Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps

Sono Frederick Dina e sono professore associato di farmacologia presso la Ohio State University. In questa dimostrazione, mostreremo il rilevamento di ossido nitrico e superossido da cellule mediante EPR. Cattura di spin.

Si ritiene che le specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto siano coinvolte nello sviluppo di diverse malattie, e pertanto la loro rilevazione nei sistemi biologici riveste un'importanza fondamentale. Sono stati impiegati solo pochi metodi affidabili per il rilevamento delle specie reattive nei sistemi biologici, ma tali metodi presentano limitazioni in termini di specificità e sensibilità. La tecnica dello spin trapping, tuttavia, è comunemente utilizzata per l'identificazione dei radicali liberi e prevede la reazione di addizione di un radicale a un agente catturatore di spin nitrosilico o a complessi metallici, formando un addotto di spin persistente, rilevabile mediante spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica o EPR; i diversi addotti radicalici mostrano spettri distintivi che possono essere utilizzati per identificare i radicali generati e forniscono un'ampia quantità di informazioni sulla natura e sulla cinetica della produzione dei radicali.

La sintasi dell'ossido nitrico catalizza la conversione dell'L-arginina in L-citrullina utilizzando NADPH per produrre ossido nitrico. In condizioni di stress ossidativo, l'ENOS può passare dalla produzione di ossido nitrico a quella di superossido in un processo chiamato disaccoppiamento, ritenuto causato dall'ossidazione dell'eme o del cofattore tetraidrobiopterina. La regolazione dell'ossido nitrico nei sistemi biologici è importante poiché svolge un ruolo fondamentale nella segnalazione cellulare, determinando funzioni fisiologiche benefiche come la vasodilatazione; tuttavia, la sua sovraproduzione è spesso associata a condizioni infiammatorie. Pertanto, il rilevamento dell'ossido nitrico nei sistemi biologici è di fondamentale importanza.

Un'altra importante classe di molecole di segnalazione nei sistemi biologici è rappresentata dalle specie reattive dell'ossigeno come l'ossido nitrico; queste specie, a basse concentrazioni, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione cellulare, nella trasmissione di segnali e nella risposta immunitaria, ma a concentrazioni non regolate possono provocare danni ossidativi cellulari che portano allo stress ossidativo. L'anione radicale superossido è una delle specie reattive dell'ossigeno più importanti ed è il principale precursore di alcune delle specie ossidanti più potenti conosciute nei sistemi biologici, come il perossinitrito e il radicale idrossile. La rilevazione e/o il sequestro dell'anione superossido nei sistemi biologici è quindi fondamentale, poiché la sua generazione segnala il primo segno di un'esplosione ossidativa prima dell'inizio.

In questo protocollo si trattano con tripsina occhi di cellule endoteliali aortiche bovine coltivate come descritto nella procedura scritta. Trasferire le cellule in una piastra a sei pozzetti etichettata e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% CO2 dopo l'incubazione.

Rimuovere la piastra a sei pozzetti dall'incubatore ed aspirare il mezzo dal primo pozzetto. Lavare le cellule due volte con un millilitro di soluzione salina tampone fosfato priva di calcio e magnesio (DPBS). Preparare una soluzione di solfato ferroso eptaidrato 1,9 millimolare aggiungendo 0,8 milligrammi di solfato ferroso a un millilitro di DPBS contenente cloruro di calcio e cloruro di magnesio.

E preparare la soluzione di MGD aggiungendo 2,7 milligrammi di ammonio MGD a 500 microlitri di DPBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio. Aggiungere 210 microlitri di solfato ferroso eptaidrato 1,9 millimolare appena preparato e 210 microlitri di MGD appena preparato utilizzando un rapporto molare di uno a sette e mescolare la sospensione risultante. Aggiungere 4,6 microlitri di ioni calcio quattro e mescolare nuovamente la soluzione aspirando e dispensando con la pipetta.

Quindi incubare il campione a 37 gradi Celsius per 36 minuti. Raccogliere il soprannatante che si deposita in un tubo einor. Impostare i parametri di acquisizione EPR con campo centrale di 34,27 goss, ampiezza di sei goss e frequenza di 9,8 gigahertz.

Dato che i parametri variano da uno strumento e condizione sperimentale all'altro, si rimanda al testo per altri parametri utilizzati con questo equipaggiamento. Trasferire il super natin in una cella piatta EPR e sigillare con paraffina, quindi posizionarla nella cavità EPR. Registrare gli spettri per circa 21 minuti con 121 scansioni e 10,4 secondi per scansione dopo l'esecuzione dell'esperimento.

Utilizzare l'elaborazione Brucker WIN EPR per correggere la linea di base e integrare gli spettri 2D, riducendo così il rumore di fondo. Si noti che il tempo di scansione e il numero di scansioni possono variare da un esperimento all'altro. Inoltre, i metodi per correggere la linea di base possono variare da un software all'altro.

Per iniziare il distacco dell'Enos, rimuovere il mezzo dal secondo pozzetto della piastra a sei pozzetti e lavare le cellule due volte con un millilitro di DPBS. Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione preparata di Syn uno 0,5 millimolare ed portare il volume a due millilitri con DPBS contenente il 10% di FBS. Incubare le cellule per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, al termine dell'incubazione.

Lavare le cellule due volte con DPBS. Quindi aggiungere 210 microlitri di solfato ferroso eptaidrato appena preparato, 2,8 millimolare, e 210 microlitri di MGD 19,6 millimolare preparato frescamente secondo la procedura precedente. Successivamente, aggiungere 4,6 microlitri di ioni calcio 1,9 millimolare quattro e mescolare nuovamente la soluzione.

Come in precedenza, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 36 minuti. Dopo 36 minuti, raccogliere il sopranatante che si deposita in un tubo einor e trasferirlo in una cella EPR piatta. Registrare gli spettri EPR utilizzando gli stessi parametri di acquisizione della volta precedente, dopo l'acquisizione.

Elaborare i dati nello stesso modo precedente all'inizio di questo protocollo. Preparare una soluzione madre di DMPO monomolare e PBS contenente DTPA 0,1 millimolare. Quindi preparare una soluzione di un milligrammo per millilitro di quattro per 12.

Myra State 13 acetato o PMA in DMSO: preparare aliquote da un millilitro della soluzione madre di PMA diluendola a 10 microgrammi per millilitro in PBS in un tubo Eppendorf contenente un milligrammo per millilitro di D-glucosio e un milligrammo per millilitro di albumina. Ottenere cinque-sei milioni di cellule PMN per millilitro pipettando su e giù in un tubo Eppendorf da 1,5 millilitri. Preparare una miscela con un volume finale di 60 microlitri contenente circa 1,6 × 10⁶ cellule di PMN, 10 millimolari di DMPO e 0,2 microgrammi per millilitro di PMA.

In questo esperimento, utilizzeremo uno spettrometro Bruker ESP 300 in banda X. Trasferire la soluzione in una cella piatta per EPR, quindi posizionare la cella nella cavità dell'EPR. Impostare i parametri di acquisizione EPR: campo centrale a 3.486 goss, ampiezza di modulazione di 0,5 goss e frequenza di 9,8 gigahertz.

Dato che i parametri variano da uno strumento all'altro e da una condizione sperimentale all'altra, si rimanda al testo per gli altri parametri utilizzati in questo esperimento per acquisire gli spettri. In questa dimostrazione, mostriamo il rilevamento dei radicali liberi di ossido nitrico e di perossido SU mediante due diversi spin trap: il ferro MGD e il DNPO.

Mostriamo che la stimolazione delle cellule endoteliali con ioni calcio produce ossido nitrico e il trattamento con seen one. Un donatore di nitrito perinoso può ridurre la produzione di ossido nitrico, una stimolazione dei neutrofili, tuttavia, con PMA in presenza di un trappolante nitrico a spin fornisce un radicale idrossile ADDA invece dell'ossido S a causa dell'instabilità dell'addotto di superossido inizialmente formato. Mentre i meccanismi di trappolamento a spin da parte dei nitrosi di ferro mg d sono fondamentalmente gli stessi, l'aggiunta di ossido nitrico al ferro MGD coinvolge una velocità di reazione passiva e che la forma addotta di ossido nitrico con ferro MGD è molto stabile.

In effetti, è possibile congelare la soluzione a meno 80 gradi centigradi per l'acquisizione successiva dello spettro EPR senza una significativa riduzione dell'intensità del segnale EPR. D'altra parte, il rilevamento dell'ossido mediante l'uso del trappolante nitrico è lento, richiedendo concentrazioni più elevate del trappolante rispetto al corrispondente complesso ferro-MGD utilizzato per il rilevamento dell'ossido nitrico.

Sono stati impiegati diversi approcci per rilevare con successo la forma dell'addotto del superossido, che non abbiamo più dimostrato in questo video. L'uso di una cella piatta, ad esempio, può fornire una maggiore intensità del segnale dell'addotto del superossido grazie a una densità cellulare più elevata. Ti invito a consultare il testo su questo argomento.

Inoltre, invece di utilizzare DMPO, si può impiegare un inibitore di spin certificato come BMPO e VMP o il Nitro DAP MPO fosforilato, che può produrre addotti più persistenti con il perossido di SU. L'uso di ciclodestrina è stato inoltre impiegato per stabilizzare gli addotti di perossido di SU quando si utilizza l'inibizione di spin per la rilevazione di US. Si raccomanda vivamente di acquisire immediatamente lo spettro di EP subito dopo la generazione di superossido SU.

Pertanto, il rilevamento dell'ossido nitrico mediante MGD ferroso è molto più efficiente e la principale sfida attuale per il trappolamento di spin PR del superossido consiste nel raggiungere le caratteristiche osservate nella formazione dell'addotto di ossido nitrico con MGD ferroso, ovvero reattività rapida nei confronti del superossido e formazione di addotti stabili. Sforzi mirati allo sviluppo di trappole di spin con elevata reattività verso il superossido e in grado di formare addotti stabili sono attualmente in corso nel nostro laboratorio e da parte di altri gruppi di ricerca.