Name: Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo di cellule staminali emopoietiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Scopri il knockdown mediato da lentivirus del fattore di trascrizione TAL1 durante l'eritropoiesi ex vivo di cellule staminali emopoietiche umane CD34 positive. Questo metodo permette di studiare la regolazione genica nell'ematopoiesi.

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Ringraziamo L. Douay e MC Giarratana (Université Paris VI, France) per un parere sulla differenziazione ex vivo eritroide, Allan D. e H. Atkins (Ohří, Canada) per aver fornito campioni di sangue (ottenuto con l&#39;Ospedale di Ottawa di Ricerca Etica consiglio # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne), per fornire i vettori lentivirali e FJ Dilworth (Ohří, Canada) per la lettura critica del manoscritto. Questo progetto è stato finanziato da una sovvenzione CIHR (MOP-82813) a MBCGP è un destinatario di una borsa di studio di ricerca di formazione Ontario computazionale Regulomics Fondo di post-dottorato. MB detiene il Canada Research Chair in Regolazione dell&#39;espressione genica.

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<li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li>
<li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un certo numero di metodi sono stati utilizzati in precedenza per differenziare le cellule eritroidi in coltura con gradi variabili di successo. Per esempio, alcuni protocolli senza co-coltura su MS-5 consente l&#39;espansione delle cellule eritroidi, ma non sono efficienti nella produzione di celle enucleato completamente maturo rosso sangue 12-17. Mentre gli altri metodi permettono l&#39;enucleazione efficiente, è a scapito della proliferazione 18,19. Il metodo che abbiamo utilizzato qui, inizial...

lentivirali-mediata knockdown durante ex vivo</emeritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Eritropoiesi è un sistema modello comunemente utilizzato per studiare la differenziazione cellulare. Durante l&#39;eritropoiesi, pluripotenti adulte cellule staminali emopoietiche (CSE) si differenziano in cellule progenitrici oligopotent, precursori e globuli rossi maturi 1. Questo processo è regolato in gran parte a livello dell&#39;espressione genica, in cui fattori di trascrizione specifici attivare lineage-specifici geni, mentre in concomitanza reprimendo i geni che sono specifici per altri tipi di cellule 2. Gli studi sui fattori di trascrizione che regolano l&#39;eritropoiesi sono spesso eseguite utilizzando linee cellulari umane e murine che rappresentano, in qualche misura, le cellule eritroidi in fasi dato di differenziazione 3-5. Tuttavia le linee di cellule trasformate solo in parte imitare le cellule eritroidi e, soprattutto, non consentono di studiare comprensibile i cambiamenti dinamici che si verificano come un progresso cellule attraverso molte fasi verso il loro destino finale eritroide. Quindi, una sfida attuale rimane lo sviluppo di un protocollo per ottenere popolazioni di cellule staminali relativamente omogenea primarie e cellule eritroidi a vari stadi di differenziazione in quantità sufficienti per eseguire esperimenti di genomica e proteomica. Qui si descrive un ex vivo di cellule protocollo cultura di indurre differenziamento eritroide umane ematopoietiche da cellule staminali / progenitrici che sono state isolate dal sangue del cordone ombelicale sia, midollo osseo, o adulto sangue periferico mobilizzate con G-CSF (leucaferesi). Questo sistema di coltura, inizialmente sviluppato dal laboratorio Douay 6, utilizza citochine e co-coltura delle cellule mesenchimali per imitare il microambiente del midollo osseo. Usando questo protocollo differenziazione ex vivo, si osserva un forte amplificazione dei progenitori eritroidi, l&#39;induzione della differenziazione esclusivamente verso il lignaggio eritroide e una completa maturazione allo stadio di enucleato globuli rossi. Così, questo sistema offre l&#39;opportunità di studiare il meccanismo molecolare di regolazione trascrizionale come progresso cellule staminali ematopoietiche lungo la linea eritroide. Studiare l&#39;eritropoiesi a livello trascrizionale richiede anche la capacità di fattori specifici sovra-espresso o atterramento in cellule primarie eritroidi. A questo scopo, usiamo un lentivirus-mediata sistema di consegna gene che permette l&#39;infezione sia efficiente divisione e non divisione delle cellule 7. Qui mostriamo che siamo in grado di atterramento in modo efficiente il TAL1 fattore di trascrizione in cellule primarie umane eritroidi. Inoltre, l&#39;espressione della GFP dimostra un&#39;efficienza di infezione lentivirali vicino al 90%. Così, il nostro protocollo prevede un sistema molto utile per la caratterizzazione della rete di regolamentazione dei fattori di trascrizione che l&#39;eritropoiesi controllo.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protocollo per generare le cellule mature del sangue umano rossi da staminali ematopoietiche / progenitori è descritto. Inoltre descriviamo un efficiente lentivirale consegna metodo per atterramento TAL1 il fattore di trascrizione in cellule primarie eritroidi. L&#39;efficienza della consegna del gene mediato lentivirus è dimostrata utilizzando virus GFP che esprimono.

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

L'eritropoiesi è un sistema modello comunemente utilizzato per studiare la differenziazione cellulare. Durante l'eritropoiesi, le cellule staminali ematopoietiche umane adulte pluripotenti ...

L'obiettivo generale di questa procedura è differenziare cellule staminali ematopoietiche umane e cellule progenitrici lungo la linea eritroide e silenziare un particolare fattore di trascrizione durante l'eritropoiesi ex vivo. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto cellule staminali e progenitrici umane positive per CD34 da sangue del cordone, midollo osseo o sangue periferico mobilizzato con GCSF. Il secondo passaggio della procedura consiste nel differenziare queste cellule staminali ematopoietiche lungo la linea eritroide mediante una procedura di coltura cellulare in quattro fasi che combina citochine specifiche e una co-coltura su uno strato di cellule stromali per mimare il microambiente del midollo osseo.Successivamente, preparare le particelle virali lentivirali esprimenti una molecola HRNA contro il fattore di trascrizione di interesse, una molecola HRA randomizzata come controllo negativo e la proteina GFP per monitorare l'efficienza di infezione virale. L'ultima fase della procedura consiste nell'infettare le cellule eritroidi primarie umane in uno specifico stadio di differenziamento con le particelle lentivirali. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostr

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In questo video, dimostriamo un metodo per eseguire la trasduzione di vettori lentivirali shRNA per ottenere linee cellulari knockdown stabili in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche immortalizzate (iHSPC).

Knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in iHSPC in vitro: un sistema di espressione shRNA basato su lentivirus Consegna in iHSPC per il knockdown dell'espressione genica specifica

Vi presentiamo un mouse fetale sistema di coltura in vitro eritroblasto fegato che analizza le fasi precoce e tardiva dell'eritropoiesi terminale. Questo sistema facilita l'analisi funzionale di geni specifici in diversi stadi di sviluppo.

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

La manipolazione dell'espressione genica temporale nelle cellule staminali embrionali (ESC) differenzianti può essere ottenuta utilizzando sistemi genici inducibili. Tuttavia, la generazione di queste linee cellulari è costosa e richiede tempo. Questo protocollo consente di ottenere una rapida espressione di un transgene in cellule derivate da ES in differenziazione e la successiva analisi della differenziazione ematopoietica a valle.

L&#39;infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l&#39;analisi di differenziazione emopoietiche

Questo protocollo descrive l'efficiente induzione dell'endotelio emogenico e dei progenitori ematopoietici multipotenziali da cellule staminali pluripotenti umane attraverso l'espressione forzata di fattori di trascrizione.

Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane

Qui vi presentiamo il nostro protocollo per produzione indotta da progenitori eritroidi (iEPs) dai fibroblasti adulti del mouse utilizzando la trascrizione factor-driven diretto lignaggio riprogrammazione (DLR).

Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

Questo protocollo dimostra l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti dermici umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione GATA2, GFI1B e FOS per generare cellule staminali e progenitrici ematopoietiche.

Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

Qui forniamo un protocollo per lo screening di potenziali fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo di cellule dendritiche (DC) utilizzando la trasduzione lentivirale di shRNA per ottenere linee cellulari di knockdown stabili per la differenziazione DC in vitro .

Studio dello sviluppo delle cellule dendritiche mediante knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in una linea cellulare ematopoietica e progenitrice in vitro

Utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimina (PEI), abbiamo prodotto particelle lentivirali per l'espressione stabile di shRNA in cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) e cellule progenitrici neurali derivate da H9 trasdotte transitoriamente (NPC) ad alta efficienza.

Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

La modellizzazione dell'eritropoiesi fornisce una preziosa opportunità per comprendere il significato biologico degli attori in questo processo e per valutare nuovi approcci terapeutici che possono alleviare i difetti di differenziazione. Qui, descriviamo un metodo semplice e affidabile per differenziare in modo efficiente le cellule staminali ematopoietiche CD34+ e le cellule progenitrici ex vivo.

Una pipeline completa per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro ed ex vivo

Scopri il knockdown mediato da lentivirus del fattore di trascrizione TAL1 durante l'eritropoiesi ex vivo di cellule staminali emopoietiche umane CD34 positive. Questo metodo permette di studiare la regolazione genica nell'ematopoiesi.

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