Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps

Sono Frederick Dina e sono professore associato di farmacologia qui alla Ohio State University. In questa dimostrazione, mostreremo la rilevazione dell'ossido nitrico e del superossido dalle cellule mediante EPR. Spin Trapping.

Le specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto sono state implicate nello sviluppo di varie malattie e quindi la loro rilevazione nei sistemi biologici è di fondamentale importanza. Nei sistemi biologici sono stati impiegati solo pochi metodi affidabili per l'individuazione di specie reattive, ma sono limitati dalla specificità e dalla sensibilità. Lo spin dropping, tuttavia, è comunemente usato per l'identificazione dell'eros e comporta la reazione di aggiunta del radicale a una trappola di spin nitro o a complessi metallici che formano un add di spin persistente, che può essere rilevato mediante spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica o EPR, i vari dotti di aggiunta radicalica mostrano lo spettro distintivo che può essere utilizzato per identificare i radicali generati e può fornire una grande quantità di informazioni sulla natura e la cinetica del radicale produzione.

Ossido nitrico La Syntase catalizza la conversione della L-arginina in L citrulina utilizzando N-A-D-P-H per produrre ossido nitrico. In condizioni di stress ossidativo, l'ENA può passare dalla produzione di ossido nitrico al superossido in un processo chiamato disaccoppiamento, che si ritiene sia causato dall'ossidazione dell'eme o dal fattore della tosse che la regolazione dell'ossido nitrico idroterinico nel sistema biologico è importante in quanto svolge un ruolo critico nella segnalazione cellulare con conseguenti funzioni fisiologiche benefiche come la dilatazione del vaso, Ma la sua sovrapproduzione è spesso associata a condizioni infiammatorie. Pertanto, la rilevazione dell'ossido nitrico nel sistema biologico è importante.

Un'altra importante classe di molecole di segnalazione nei sistemi biologici sono le specie reattive dell'ossigeno come l'ossido nitrico, le specie reattive dell'ossigeno a basse concentrazioni svolgono un ruolo importante nella regolazione della funzione cellulare, della segnalazione e della risposta immunitaria, ma in concentrazioni non regolate possono portare a danni ossidativi cellulari che portano allo stress ossidativo. L'anione radicale perossido S è una delle specie reattive dell'ossigeno più importanti ed è il principale precursore di alcune delle specie più altamente ossidanti conosciute per esistere nei sistemi biologici come il perossido S, il nitrito e l'idrossibarra. La rilevazione e/o il sequestro del perossido di S nel sistema biologico è quindi importante poiché la sua generazione segnala il primo segno di scoppio ossidato prima dell'inizio.

Questo protocollo di tripsina oculare ha coltivato cellule endoteliali dell'aorta bovina come descritto nella procedura scritta. Trasferisci le celle su un sei etichettato. Immergere in piastrella e incubare per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 dopo l'incubazione.

Rimuovere la piastra a sei pozzetti dall'incubatrice e aspirare il terreno dalla prima. Lavare bene le celle due volte con un millilitro di delcos fosfato tampone salino o DPBS. Preparare una soluzione di solfato di ferro epatite disidratata da 1,9 millimolari aggiungendo 0,8 milligrammi di solfato di ferro a un millilitro di DPBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio.

E preparare la soluzione MGD aggiungendo 2,7 milligrammi di ammonio MGD a 500 microlitri DPBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio. Aggiungere 210 microlitri di solfato di ferro da 1,9 millimolari appena preparato e 210 microlitri di MGD appena preparato utilizzando un rapporto di molarità da uno a sette e miscelare la sospensione risultante. Aggiungere 4,6 microlitri di ione calcio quattro e mescolare nuovamente la soluzione pipettando su e giù.

Quindi incubare il campione a 37 gradi Celsius per 36 minuti. Raccogli il supernat che si deposita in un tubo eorico. Inserire i parametri di acquisizione EPR campo centrale di 34 27 goss di modulazione, ampiezza di sei goss e frequenza di 9,8 gigahertz.

Poiché i parametri variano da uno strumento e da una condizione sperimentale all'altra, si prega di consultare il testo per gli altri parametri utilizzati in questa apparecchiatura. Trasferire il super natin in un sigillo a celle piatte EPR con paraffina e posizionarlo nella cavità EPR. Registrare gli spettri per circa 21 minuti a 121 scansioni e 10,4 secondi per scansione dopo l'esecuzione dell'esperimento.

Utilizzare l'elaborazione brucker WIN EPR per correggere la linea di base e integrare gli spettri 2D, riducendo il rumore di fondo. Va notato che il tempo di scansione e il numero di scansioni possono variare da un esperimento all'altro. Inoltre, i metodi per correggere la linea di base possono anche variare da un software all'altro.

Per iniziare a disaccoppiare Enos, rimuovere il terreno dal secondo pozzetto dei sei. Spianare bene e lavare le celle due volte con un millilitro DPBS. Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione preparata di Syn da 0,5 millimolari e portare il volume fino a due millilitri con DPBS contenente il 10% di FBS, incubare le cellule per due ore a 37 gradi Celsius e il 5% di CO2 dopo l'incubazione.

Lavare due volte le celle con DPBS. Quindi aggiungere 210 microlitri di solfato di ferro idrato da 2,8 millimolari appena preparati e 210 microlitri di MGD da 19,6 millimolari preparati freschi secondo la procedura precedente. Quindi, aggiungere 4,6 microlitri di ione calcio quattro millimolare e mescolare nuovamente la soluzione.

Come prima, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 36 minuti. Dopo 36 minuti, raccogliere la super natina che si deposita in una provetta einor e trasferirla in una cella piana EPR. Registrare gli spettri EPR utilizzando gli stessi parametri di acquisizione di prima dopo l'acquisizione.

Elaborare i dati nello stesso modo prima dell'inizio del presente Protocollo. Preparare una soluzione madre di un molare DMPO e PBS contenente 0,1 millimolari di DTPA. Quindi preparare una soluzione di un milligrammo per millilitro di quattro per 12.

L'acetato Myra State 13 o PMA in DMSO produce aliquote di un millilitro della soluzione madre di PMA diluendola a 10 microgrammi per millilitro in PBS in una provetta einor contenente un milligrammo per millilitro di glucosio D e un milligrammo per millilitro. L'albumina produce da cinque a 6 milioni di cellule PMN per millilitro pipettando su e giù in una provetta einor da 1,5 millilitri. Preparare una miscela con un volume finale di 60 microlitri contenente circa 1,6 volte 10 alle sei cellule di PMN, 10 millimolari DMPO e 0,2 microgrammi per millilitro di PMA.

In questo esperimento, utilizzeremo uno spettrometro in banda Bruker ESP 300 X. Trasferire la soluzione in una pila piatta EPR, quindi posizionare la pila piatta nella cavità EPR. Inserire i parametri di acquisizione EPR campo centrale di 3, 486 goss di modulazione ampiezza di 0,5 goss e frequenza di 9,8 gigahertz.

Poiché i parametri variano da uno strumento all'altro e le condizioni sperimentali all'altra, si prega di consultare il testo per gli altri parametri utilizzati in questo esperimento Acquisisci spettri. In questa dimostrazione, mostriamo la rilevazione di radicali ossido nitrico e perossido SU utilizzando due diverse trappole di spin. Il ferro MGD e DNPO.

Dimostriamo che la stimolazione delle cellule endoteliali con lo ione calcio quattro produce ossido nitrico e il trattamento con uno visto. Un donatore di nitrito perinico può diminuire la produzione di ossido nitrico, una stimolazione dei neutrofili, tuttavia, con PMA in presenza di una trappola nitro spin dà un radicale ossidrile ADDA invece dell'ossido S a causa dell'instabilità del superossido adda inizialmente formato. Mentre i meccanismi di intrappolamento dello spin da parte del ferro mg d nitros sono fondamentalmente gli stessi, l'aggiunta di ossido nitrico al ferro MGD comporta una velocità di reazione passante e che la forma di aggiunta di ossido nitrico di ferro MGD è molto stabile.

Che infatti si può congelare la soluzione a meno 80 gradi centigradi per la successiva acquisizione dello spettro EPR senza una diminuzione significativa dell'intensità del segnale EPR. D'altra parte, il rilevamento dell'ossido utilizzando la trappola nitro spin è lento. Ciò richiede concentrazioni più elevate della trappola di spin rispetto alla controparte di rilevamento di ossido nitrico MGD a quattro di ferro.

Sono stati impiegati diversi approcci per rilevare con successo la forma dell'addotto superossido, che non abbiamo più dimostrato in questo video. L'uso di celle piatte, ad esempio, può fornire una migliore intensità del segnale di aggiunta di perossido a causa della maggiore densità cellulare. Vi incoraggio a fare riferimento al testo su questo argomento.

Inoltre, invece di utilizzare il DMPO, si può utilizzare una trappola di spin certificata come BMPO e VMP o il Nitro DAP MPO fosforilato, che può produrre addax di perossido SU più persistente. L'uso della ciclodestrina è stato impiegato anche per stabilizzare il perossido SU e aggiungere adattarsi quando si impiega l'intrappolamento dello spin per il rilevamento degli Stati Uniti. Si raccomanda vivamente l'acquisizione immediata dello spettro EP dopo la generazione di superossido SU.

Pertanto, la rilevazione dell'ossido nitrico utilizzando il ferro MGD è molto più efficiente e la sfida principale che ora si trova ad affrontare un intrappolamento di spin PR del superossido è quella di raggiungere quelle caratteristiche osservate per la formazione dell'addoch di ossido nitrico del ferro MGD. Cioè veloce, reattività al superossido e stabile aggiungere sforzi nello sviluppo di trappole di spin con reattività rapida al superossido e formazione di spin stabile. L'ADD è ora in corso nel nostro laboratorio e anche da altri Gruppi.