Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo di cellule staminali emopoietiche

L'obiettivo generale di questa procedura è differenziare cellule staminali ematopoietiche umane e cellule progenitrici lungo la linea eritroide e silenziare un particolare fattore di trascrizione durante l'eritropoiesi ex vivo. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto cellule staminali e progenitrici umane positive per CD34 da sangue del cordone, midollo osseo o sangue periferico mobilizzato con GCSF. Il secondo passaggio della procedura consiste nel differenziare queste cellule staminali ematopoietiche lungo la linea eritroide mediante una procedura di coltura cellulare in quattro fasi che combina citochine specifiche e una co-coltura su uno strato di cellule stromali per mimare il microambiente del midollo osseo.

Successivamente, preparare le particelle virali lentivirali esprimenti una molecola HRNA contro il fattore di trascrizione di interesse, una molecola HRA randomizzata come controllo negativo e la proteina GFP per monitorare l'efficienza di infezione virale. L'ultima fase della procedura consiste nell'infettare le cellule eritroidi primarie umane in uno specifico stadio di differenziamento con le particelle lentivirali. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano la proliferazione cellulare e il differenziamento eritroide attraverso l'analisi della morfologia cellulare, della capacità delle progenitrici di formare colonie, della produzione di emoglobina e dell'espressione di marcatori specifici eritroidi mediante facts.

L'efficienza dell'infezione virale viene analizzata misurando l'espressione di GFP mediante FACS e il silenziamento del fattore trascrizionale di interesse viene analizzato mediante R-T-Q-P-C-R. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'emopoiesi, come il meccanismo molecolare con cui ciascun fattore trascrizionale regola l'espressione genica in un ambiente non trasformato fornito da cellule umane primarie. Questo aspetto è importante per comprendere i processi fondamentali dell'emopoiesi, come la determinazione del destino cellulare, la proliferazione con capacità di autorenovazione o l'apoptosi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui normali ROI e sulla loro regolazione a livello molecolare, può anche essere utilizzato come sistema modello per studiare terapie mirate per malattie derivanti da squilibrio, proliferazione anomala e differenziazione, inclusi disturbi mieloproliferativi come la policitemia vera e la leucemia. Il protocollo per l'eritropoiesi ex vivo di cellule staminali ematopoietiche umane e cellule progenitrici fino a ottenere globuli rossi maturi contenenti emoglobina comprende due fasi: l'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche umane e delle cellule progenitrici positive per CD34 e la differenziazione eritroide in coltura cellulare senza siero. Nel primo passaggio, le cellule positive per CD34 vengono isolate da sangue del cordone ombelicale, midollo osseo o sangue periferico umano mobilizzato con GCSF, mediante selezione immuno positiva.

Il secondo passaggio della differenziazione eritroide senza siero prevede la coltivazione di cellule CD34 positive in coltura liquida. Secondo un protocollo in quattro fasi adattato dal metodo inizialmente sviluppato dal laboratorio DU, dal giorno zero al giorno 11 le cellule ematopoietiche vengono coltivate in cuffie di ghiaccio suppletivate, in mezzo ECCO modificato contenente idrocortisone, fattore di crescita delle cellule staminali, interleuchina-3 ed eritropoietina. Successivamente, dal giorno 11 al giorno 15, le cellule eritroidi vengono co-coltivate su cellule mesenchimali MS5 in mezzo IMDM suppletizzato contenente EPO, nel passaggio tre.

Dopo aver raccolto le cellule eritroidi estive per un uso futuro, le cellule rimanenti vengono coltivate in co-coltura su cellule MS5 in mezzo IMDM integrato senza citochine. Infine, dal giorno 18 al giorno 26, le cellule eritroidi vengono concentrate da tre a quattro volte e mantenute su uno strato di cellule MS5 per favorire la maturazione, aggiungendo il 10% di FBS nel mezzo IMDM integrato per una migliore conservazione dei globuli rossi coltivati. Ai fini di questo articolo video, illustreremo soltanto il secondo passaggio della differenziazione eritoide, ovvero la co-coltura delle cellule eritroidi su cellule mesenchimali in presenza di eritropoietina.

L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nell'eseguire questi passaggi su larga scala, effettuando il lavaggio e la sostituzione del mezzo del flacone contenente le cellule AUS five per la co-coltura e successivamente trasferendo le cellule art trade in questo flacone. Pertanto, lavoriamo su un flacone alla volta e ne gestiamo contemporaneamente il 2%. Per iniziare la co-coltura delle cellule eritroidi su cellule mesenchimali con EPO, si contano le cellule eritroidi utilizzando il trian blu per escludere le cellule morte.

Al giorno 11, la densità cellulare dovrebbe essere di circa 1,5 × 10⁶ cellule per millilitro; conservare circa 80 millilitri della coltura cellulare eritroide per la co-coltura con cellule mesenchimali MS5. Riscaldare in anticipo la soluzione salina tampone al fosfato (PBS) e il mezzo IMDM integrato, nonché il mezzo IMDM integrato contenente EPO, a 37 gradi Celsius. Successivamente, prelevare dall'incubatore quattro dei flaconi precedentemente preparati con cellule mesenchimali MS5 confluenti.

Lavare ogni flacone con 20 millilitri di XPBS e aggiungere immediatamente 80 millilitri di mezzo IM DM integrato fresco contenente EPO in ciascun flacone. Mantenere le cellule nell'incubatrice mentre si preparano le cellule eritroidi. Trasferire ora le cellule eritroidi riservate in due tubi conici da 50 millilitri e centrifugare a 1500 RRP M per 10 minuti.

Dopo aver eliminato il soprannatante, lavare ciascuno dei due pellet cellulari con 20 millilitri di mezzo IMDM integrato resus, quindi sospendere ciascun pellet cellulare in 40 millilitri di mezzo IMDM integrato contenente EP. Successivamente, distribuire 20 millilitri di questa sospensione cellulare in ciascuno dei quattro flask contenenti cellule MS five e 80 millilitri di mezzo. A questo punto, si dovrebbero avere quattro flask con cellule MS five confluenti contenenti 100 millilitri di cellule eritroidi a 0,3 × 10⁶ cellule per millilitro. Il giorno seguente, contare le cellule eritroidi con trian blue per escludere le cellule morte. La densità cellulare dovrebbe essere di circa 0,6 × 10⁶ cellule per millilitro.

Isolare il numero necessario di cellule per eseguire test volti a verificare una corretta proliferazione cellulare e differenziazione eritroide. Lo studio dell'eritropoiesi a livello trascrizionale richiede inoltre la capacità di sovraesprimere o ridurre l'espressione di fattori specifici nelle cellule eritroidi primarie. In questo esempio, viene utilizzato un sistema di trasferimento genico mediato da lentivirus per ridurre l'espressione del fattore di trascrizione nelle cellule eritroidi primarie umane.

Il protocollo per la preparazione di particelle di vettori lentivirali è disponibile nel manoscritto. Questo video illustrerà la procedura per l'infezione lentivirale di cellule eritroidi primarie finalizzata alla consegna genica. Le cellule eritroidi nucleate possono essere infettate in modo efficiente in qualsiasi stadio di differenziazione utilizzando una molteplicità di infezione compresa tra 50 e 100.

Qui verrà utilizzato un lentivirus che esprime una T one o un S-H-R-N-A randomizzato per infettare cellule eritroidi ai giorni otto e nove della differenziazione, usando un MOI di 52 unità per cellula. Per iniziare questa procedura, preparare tre provette coniche da 15 millilitri contenenti uno virgola zero per dieci alla sesta cellule eritroidi, una provetta per l'inattivazione di TAL one, una provetta per il controllo negativo randomizzato e una provetta per l'espressione di GFP. Lavare le cellule controllo con cinque millilitri di mezzo IMDM integrato contenente EPO, centrifugare a 1000 giri al minuto per cinque minuti ed eliminare la maggior quantità possibile di sopranatante.

L'infezione deve essere eseguita con quantità minime di mezzo per consentire un'assorbimento massimo del lentivirus sulle cellule. Aggiungere polibrene a una concentrazione finale di 40 microgrammi per millilitro in ogni provetta contenente lentivirus concentrati. Aggiungere 100 microlitri di virus concentrato preparato contenente polibrene a ogni provetta di cellule.

Incubare per un'ora nell'incubatrice a 37 gradi Celsius, mescolando con leggeri colpetti delle dita ogni 10 minuti. Questo permette una distribuzione uniforme del virus tra le cellule al termine dell'incubazione di un'ora in 1,9 millilitri di mezzo IMDM integrato contenente EPO per ogni provetta. Trasferire ogni campione in una piastra a sei pozzetti e posizionare nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Dopo 24 ore, raccogliere le cellule in provette separate da 15 millilitri. Centrifugare a 1000 RRP M per cinque minuti ed eliminare il soprannatante. Ripetere l'infezione, aggiungere il virus e la polibrena e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius con leggeri colpetti sul tubo.

Quindi aggiungere il mezzo IMDM integrato contenente EPO alle cellule. Trasferire ogni campione in una piastra a sei pozzetti e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire le cellule in tre provette coniche da 15 millilitri e lavare mediante centrifugazione, rimozione del sopranatante e risospensione delle cellule in mezzo fresco, seguita da centrifugazione.

Anche in questo caso, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule a una concentrazione di 0,2 × 10⁶ cellule per millilitro in IMDM integrato con EPO. Successivamente, procedere con la procedura di differenziamento eritroide: le cellule vengono conteggiate ogni due giorni durante il protocollo di differenziamento eritroide ex vivo. Un risultato rappresentativo in scala logaritmica mostra che le cellule sono altamente proliferative, come illustrato dall'amplificazione di 10.000 volte.

Inoltre, si coltivano i gemmuletti GRUNWALD, pertanto la colorazione per la morfologia viene eseguita ogni due giorni utilizzando 0,05 volte 10 delle sei cellule dal giorno zero all'otto e 0,2 volte 10 delle sei cellule per gli altri giorni. Come illustrato in questa figura, le cellule in particolari stadi di differenziamento mostrano dimensioni e morfologie riconoscibili. Si noti il processo di enucleazione che avviene al termine del differenziamento a partire dal giorno 20.

Al giorno 26, tutte le cellule hanno perso i loro nuclei. I saggi di formazione di colonie vengono utilizzati per rilevare progenitori ematopoietici precoci e tardivi durante i primi giorni di differenziazione, e i risultati sono mostrati qui al giorno zero. Oltre ai progenitori eritroidi, i progenitori di granulociti e macrofagi sono significativamente rappresentati all'interno delle cellule positive a CD34 precoci.

Procedendo la differenziazione, si osserva una diminuzione significativa di alcuni GM, e al sesto giorno questi sono stati completamente sostituiti da progenitori eritroidi, BFU-E e CFU-E. È inoltre importante notare che dal quarto al sesto giorno, i progenitori eritroidi precoci, BFU-E, vengono progressivamente sostituiti dai loro derivati più differenziati, CFU-E. Al giorno 10, le cellule eritroidi hanno essenzialmente perso la capacità di formare colonie.

Qui sono mostrate immagini tipiche di BFUE e CFUE. Il colore rosso-bruno è dovuto all'emoglobina presente in BFUE e CFUE. L'eritropoiesi viene monitorata durante la differenziazione ex vivo raccogliendo le cellule nei punti temporali indicati e analizzandole mediante facts o mediante microscopia per l'espressione di marcatori della superficie cellulare.

Qui, le barre rappresentano le percentuali di cellule positive. Le osservazioni significative includono la perdita progressiva del marcatore dei progenitori delle cellule staminali ematopoietiche CD 34, l'acquisizione e la perdita progressiva del marcatore progenitore CD 36, l'acquisizione e la perdita progressiva del marcatore eritroide, progenitore e dei reticolociti CD 71, e l'aumento del marcatore dei precursori eritroidi e degli eritrociti GPA. Altri marcatori della differenziazione eritroide includono la sintesi di emoglobina che inizia al giorno otto, misurata mediante colorazione con benadina, e l'enucleazione cellulare che inizia al giorno venti.

Valutato in base alla perdita del colorante per il DNA LDS, i risultati del trasferimento genico mediato da lentivirus in proeritroblasti primari umani sono mostrati successivamente alla riduzione del fattore di trascrizione T one, mediata da lentivirus che esprimevano un SHRA anti T one o uno SHRA di controllo randomizzato. La misurazione della cinetica del livello dei trascritti mRNA di T one mediante RT-qPCR e l'espressione del trascritto di T one rispetto a 18S rRNA hanno mostrato che il 75% dei trascritti di T one è stato efficacemente ridotto in cellule eritroidi primarie.

L'aumento del livello di trascritto T one dal giorno nove al giorno 12 e il controllo randomizzato evidenziano l'importanza di questo fattore di trascrizione durante la differenziazione eritroide. Infine, in un altro esperimento, le cellule eritroidi sono state infettate con lentivirus che esprimevano la proteina GFP. Questa figura mostra che tre giorni dopo l'infezione, la maggior parte delle cellule eritroidi esprime GFP, come misurato mediante fluorescenza al microscopio e mediante facts.

Ciò indica un'efficienza di infezione nelle cellule eritroidi primarie vicina al 100% dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'emopoiesi per esplorare la regolazione della trascrizione nell'eritropoiesi umana. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come differenziare le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici in eritrociti in coltura, nonché di come utilizzare la trasduzione genica mediata da lentivirus per indurre un knockout genico efficiente in qualsiasi fase di questo processo di differenziazione.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.