzare Kit o Ano1, si dovrebbe incontrare il CPI-MY prima rete dal lato del coprioggetto. Avanti, aspirare PBS per quanto possibile, senza asciugare completamente. Aggiungere 50 ml di set di supporti di montaggio duro (usiamo Prolungare Gold) e poggiate delicatamente scivolare coperchio sulla parte superiore del tessuto. Permettere l'impostazione di montaggio durante la notte a temperatura ambiente e conservare i vetrini a -80 ° C. </li><li> Per l'esame microscopico, abbiamo usato un microscopio a campo largo con una Z-drive. Abbiamo usato sia un obiettivo 20X aria (NA 0.75, apocromatico piano) o olio obiettivo 60X (NA 1.4, apocromatico piano) e preso 2 micron o 1 micron Z-sezioni che coprono l'intero muscolare. Le immagini sono state successivamente deconvoluted utilizzando il software Autoquant deconvoluzione. In alternativa, molti altri hanno usato la microscopia confocale, invece, con risultati simili. </li></ol> 3. Cryosection preparazione e immunocolorazione <ol><li> Luogo ogni parte del tratto gastrointestinale, lato sierose verso il basso, piatto su carta da filtro. Tagliare la carta da filtro di tutto il tessuto. Tessuto posto su carta da filtro nel 4% paraformaldeide (PFA) in PBS (noi diluire 32% paraformaldeide in flaconcino sigillato in PBS a destra prima dell'uso) per 2 ore a temperatura ambiente. Fissaggio può essere fatto in un 6 - o 12-pozzetti a seconda delle dimensioni del tessuto, o in un tubo microcentrifuga 1,5 ml. Se fatto in lamiera, parafilm per minimizzare l'esposizione PFA. Tempi di fissazione più lunga può portare a mascherare l'antigene, in particolare per l'ACK-2 anti-kit di anticorpi. </li><li> Rimuovere il tessuto da PFA e luogo nel 30% di saccarosio in PBS. Lasciare tessuto ad affondare durante la notte a 4 ° C. </li><li> Equilibrare tessuto con rapporto 1:1 del 30% saccarosio e ottobre per 1 ora. Quindi montare il tessuto in verticale cryomold pieno di ottobre L'asse longitudinale del tratto gastrointestinale va in parallelo con la cyrosections. Nell'esaminare topi con differenti genotipi o con diversi trattamenti, può essere utile per montare il tessuto da diversi tipi di mouse sul cryomold stesso per assicurare l'elaborazione parallela. Congelamento in ghiaccio secco e mettere in freezer -80 ° C per la conservazione. </li><li> Tagliare 10 criosezioni micronsul vetrino e conservare congelatore a -80 ° C. Noi di solito tagliato due sezioni per vetrino. Noi di solito procedere alla colorazione H &amp; E di una diapositiva cryosection. </li><li> Per immunofluorescenza, prima equilibrare scivolo a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi disegnare cerchio intorno al tessuto usando penna PAP. </li><li> Blocco con 150 ml di tampone di bloccaggio (come per tutta la immunostaining montaggio) per 1 ora. </li><li> Aspirare il tampone di bloccaggio e aggiungere 150 microlitri anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio e incubare una notte a 4 ° C in una camera umidificata. </li><li> Lavare 5 min 2X con PBS. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente. Noi in genere utilizzano Alexa 488 anti-coniglio e Alexa 594 anticorpi anti-topo. </li><li> Lavare per 15 minuti 3 volte con PBS. </li><li> Aspirare senza scivolare completamente l'essiccazione dei tessuti. Aggiungere una goccia di serie dura montaggio di mezzi con DAPI (usiamo Prolungare Gold) e posto # 1.5 coprioggetti. Porre il vetrino a temperatura ambiente per una notte per impostare e conservare in congelatore -80 ° C. </li><li> Acquisire immagini tripla fluorescenza con DAPI, FITC e Texas Red set di filtri. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Qui, usiamo l'intestino crasso come esempio. H &amp; E macchia di saccarosio protetto fisso sezione congelata utilizzata per immunofluorescenza mostra alcuni artefatti rispetto ad una sezione di paraffina di riferimento (Figura 2), dove la linea gialla demarks plesso mioenterico tra gli strati muscolari circolari e longitudinali e la demarks linea verde al confine tra le mucosa e muscularlis. Esaminando il cryosection, dalla sierosa a mucosa, è più sottile del primo incontro longitudinale muscolare (LM) strato seguito da spessore del muscolo circolare (CM) strato. La sezione dovrebbe essere in parallelo con il muscolo longitudinale in modo che il nucleo di LM dovrebbe essere un po 'allungata, mentre i nuclei delle CM deve essere piccolo e rotondo. Tra la LM e CM sono plexi mioenterico fatta di neuroni che macchia con PGP9.5. PGP9.5 anche i processi neuronali macchie in tutto il CM. Il mioenterico ICC rete (ICC-MY) circondano il plesso mioenterico e sono fatti di cellule multipolare. All'interno dello strato muscolare longitudinale, ci sono rari ICC intramuscolare (IM-ICC), che sono cellule bipolari in parallelo con il muscolo. All'interno dello strato muscolare circolare, ci sono abbondanti ICC-IM che sono anche le cellule bipolari che corrono paralleli con il muscolo circolare e sono sezionato con questo taglio. All'incrocio tra la tonaca muscolare e la sottomucosa, la rete sottomucosa CPI composta da ICC-SMP è una rete di piatto ICC multipolare. Esaminando l'intero kit di montaggio immunocolorazione del grosso intestino, ci si dovrebbe aspettare di incontrare l'ICC-MY prima rete, e poi il CPI-IM della CM, e ICC-SMP reti, ci si concentra dal coprioggetto (Figure. 3) . Misura volumetrica delle reti di ICC con ricostruzione in 3D di interi montare le immagini sono state descritte 10. Utilizzando a grande campo microscopio, vi sia una significativa out-of-plane fluorescenza nelle immagini prima che può essere rimosso dopo deconvoluzione (figura 3). Incompleta stripping della mucosa si tradurrà in fluorescenza di fondo elevato. ANO1 è un altro marker della Corte penale internazionale e co-immunocolorazione di KIT e ANO1 mostra sovrapposizione completa di colorazione ICC (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Rappresentante Figura 1. Sezionato tratto gastrointestinale del mouse, ristampato con il permesso 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A) Rappresentante colorazione H &amp; E della intestino del mouse di grandi dimensioni di criosezioni preparato come descritto e paraffina riferimento incorporato sezione che mostra alcuni manufatti restringimento di criosezioni. Il demarks linea gialla del plesso mioenterico e la linea blu separa la mucosa dalla muscolare. B) Rappresentante Kit (rosso, ACK-2) e PGP9.5 (verde) immunofluorescenza doppia con DAPI (blu) di contrasto dell 'intestino del mouse di grandi dimensioni. LM: CM longitudinale muscolare: muscolo circolare. Scala bar 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Rappresentante Kit (rosso, ACK-2) con tutto il montaggio immunofluorescenza dello stesso campo a tre piani focali, l'ICC-il mio aereo a LM / CM confine, l'ICC-IM aereo nel CM, e la CPI- aereo SMP al CM / sottomucosa confine. Immagini RAW e le immagini deconvoluted sono mostrati. Scala bar 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Rappresentante doppia immunofluorescenza di Ano1 (verde) e Kit (rosso, ACK-2) nel grande intestino. Scala bar 20 micron.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Cellule interstiziali di Cajal sono stati inizialmente caratterizzati da Santiago Ramóón y Cajal esattamente un secolo fa con le macchie cromato di blu di metilene e l&#39;argento di muscolare gastrointestinale. Cajal inizialmente pensato CPI sono stati i neuroni in base al loro processi che ricordano di assoni e dendriti. Nel corso di molti anni successivi, lo studio della biologia ICC è stato limitato dalla mancanza di marcatori specifici fino alla scoperta di questo KIT non solo si esprime in ICC, ma è necessario anche per il loro sviluppo 6. Da allora, KIT immunofluorescenza è stato ampiamente utilizzato nello studio della biologia e della Corte penale internazionale ha portato anche l&#39;apprezzamento della ICC in altri organi contrattili come la vescica urinaria. Recentemente, ANO1 è stato identificato come un secondo marcatore affidabile ICC. Ci sono state numerose pubblicazioni negli ultimi 15 anni, utilizzando l&#39;immunofluorescenza per identificare ICC con la fissazione vari e tecniche di montaggio. Nelle nostre mani &quot;fisso-congelato&quot; criosezioni che sono stati prefissati con paraformaldeide e saccarosio protette funziona meglio rispetto al acetone o paraformaldeide post-fissazione dopo criosezionamento. Per i montaggi tutto, abbiamo trovato che la fissazione di acetone mediante dissezione della mucosa dà i risultati più robusti. Storicamente, l&#39;ACK-2 è stato l&#39;anticorpo Kit di scelta per l&#39;identificazione del mouse ICC. Si tratta di un topo monoclonale che riconosce il dominio extracellulare ed è anche un anticorpo che causa il blocco ileo quando somministrato a vivere topi. Tuttavia, l&#39;ACK-2 epitopo viene lentamente distrutto da fissazione paraformaldeide e non viene salvato da metodi standard di recupero dell&#39;antigene. Abbiamo scoperto che l&#39;ACK-4 epitopo è più resistente alla fissazione paraformaldeide. Rispetto al fisso blocchi congelati e sezioni, blocchi di paraffina e le sezioni morfologia conserva meglio ed è più suscettibile di archiviazione a lungo termine (Figura 4). Né ACK ACK-2-4, né sono stati utilizzati con successo in sezioni di paraffina. Abbiamo caratterizzato che D13A2, un anticorpo monoclonale di coniglio nuovo, funziona particolarmente bene in entrambe le sezioni fisse congelati e paraffina del tratto gastrointestinale. Kit è espresso in diversi altri tipi cellulari, tra cui i melanociti, cellule ematopoietiche, cellule germinali e, in particolare mastociti, che si trovano anche nel tratto GI. Fortunatamente, le cellule si trovano la maggior parte dell&#39;albero è la mucosa e non nella muscolare. Colorazione doppia con coniglio anti-topo Ano1 e anti-kit in grado di eliminare marcatura non specifica di ciascun anticorpo (Figura 4). E &#39;anche interessante notare che l&#39;espressione relativa di kit e Ano1 tra sottoclassi di ICC sembra diverso. Per esempio, nel piccolo intestino, la colorazione Kit è molto più intensa in mioenterico ICC rispetto al CPI del muscolo plesso profondo mentre Ano1 colorazione è comparabile.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> ratto anticorpi anti-Kit (ACK clone-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml. Epitopo è perduto con overfixation. </td></tr><tr><td> ratto anticorpi anti-Kit (ACK clone-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml. </td></tr><tr><td> coniglio anti-KIT anticorpi (clone D13A2) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3074 </td><td> L&#39;uso ad diluizione 1:100. Anticorpi elencati solo qui che funziona bene in sezioni di paraffina. </td></tr><tr><td> coniglio anti-PGP9.5 anticorpi </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Etichette citoplasma delle cellule neuronali. Utile per contrassegnare i neuroni del plesso mioenterico. L&#39;uso ad diluizione 1:1000. </td></tr><tr><td> coniglio anti-Ano1 anticorpi </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 di capra anti-topo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> L&#39;uso ad 2μg/ml </td></tr><tr><td> L&#39;alimentazione degli animali Needle </td><td> Pescatore </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon punta dell&#39;ago utile per il lavaggio del tratto gastrointestinale di topi adulti </td></tr><tr><td> Blunt Needle </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Ago Blunt utile per il lavaggio del tratto GI di pre-svezzamento cuccioli </td></tr><tr><td> Prolungare reagente Oro Antifade con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Possono utilizzare alternativa hard-impostazione del supporto di montaggio con DAPI </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek ottobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 32% paraformaldeide (fiala da 10 ml sigillato) </td><td> EM Scienze </td><td> 15714 </td><td> Aperto fiala sigillata e diluire al 4% appena prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Tampone bloccante </td><td></td><td></td><td> Siero di capra al 5%, 0,1% Triton X-100 in PBS </td></tr></tbody></table>

visualizzazione delle cellule interstiziali di cajal (icc) di rete in topi

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono mesenchimali derivate &quot;cellule pacemaker&quot; del tratto gastrointestinale (GI) che generano spontanei onde lente necessaria per la peristalsi e mediare ingresso neuronali dal sistema1 nervoso enterico. Diversi sottotipi di ICC forma reti distinte nella muscolare del tratto gastrointestinale 2,3. Perdite o danni a queste reti è associato con una serie di disturbi della motilità 4. ICC cellule esprimono il recettore tirosin-chinasi KIT sulla membrana plasmatica e KIT immunocolorazione è stata utilizzata negli ultimi 15 anni per l&#39;etichetta della rete ICC 5,6. È importante sottolineare che l&#39;attività KIT normale è necessario per lo sviluppo ICC 5,6. Trasformazione neoplastica delle cellule ICC risultati in tumori stromali gastrointestinali (GIST), che spesso porto guadagno di funzione mutazioni KIT 7,8. Abbiamo recentemente dimostrato che ETV1 è un lignaggio specifico fattore di sopravvivenza espresso nel lignaggio ICC / GIST ed è un regolatore trascrizionale maestro necessari sia per la formazione normale rete ICC e della tumorigenesi GIST 9. Abbiamo inoltre dimostrare che collabora con mutazioni attivanti KIT nella tumorigenesi. Qui, descriviamo i metodi per la visualizzazione delle reti di ICC nei topi, in gran parte sulla base di protocolli precedentemente pubblicato con il 10,11. Più recentemente, il canale del cloro anoctamin 1 (ANO1) è stato caratterizzato come un marker specifico di membrana ICC 11,12. A causa della loro localizzazione membrana plasmatica, immunofluorescenza di entrambe le proteine ​​possono essere usate per visualizzare le reti ICC. Qui, descriviamo la visualizzazione delle reti ICC da fisso cyrosections congelati e preparati montare tutto.

Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono le cellule pacemaker del tratto gastrointestinale (GI). Essi formano reti complesse tra le cellule muscolari lisce e fibre neuronali post-gangliari per regolare contrattilità gastrointestinale. Qui vi presentiamo metodi di immunofluorescenza trasversale e con tutto il supporto di visualizzazione murini reti ICC.

Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi

Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono "cellule pacemaker" di derivazione mesenchimale del tratto gastrointestinale (GI) che generano onde lente spontanee...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le reti delle ICC del tratto gastrointestinale del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando e isolando l'intero tratto gastrointestinale, separandolo in stomaco, intestino tenue, cieco e intestino crasso. Successivamente, ogni parte del tratto gastrointestinale viene fissata o in acetone, seguito dalla rimozione della mucosa per l'immagine in preparato intero, oppure in formaldeide al 4%, seguita dall'inclusione e dal taglio criostatico per l'immagine in sezione trasversale.I campioni vengono quindi sottoposti a immunomarcatura con anticorpi diretti contro il kit e altri epitopi per etichettare le ICC e altre strutture pertinenti. Infine, le immagini vengono acquisite mediante microscopio a fluorescenza. In ultima analisi, è possibile ottenere risultati che mostrano gli effetti di manipolazioni genetiche o ambientali nei topi sull'architettura delle ICC attraverso la microscopia a immunofluorescenza.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle ICC, ad esempio in che modo reti di segnalazione specifiche e fattori di trascrizione influenzano l'architettura delle reti di ICC. In genere, le persone alle prime armi con questa tecnica incontreranno difficoltà, poiché un'errata rimozione dello strato mucoso e un'orientazione scorretta del preparato in toto potranno causare un marcato rumore di fondo e la perdita del segnale specifico. Per iniziare la dissezione del tratto gastrointestinale del topo, fissare gli arti di un topo eutanasizzato su una superficie in polistirolo e risciacquare la superficie addominale con etanolo al 70%. Aprire la cavità addominale praticando un'incisione mediana lunga, dal diaframma fino al pube.Eseguire un taglio all'esofago distale e un secondo taglio all'intestino crasso distale ed estrarre l'intero tratto gastrointestinale dallo stomaco all'ano in blocco. Tagliare con attenzione i legamenti al duodeno e al mesentere utilizzando forbici piccole. Posizionare il tratto gastrointestinale in una piastra di Petri contenente PBS.Dissezionare il mesentere usando pinzette per separare lo stomaco, l'intestino tenue e l'intestino crasso. Tagliare a livello della giunzione pilorica e ileocecale utilizzando una siringa da cinque millilitri collegata a un ago da alimentazione o a un ago smussato. Risciacquare la cavità luminale di ogni tratto del tratto gastrointestinale con PBS.Aprire lo stomaco, l'intestino tenue e l'intestino crasso lungo il margine mesenterico. Prelevare due frammenti per ciascun organo gastrointestinale, uno per la visualizzazione in whole mount e uno per sezioni crioistologiche. Fissare il campione in whole mount in acetone prima della crioistologia per prepararlo all'immunomarcatura.Per prima cosa, lavare il campione due volte in PBS. Quindi posizionare il campione in una piastra di Petri contenente PBS sotto un microscopio stereoscopico. Rimuovere con attenzione lo strato mucoso con un bisturi, tenendo un'estremità con pinzette, lasciando il muscolare; tagliare il muscolo in pezzi di cinque millimetri per la colorazione con diversi anticorpi.Non conservare il campione per più di due giorni prima della colorazione in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Incubare il campione nel buffer di blocco per un'ora a quattro gradi Celsius. Successivamente, incubare il campione negli anticorpi primari diluiti nel buffer di blocco, con rotazione, durante la notte a quattro gradi Celsius.Abbiamo utilizzato con successo un anticorpo secondario anti-topo CK due, un anticorpo primario anti-coniglio a O uno e un anticorpo anti-PGP 9.5 per la colorazione di preparati interi. La mattina successiva, lavare i campioni due volte per cinque minuti ciascuno in PBS con rotazione delicata.Quindi incubare i campioni con gli anticorpi secondari diluiti nel buffer di blocco per due ore. A temperatura ambiente, utilizziamo tipicamente gli anticorpi anti-coniglio Alexa Fluor 488 e anti-ratto Alexa 594. Lavare i campioni in PBS per 3 volte, 15 minuti ciascuna.Utilizzando un microscopio stereoscopico, montare i campioni su vetrini con il lato sieroso rivolto verso l'alto, rimuovendo la maggior quantità possibile di PBS. Applicare circa 50 microlitri di mezzo di montaggio rigido e posizionare un coprioggetto sopra. Lasciare solidificare il mezzo di montaggio per tutta la notte e conservare i vetrini a meno 80 gradi Celsius.Per la visualizzazione e l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio con obiettivo a campo luminoso. Con un dispositivo Z, si utilizza un obiettivo a immersione in aria da 20 volte o un obiettivo a immersione in olio da 60 volte, acquisendo sezioni Z di uno o due micron che attraversano l'intera muscolare. Le immagini vengono successivamente deconvolute mediante software di deconvoluzione automatica.In alternativa, la microscopia confocale può essere utilizzata per preparare sezioni crio per la colorazione immunoistochimica. Posizionare ogni parte del tratto gastrointestinale con il lato sal in basso, appiattito sulla carta da filtro. Tagliare la carta da filtro intorno al tessuto.Posizionare il tessuto sulla carta filtro in paraformaldeide al 4% in PBS per due ore a temperatura ambiente. Tempi di fissazione più lunghi potrebbero causare mascheramento dell'antigene, in particolare per l'anticorpo a K two anti kit. Trasferire il tessuto in soluzione di saccarosio al 30% in PBS e lasciare che il tessuto affondi durante la notte a quattro gradi Celsius.Equilibrare il tessuto con un rapporto uno a uno di saccarosio al 30% e OCT per un'ora. Quindi montare il tessuto verticalmente in uno stampo criogenico riempito di OCT. L'asse longitudinale del tratto gastrointestinale deve essere parallelo alle sezioni criogeniche.Quando si esaminano topi con genotipi diversi o provenienti da trattamenti diversi, può essere utile montare i tessuti di topi diversi sullo stesso stampo criogenico. Per garantire un'elaborazione parallela, congelare gli stampi su ghiaccio secco e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Tagliare sezioni crio di 10 micron sui vetrini, posizionando due sezioni per vetrino e conservarli a meno 80 gradi Celsius.Di solito eseguiamo la colorazione H e D su un vetrino destinato all'immunofluorescenza. Prima, equilibrare i vetrini a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, tracciare un cerchio intorno al tessuto utilizzando una penna per pap.Incubare i campioni in 150 microlitri di soluzione bloccante per un'ora. Aspirare la soluzione bloccante e aggiungere 150 microlitri di anticorpo primario diluito nella soluzione bloccante, quindi incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius in una camera umidificata. Dopo aver lavato due volte con PBS per cinque minuti ciascuno, incubare i campioni con anticorpi secondari diluiti nella soluzione bloccante per due ore.A temperatura ambiente, utilizziamo in genere gli anticorpi anti-coniglio Alexa 488 e anti-ratto Alexa 594. Lavare le sezioni in PBS per 3 volte, 15 minuti ciascuna, spruzzando i vetrini senza lasciare asciugare completamente il tessuto. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio rigido con DAPI e posizionare sopra un coprioggetto numero 1,5.Posizionare i vetrini a temperatura ambiente durante la notte per fissare i campioni prima di esaminarli utilizzando set di filtri dpi, fite e Texas red. Esaminare l'intestino crasso dal cirro alla mucosa. Si incontra innanzitutto lo strato più sottile di muscolo longitudinale o LM, seguito dal muscolo circolare più spesso o cm.La sezione deve essere parallela al muscolo longitudinale e perpendicolare al muscolo circolare, in modo che i nuclei del ML risultino leggermente allungati, mentre i nuclei del MC devono apparire piccoli e rotondi. Tra il ML e il MC si trovano i plessi mienterici, composti da neuroni che si colorano con la PGP 9.5, nonché i processi neuronali colorati diffusi in tutto il MC, osservabili nell'intero preparato. Procedendo con la messa a fuoco a partire dal vetrino, si incontreranno l'I-C-C-M-Y-I-C-C-I-M del MC e l'I-C-C-S-M-P.La rete di CCI mienterica circonda il plesso mienterico ed &egrave; composta da cellule multipolari all'interno del foglietto muscolare longitudinale. Sono presenti rari CCI intramuscolari, che sono cellule bipolari che decorrono in parallelo al muscolo all'interno del foglietto muscolare circolare. Sono abbondanti i CCI ims, che sono anch'essi cellule bipolari che decorrono parallelamente al muscolo circolare e sono sezionati in senso trasversale con questo taglio alla giunzione tra la muscolaris e la sottomucosa.La rete di ICC sottomucosa è una rete piatta di cellule multipolari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se effettuata correttamente. È necessario avere una buona comprensione delle modalità di dissezione e di immunomarcatura del tratto gastrointestinale del topo per osservare l'architettura delle ICC.

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