Name: Il trapianto chirurgico di cellule staminali neurali del mouse nel midollo spinale di topi infettati con virus dellepatite neurotropi mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Scopri il trapianto di cellule staminali neurali nel midollo spinale di topi JHMV infetti per promuovere la rimielinizzazione. Questo metodo chirurgico consente di studiare terapie di sostituzione cellulare per malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla.

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1. Preparazione <ol><li> Preparare xylazina-ketamina soluzione (La ketamina è una sostanza controllata. Record dettagliato deve essere mantenuto e soluzioni custoditi in cassaforte, la posizione chiusa). </li><li> Pulire e sterilizzare attrezzature. </li><li> Preparare zona chirurgia strofinando con agente asettico e poi coprire con carta assorbente sterile, e impostare il micromanipolatore. </li></ol> 2. Preparazione di cellule per il trapianto <ol><li> Le cellule devono essere risospeso ad una concentrazione di 100.000 cellule / l É e, anche se solo 250.000 cellule vengono trapiantate per il mouse, un eccesso di cellule è necessaria per scopi di carico siringa (preparare almeno 300.000 cellule per topo riceve cellule). </li><li> Lavare le cellule da trapiantare 3 volte in HBSS in un flaconcino da 50 ml. Contare le celle prima della centrifuga finale. </li><li> Dopo la centrifuga finale verso il basso, e lasciare decantare HBSS flaconcino in posizione capovolta per evitare che le goccioline di raggiungere il pellet. </li><li> Pareti interne a secco con un UV-irradiato, Kimwipe sterile. Non lasciare che il pellet ad asciugare. </li><li> Tenendo il tubo in posizione verticale, molto lentamente e delicatamente risospendere le cellule in metà del volume finale desiderato HBSS. </li><li> Misurare il volume totale pipettando la maggioranza della sospensione in un puntale e quindi regolando la ghiera sulla pipetter fino a quando la sospensione intero la punta della pipetta. Questo vi dirà quanto più HBSS è necessario per la concentrazione desiderata. </li><li> Portare il volume al livello desiderato con l'aggiunta di HBSS. </li><li> Mettere di nuovo sul ghiaccio. Verificare la vitalità delle cellule, se essi devono essere in ghiaccio per più di 2 ore. </li></ol> 3. Preparazione di topi per la chirurgia e trapianti <ol><li> Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100mg/kg) e xilazina (10mg/kg) in circa 100 dosi microlitri o un equivalente anestetico. L'intera procedura di preparazione chirurgica di sutura richiederà 30-40 minuti. </li><li> (Opzionale: applicare numerate, nastri colorati per la coda di ogni mouse per garantire l'identificazione) </li><li> Radere l'area dorsale del mouse dalla parte bassa della schiena al collo, ed estendendo bilaterali 2 centimetri dalla linea mediana, con il tagliaunghie elettrici. I capelli devono essere tagliati il ​​più vicino possibile (può essere necessario andare oltre l'area più volte). </li><li> Per rimuovere i capelli rimanenti, applicare un sottile strato di crema depilazione (Nair) con una garza punta applicatore. </li><li> Dopo 1-2 minuti, pulire Nair con garza bagnate leggermente con acqua e sapone. L'area preparata deve essere pulita la pelle nuda, senza pezzi randagi di capelli che potrebbero entrare nella ferita nel corso della successiva procedura chirurgica. Sterilizzare l'area preparato con soluzione di ioduro. </li></ol> 4. Laminectomia <ol><li> Cambiano frequentemente e / o sterilizzare i guanti durante l'intera procedura. Posizionare il lato dorsale del mouse con la testa rivolta a sinistra (se siete di mano destra). Drappo animali per garantire la sterilità e che solo l'area rasata è esposto. Effettuare una incisione verticale (~ 1,3 centimetri) sopra il luogo laminecomy si estende da circa vertebre toraciche T8 a T12. </li><li> Con la pinza Graefe tenuto nella mano sinistra, fissare saldamente la colonna vertebrale a T9 (Figura 1A) e sollevare il mouse fino a esagerare la curvatura della spina dorsale. </li><li> Utilizzare il bisturi per segnare la giunzione tra T10 e T11, lo spazio tra le due sporgenze spinose. Ulteriori esporre il bivio con attenzione rottamazione strato di muscolo, allontanandosi per esporre l'osso (vedi Figura 1B, C). </li><li> Utilizzare le forbici per ulteriori muscolare chiara distanza dalla lamina ed intorno al peduncolo, con tagli di piccole dimensioni. Questo aprirà un piccolo spazio tra le vertebre. Lentamente e delicatamente inserire una lama delle forbici in questo divario e tagliare il peduncolo. Assicurarsi che la curvatura delle forbici è sempre posizionato lateralmente, lontano dal cordone ombelicale. Ripetere dall'altra parte. (Vedi Figura 1D, E) </li><li> Sollevare la lamina di esporre il cavo e con attenzione lo snip off. Assicurarsi di non lasciare frammenti ossei liberi o frastagliate dietro. (Vedi Figura 1F) </li><li> Prima dell'iniezione, pulire il sangue via con tamponi di cotone sterile. </li></ol> 5. L'iniezione di cellule <ol><li> Fissare l'ago con l'ago dado alla siringa Hamilton e pulirli da vampate di calore più volte con acqua, poi etanolo al 70% e, infine, HBSS. Inserire pistone dopo ogni riempire con acqua, etanolo al 70%, o HBSS. </li><li> Preparare la siringa Hamilton per il caricamento delle cellule, rimuovendo il pistone e allentando il dado di ago e tirando l'ago dalla siringa per evitare contropressione. Garantire che la movimentazione accurata dell'ago e il dado è fatto con i guanti sterili. </li><li> Carico 15μl di cellule in puntale e premere la punta saldamente l'estremità posteriore della siringa per caricare le cellule nella siringa. </li><li> Inserire lo stantuffo circa 5mm e poi serrare il dado ago. </li><li> Premere lo stantuffo ONUfinchè alcune delle sospensione cellulare viene visto uscire l'ago. </li><li> Assicurarsi che non vi siano bolle nella siringa e laici la siringa in posizione orizzontale per evitare che le cellule di fare un gradiente di gravità. </li><li> Prendete in mano il mouse laminectomized dal muscolo spinale dorsale che collega il spine di T8 e T9 (Figura 2B, C). </li><li> Bloccare il hemostat a sinistra (verticale) micromanipolatore braccio in modo che le zampe anteriori del mouse sono nell'aria e le sue zampe posteriori leggermente toccando una piattaforma di asciugamani di carta sterile come in Figure 2A e 2B. </li><li> Collegare la siringa al braccio destro micromanipolatore (ad un angolo di 70 °) e far scorrere la siringa nella posizione più bassa possibile, prima di serraggio. </li><li> Stabilizzare il mouse da appuntare la coda contro i tovaglioli di carta e abbassare lentamente la siringa (Figura 2B). </li><li> Abbassare l'ago verso il cavo e inserire l'ago nel 1 millimetro l'emisfero opposto attraverso la linea mediana dorsale (Figura 2C). La punta dell'ago deve essere nella materia grigia nei pressi del canale centrale. </li><li> Iniettare lentamente 2.5μl delle cellule. Iniettare ad un tasso di 1ml / 5 secondi. Dopo aver iniettato le cellule, attendere 10 secondi e ritrarre l'ago di un decimo di giro alla volta ogni 10 secondi fino a quando l'ago è fuori del cavo. Prestare attenzione alla possibile efflusso di sospensione cellulare. </li><li> Rapidamente ritrarre la siringa e staccarlo dal braccio micromanipolatore. Stendere la siringa in posizione orizzontale. </li><li> Rilasciare il mouse e trasferimento a tavola sutura. </li><li> Ripetere i passaggi 5,7-5,14 per ogni mouse fino a quando la siringa è vuota. Sterilizzare gli strumenti (nello sterilizzatore) e l'ago (strofinando con etanolo) tra gli animali. Eliminare le cellule e ricaricare se aggregazione è visibile. </li><li> Pulire la siringa come nel passaggio tra 5,1 carichi. </li></ol> 6. Suture e post-op cura <ol><li> Sutura l'incisione. Aghi per suture è inserito nella fascia superficiale su entrambi i lati dell'incisione. Il filo è teso attraverso, tirando fascia superficiale insieme (Figura 3A), coprendo così il midollo spinale esposta nel sito di lamina rimosso. Non sutura il muscolo cutaneo attaccate alla pelle o il muscolo scheletrico della schiena. Tirare il filo intero attraverso, lasciando circa 1 / 2 ". Utilizzando la porta aghi, tre nodi si formano e filo è tagliato più vicino possibile al nodo più possibile. </li><li> Chiudere l'incisione mediante l'applicazione di 2-3 punti (a seconda delle dimensioni di incisione) per la pelle (Figura 3B). Estrarre delicatamente la pelle di distanza dal mouse per evitare di pinzatura il muscolo sottostante. </li><li> Utilizzando un 26G3 / 8 ago iniettare 0,5 ml Ringer lattato sottocute nella parte bassa della schiena dalla incisione. </li><li> Posto del mouse indietro nella sua gabbia. Per assicurarsi che sia in grado di respirare confortevolmente mentre sotto anestesia, il mouse deve essere posizionato su un lato nella gabbia, evitando il contatto tra il sito chirurgico e biancheria da letto gabbia. Le gabbie dovrebbero essere immessi sul pad riscaldamento. </li><li> I topi sono monitorati dopo l'anestesia svanisce per assicurare il sanguinamento, suture rimangono chiuse, e che i topi tornare al pre-intervento mobilità. </li><li> Trattare i topi una volta con la buprenorfina analgesico (0,05-0,1 mg / kg) dopo l'intervento. </li><li> Garantire topi compromessa hanno sufficiente accesso al cibo e all'acqua: bottiglie d'acqua sono dotati di beccucci estese 3,5 pollici e topi che non sono in grado di camminare sono l'acqua a mano nutriti e / o ad alto contenuto calorico supplemento dietetico (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Risultati desiderati saranno riconoscibili dalla mancanza di efflusso di sospensione cellulare durante l'iniezione e dalla comparsa intatta del midollo spinale dopo la procedura. A tal fine, è fondamentale avere illuminazione brillante e diretta sul dorso del mouse durante la laminectomia e durante l'iniezione. Un'illuminazione ottimale è facilitato dalla fibra ottica di illuminazione (Figura 2A). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 - laminectomia (A) Una volta vertebra T9 è solidamente tenuto con la pinza Graefe, (B, C) ​​punteggio della colonna vertebrale con il bisturi tra le T10 e T11 per facilitare l'ingresso delle forbici micro.. (D) Far scorrere delicatamente le forbici micro attraverso lo spazio tra T10 e T11 (frecce e inserto, E) e tagliare i peduncoli su ogni lato (trattini, E) per liberare la lamina dorsale. (F) Capovolgere la lamina fino rostralmente e tagliarlo fuori. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Iniezione di NSC. (A) L'impostazione generale del micromanipolatore con il hemostat tenendo premuto il mouse collegato al braccio sinistro e la siringa Hamilton sul ​​braccio destro con un angolo di 70. (B) Il hemostat tenere il muscolo spinale dorsale collegare le spine di T8 e T9. (C) L'ago viene abbassato attraverso tlui linea mediana e nella materia grigia sull'emisfero opposto, in prossimità del canale centrale. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Suture e la chiusura della ferita. (A) Le suture vengono applicate alla fascia superficiale su entrambi i lati dell'incisione. (B) L'incisione viene chiusa con 2-3 punti in base alle esigenze (una graffetta mostrato una ferita che necessitano di 3).

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un trapianto ben eseguito dipenderà principalmente sulla laminectomia attenta e l&#39;iniezione delle cellule. L&#39;insidia principale per evitare nel corso di una laminectomia è il danneggiamento del midollo spinale. Questo può verificarsi durante la procedura stessa o da danni causati da frammenti ossei taglienti lasciati alle spalle dopo la procedura. Per evitare questi, in modo che le punte delle forbici curve micro sono sempre rivolta verso il cavo e esaminare attentamente la colonna vertebrale laminectomized per assicurare che tutti i frammenti ossei vengono cancellate e che i bordi della struttura rimanente vertebrali non hanno apertamente sporgenti o frastagliati. Come accennato in precedenza, la rilevazione di efflusso sarà possibile se la luce brilla e direttamente sul midollo spinale esposti durante l&#39;iniezione. Efflusso è più probabile che accada con 30 aghi calibro (contro 33 gauge) e se l&#39;iniezione viene fatta troppo rapidamente. Anche se questo protocollo ci ha dato buoni risultati, altri hanno riferito di attesa più lunghi periodi (fino a 5 minuti) prima di ritrarre l&#39;iniezione ago seguenti 8,9. Inoltre, aghi di calibro più piccolo sono preferibili, ma abbiamo osservato che alcune cellule sono troppo facilmente lisati quando passa attraverso 33 aghi di calibro. Per massimizzare l&#39;efficienza, un team di trapianto equipaggi delle quattro stazioni differenti (mouse preparazione, laminectomia, iniezione, e suture) è auspicabile. Inoltre, i tempi per ogni procedura deve essere ottimizzato per minimizzare il tempo le cellule sono in attesa su ghiaccio. Per esempio, abbiamo i nostri topi trapiantati in gruppi di quattro (il numero di dosi in ogni carico della siringa), la persona iniettando le cellule inizierà a caricare la siringa dopo il mouse terzo è stato laminectomized e la persona che prepara i topi dovrebbero anestetizzare le seguenti gruppo dopo il secondo mouse del gruppo precedente è stato laminectomized. In questo modo, siamo in grado di trapiantare cellule (o un supporto di controllo) in 40 topi in circa 3 ore, anche se ogni mouse avrà circa 30-40 min. Terapie di sostituzione cellulare per il trattamento di alcuni disturbi del SNC sono attualmente in sperimentazione clinica 10. Non vi è alcun sostituto per modelli in vivo di NSC trapianto e il nostro protocollo per l&#39;attecchimento delle NSCs nel midollo spinale di topi affetti da demielinizzazione virale indotta facilita l&#39;utilizzo di un importante modello di sclerosi multipla e può essere facilmente adattato ad altri modelli.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina cloridrato </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td>  10 microlitri Hamilton siringa w / rimovibile ago </td><td> Hamilton Azienda </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton Aghi, 30 G o 33 G, ½ pollici, 30 ° smusso </td><td> Hamilton Azienda </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Prova la vitalità delle cellule dopo il passaggio attraverso gli aghi per identificare il miglior indicatore da utilizzare </td></tr><tr><td> Micro forbici </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Piccolo Graefe Pinza </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modello 1772 Holder universale </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modello 1773 Electrode Holder </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modello 902 stereotassica di piccoli animali </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modello 960 vettore elettrodo sinistro </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer lattato </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Scienza multa </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Emostatica </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturi, dimensioni 10,11 </td><td> Pescatore </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> Dimensione 5-0, 3 / 8 &quot;cerchio, ago 19 mm, filo intrecciato 45 centimetri </td></tr><tr><td> Reflex 7 ferita applicatore Clip </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7 millimetri clip ferita Reflex </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar ago titolare </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

il trapianto chirurgico di cellule staminali neurali del mouse nel midollo spinale di topi infettati con virus dell&#39;epatite neurotropi mouse

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Topi infettati con il ceppo JHM neurotropica del virus dell&#39;epatite topo (MHV) sviluppare gli esiti patologici e clinici simili a pazienti con la malattia demielinizzante sclerosi multipla (SM). Abbiamo dimostrato che il trapianto di NSC nel midollo spinale di topi malati risultati in un miglioramento significativo in entrambi i rimielinizzazione e nel risultato clinico. Terapie di sostituzione cellulare per la cura di malattie croniche neurologiche sono ormai una realtà e in modelli in vivo sono di vitale importanza per comprendere le interazioni tra le cellule trapiantate e tessuti microambiente ospitante. Questa presentazione fornisce un metodo adatto per trapiantare le cellule nel midollo spinale di topi infettati JHMV. In breve, mettiamo a disposizione una procedura per i) preparazione di NSCs prima del trapianto, ii) pre-operatorio di topi, iii) l&#39;esposizione del midollo spinale tramite laminectomia, iv) l&#39;iniezione stereotassica di NSCs, e iv) assistenza post-operatoria .

Il trapianto di cellule staminali neurali del mouse (NSC) nel midollo spinale di topi con demielinizzazione stabilito è dettagliata. La preparazione del NSC, la laminectomia della vertebra toracica 9 (T9), e il trapianto di NSC si delinea con l&#39;assistenza pre-e post-operatoria dei topi.

Il trapianto chirurgico di cellule staminali neurali del mouse nel midollo spinale di topi infettati con virus dell&#39;epatite neurotropi mouse

I topi infettati dal ceppo neurotropo JHM del virus dell'epatite murina (MHV) sviluppano esiti patologici e clinici simili a quelli dei pazienti affetti da...

L'obiettivo generale di questa procedura è promuovere la rimielinizzazione e il miglioramento clinico in animali con demielinizzazione conclamata, mediante il trapianto di cellule staminali neurali nel midollo spinale di topi infettati da JHMV. Ciò viene ottenuto innanzitutto preparando l'animale. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eseguire una laminectomia a livello delle vertebre toraciche.Quindi, 10 cellule vengono iniettate nel midollo spinale esposto. Dopo un'iniezione riuscita, la ferita viene chiusa. Infine, la presenza di cellule staminali neurali di topo nel midollo spinale.Il parenchima può essere visualizzato mediante metodi come la microscopia fluorescente, la trapianto di cellule staminali neurali nel midollo spinale di JHMB. I topi infetti possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle terapie di sostituzione cellulare per il trattamento delle malattie demielinizzanti, ad esempio in che modo le cellule migrano, proliferano e si differenziano, e come influenzano il sistema nervoso centrale. E se possiamo modificare le cellule o l'ambiente del midollo spinale in cui vengono trapiantate per potenziarne gli effetti terapeutici.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla terapia con trapianto cellulare in un modello virale di demielinizzazione, può essere applicato anche ad altri modelli di demielinizzazione e lesione, come l'encefalomielite autoimmune sperimentale, EAE, e la lesione del midollo spinale. Prima di preparare le cellule per l'iniezione, preparare tutte le soluzioni necessarie. Successivamente, pulire e sterilizzare tutta l'apparecchiatura.Preparare l'area chirurgica e configurare il micromanipolatore per preparare le cellule per il trapianto, rimuovere gli occhi con tripsina e sospenderli in un contenitore conico da 50 millilitri. Lavare le cellule da trapiantare tre volte in HBSS. Contare le cellule prima dell'ultima centrifugazione.Dopo la centrifugazione finale, eliminare l'HBSS decantando e lasciare il vial in posizione capovolta per evitare che le gocce raggiungano il pellet. Asciugare le pareti interne con un fazzoletto Kim sterile irradiato a UV. Non permettere al pellet di asciugarsi.Tenere il tubo in posizione verticale lentamente e con molta delicatezza. Ri-sospendere le cellule nella metà del volume finale desiderato di HBSS. Alla fine, le cellule dovrebbero avere una concentrazione di 100.000 cellule per microlitro.Misurare il volume totale aspirando la sospensione in una punta di pipetta, quindi regolando la manopola della pipetta fino a quando l'intera sospensione non è all'interno della punta. Questo indicherà quanto ulteriore HBSS è necessario per raggiungere la concentrazione desiderata. Portare le cellule al volume desiderato.Aggiungendo HBSS. È possibile trasferire le cellule in una provetta eppendorf. Riporle nuovamente sul ghiaccio.Verificare la vitalità delle cellule se devono rimanere sul ghiaccio per più di due ore. Per iniziare la procedura chirurgica, verificare il corretto livello di anestesia mediante il riflesso alla pressione sulle dita dei piedi. Utilizzare un rasoio elettrico per rasare la regione dorsale del topo dalla parte bassa della schiena fino al collo.Dopo aver rasato l'area, applicare uno strato sottile di crema depilatoria per rimuovere eventuali peli residui. Dopo uno o due minuti, pulire l'area con garza asciutta e quindi con garza leggermente inumidita con acqua saponata. L'area chirurgica ora dovrebbe essere priva di peli.Infine, sterilizzare l'area preparata con soluzione di Betadine e applicare un unguento sugli occhi. Per evitare la secchezza, posizionare il topo in posizione supina. Eseguire un'incisione sul sito della laminectomia estendendola a partire dalle vertebre toraciche.T otto a T 11. Esagerare la curvatura della colonna vertebrale e individuare T 10. È la prima vertebra con un processo piatto ed è generalmente situata due vertebre a livello rostrale rispetto all'apice della curvatura della colonna vertebrale.Con la pinza grigia, fissare saldamente la colonna vertebrale. A T9, utilizzare un bisturi per incidere lo spazio tra le due protrusioni spinose di T10 e T11. Successivamente, raschiare via lo strato muscolare per esporre l'osso sottostante, assicurandosi che la curvatura delle forbici sia rivolta lontano dal midollo.Inserire lentamente una lama delle forbici tra T10 e T11. Far scivolare la lama tra il midollo spinale e il peduncolo di T10 e recidere il peduncolo. Ripetere sull'altro lato. Sollevare la lamina per esporre il midollo sottostante e reciderlo con attenzione.Assicurarsi di non lasciare frammenti ossei liberi o frastagliati. Una volta rimossi tutti i frammenti ossei, rimuovere qualsiasi traccia di sangue con bastoncini di cotone sterili. Preparare innanzitutto la siringa Hamilton montando l'ago con il dado di fissaggio.Inserire lo stantuffo e sciacquare diverse volte con acqua. Pulire una volta con etanolo al 70% e HBSS. Rimuovere lo stantuffo e allentare il dado dell'ago.Allontanare l'ago dalla siringa per evitare una pressione inversa. Quando si caricano le cellule, inserire 15 microlitri di cellule nella siringa premendo saldamente la punta della pipetta sul fondo della siringa. Inserire lo stantuffo di circa cinque millimetri e quindi stringere il dado dell'ago.Premere lo stantuffo fino a quando parte della sospensione cellulare non esce dall'ago. Assicurarsi che non ci siano bolle nella siringa e posizionare la siringa orizzontalmente per evitare che le cellule formino un gradiente per effetto della gravità. Tornando all'animale, utilizzare pinze emostatiche per afferrare il muscolo doci spinoso S.Collegare le spine di T otto e T nove. Fissare l'emostato al braccio del micromanipolatore sinistro in modo che le zampe anteriori del topo siano sollevate da terra e le zampe posteriori tocchino leggermente una piattaforma di salviette di carta sterili.Collegare la siringa al braccio destro del micromanipolatore con un angolo di 70 gradi e far scorrere la siringa nella posizione più bassa possibile prima di fissarla. Stabilizzare il topo bloccandone la coda contro gli asciugamani di carta. Abbassare lentamente l'ago verso il cordone.Inserire la punta di un millimetro nell'emisfero opposto attraverso la linea mediana dorsale. La punta dell'ago deve trovarsi nella sostanza grigia o nelle sue immediate vicinanze, ma non nel canale centrale. Iniettare lentamente 2,5 microlitri di cellule a un ritmo di un microlitro ogni cinque secondi.Dopo aver iniettato le cellule, attendere 10 secondi ed estrarre l'ago. Un decimo di giro. Estrarre a questo ritmo ogni 10 secondi fino a quando l'ago non è completamente fuori dal cordone.Iniettare le cellule troppo velocemente o rimuovere l'ago troppo in fretta potrebbe causare il flusso della sospensione cellulare. In tal caso, scartare il topo dallo studio. Una volta rimosso dal cordone, ritirare rapidamente l'ago e staccare la siringa dal braccio del manipolatore microscopico.Di nuovo, posizionandolo in orizzontale. Rilasciare il pulsante del mouse e trasferirlo su un tavolo per sutura. Ripetere questa procedura per ogni topo fino a quando la siringa non è vuota.Scartare le cellule e ricaricare se si osserva aggregazione, eseguendo il lavaggio e la pulizia della siringa tra un caricamento e l'altro. Dopo l'iniezione, l'animale viene trasferito in un'area separata per essere suturato. Passare l'ago da sutura attraverso la fascia superficiale su entrambi i lati dell'incisione.Tirare il punto di sutura per avvicinare la fascia e coprire il midollo spinale esposto nel sito della lamina rimossa. Utilizzare un portaanelli con pinzetta per fare tre nodi e tagliare via il filo il più possibile. Un punto di sutura è solitamente sufficiente mentre si tira via la pelle dal topo.Per evitare di puntare il muscolo sottostante, chiudere l'incisione con due o tre punti metallici. Una volta chiusa la ferita, iniettare 0,5 millilitri di soluzione di Ringer lattato per via sottocutanea nella parte bassa della schiena, ma lontano dall'incisione. Posizionare il topo su un fianco nella gabbia, assicurandosi che la zona dell'intervento chirurgico non entri in contatto con la lettiera della gabbia.Monitorare gli animali fino al completo recupero. Questa immagine mostra cellule staminali neurali di topo marcate con GFP trapiantate con successo in una sezione coronale del midollo spinale. 21 giorni dopo il trapianto.Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara di come trapiantare cellule staminali neurali nel midollo spinale di topi infettati da JHMV. Una volta padroneggiata la tecnica, è possibile eseguirla su 40 topi in circa tre ore.

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