Name: Test di screening per Stress Ossidativo in una linea felina cella astrociti, G355-5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Impara a valutare lo stress ossidativo negli astrociti utilizzando il marcatore fluorescente CM-H2DCFDA e la citometria a flusso. Questo metodo quantitativo aiuta a studiare la neuroprotezione nel sistema nervoso centrale.

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Ringraziamo Prodotti ReadiSorb per il loro generoso sostegno di questi studi.

1. Colture cellulari di astrociti felino e il trattamento con H 2 O 2 <ol><li> Linea cellulare cultura G355-5 in un centimetro 75 2 pallone con i media DMEM più nutrienti a 37 ° C e 5% di CO 2 fino al 60% confluenti (~ 5 giorni). Sostituire i media ogni 1-2 giorni o secondo necessità per mantenere una sana cultura. </li><li> Rimuovere i supporti e aggiungere 2 ml di tripsina 0,25%. Sollevare le cellule pipettando per 45 s - 1 minuti a temperatura ambiente (RT). </li><li> Trasferire rapidamente la sospensione in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di media. Mescolare delicatamente. </li><li> Centrifugare a 300 xg, 23 ° C per 3 minuti per ottenere un pellet. Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 6-7 ml di mezzi freschi e risospendere le cellule. </li><li> Aggiungi ~ 1 ml di cellule in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere 2-3 ml di media per ciascun pozzetto e incubare fino al 80-90% confluenti. </li><li> Preparare una soluzione 100μM di perossido (H 2 O 2) in media. </li><li> Rimuovere i supporti di ogni bene e sostituirlo con 2 ml di mezzi freschi (di controllo), 2 ml di H 2 O 2 (trattamento) o 2 ml di DPBS. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 3 ore </li><li> Rimuovere soluzioni e aggiungere 1 ml di tripsina per sollevare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta da 1,7 ml Eppendorf contenente 0,5 ml DPBS. Questa operazione deve essere eseguita su ogni bene singolarmente al fine di prevenire la morte cellulare di incubazione tripsina prolungato. </li><li> Spin a 300 xg per 3 minuti, scartare il surnatante e risospendere in 1 ml di DPBS. </li></ol> 2. Colorazione per ROS <ol><li> Tutti i passaggi per la colorazione deve essere effettuata con un minimo l'esposizione alla luce per evitare l'imbiancamento. </li><li> Aggiungere 1 ml di 50 mM CCCP per il controllo positivo. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 5 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di 10 mm CM-H 2 soluzione DCFDA per l'H 2 O 2 gruppi. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 15-30 min. Nessuna macchia è aggiunto al campione salina. </li><li> Lavare i campioni con 2 ml di DPBS per rimuovere macchie residue. </li><li> Spin a 300 xg per 3 minuti per ottenere un pellet. </li><li> Risospendere le cellule in 0,5 ml di DPBS. Aggiungere 1 PI microlitri di ciascun campione, ad eccezione della soluzione salina. </li><li> Trasferire i campioni in una provetta da 5 ml citofluorimetro. </li><li> Esegui il citofluorimetro. </li></ol> 3. Citometria a flusso <ol><li> Esegui campioni su un Beckman Coulter FC500 (o equivalente) dotato di un laser ad argon 488 nm e la passa banda seguenti: 525, 775 e 620 nm, tutti ± 20 nm. </li><li> Preparare i controlli del caso: le cellule senza macchia, CM-H 2 DCFDA colorato solo, solo PI, macchiato doppio (controllo negativo). </li><li> Fai un protocollo che ha il histoplots seguenti: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Si dovrebbero inoltre avere la istogrammi seguenti: numero di cellulare vs FL1, FL2 e FL3, che corrisponde alle macchie. </li><li> Prima di eseguire i campioni, controllare le attrezzature, fluidi e contenitore per rifiuti. Riscaldare il materiale per almeno 20 min. </li><li> Pulire le attrezzature e effettuare una calibrazione con le perline appropriato secondo le norme produttori. </li><li> Selezionare il protocollo ed eseguire gli esempi. </li><li> Pulire l'apparecchiatura come fatto in precedenza. </li><li> Pulire la linea del vuoto secondo le norme produttori. </li><li> Spegnere il flusso e pulire la testina / vuoto linea. </li><li> Disattivare il software e il computer. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Risultati di citometria a flusso sono stati analizzati utilizzando FlowJo 7.6 e controlli macchia sono stati utilizzati per impostare oggettivamente gating. Sulla base di questo, le cellule sane appaiono sulla sinistra dell'istogramma e ROS (stress ossidativo) è stato rilevato come uno spostamento di celle a destra. La Figura 1 mostra i risultati degli effetti del perossido di idrogeno a salutare astrociti felino. I dati di FL1 è stato utilizzato per misurare l'intensità di CM-H 2 DCFDA, che indica la presenza di ROS. Come previsto, una maggiore quantità di ROS è stata rilevata nel campione trattato con H 2 O 2. Questo viene visualizzato l'istogramma come un cambiamento di intensità fluorescente da sinistra a destra. Quando si confrontano le cellule sane trattate con DMEM contro DPBS, non c'era nessun cambiamento significativo nella quantità di ROS (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Citometria a flusso risultati dei livelli di stress ossidativo in soggetti sani astrociti felino e l'effetto di H 2 O 2 sulle cellule sane. I risultati indicano che H 2 O 2 aumenta i livelli di ROS nelle cellule sane rispetto alle cellule con nessun trattamento (DMEM). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Citometria a flusso risultati dei livelli di ROS rilevato nelle cellule sane incubate per 3 ore con DPBS.

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Un meccanismo spesso suggerito di virus danno neuronale indotto è lo stress ossidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. In sostanza, si propone che attraverso l&#39;esposizione virale della glia (astrociti e microglia) radicali rilasciano ossigeno reattive come, idrossido, anione superossido, ossido nitrico, e / o perossido di idrogeno, che sono tossici per i neuroni. Allo stesso modo, lo stress ossidativo è stato anche suggerito come un importante meccanismo patologico in metanfetamine neurotossicità i...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Cellgro </td><td> 25-020-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Hyclone </td><td> 17-605E </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Non amminoacidi essenziali </td><td> Hyclone </td><td> 25-025-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 20% (v / v) </td></tr><tr><td> Aminoacidi essenziali </td><td> Cellgro </td><td> 25-030-cl </td><td> 0,2% (v / v) </td></tr><tr><td> 500ml vuoto sistema di filtrazione </td><td> VWR </td><td> 87006-076 </td><td></td></tr><tr><td> Provette da 15 ml </td><td> Falco </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 75 centimetri due colture di tessuti fiaschi </td><td> Falco </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> 6 e piastra di coltura dei tessuti </td><td> Falco </td><td> 353224 </td><td></td></tr><tr><td> CM-H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C6827 </td><td></td></tr><tr><td> Propidio ioduro (PI) </td><td> Sigma </td><td> P4170-10mg </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Lonza </td><td> 17-160F </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O 2 </td><td> Sigma </td><td> H6520 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ antibiotici </td><td> Hyclone </td><td> SV30079.01 </td><td> 0,1% (v / v) </td></tr><tr><td> G355-5 cellule </td><td> ATCC </td><td> CRL-2033 </td><td> Normale cervello felino </td></tr></tbody></table>

test di screening per stress ossidativo in una linea felina cella astrociti, g355-5

Screening Assay for Oxidative Stress in a Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

Un meccanismo spesso suggerito di virus danno neuronale indotto è lo stress ossidativo. Astrociti svolgono un ruolo importante nel controllo dello stress ossidativo del Sistema Nervoso Centrale (SNC). Astrociti aiutare a mantenere un ambiente omeostatico per i neuroni così come proteggere i neuroni da specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS). CM-H2DCFDA è una cellula-permeabile indicatore per la presenza di ROS. CM-H 2 DCFDA entra nella cellula come un non-fluorescenti composte, e diventa fluorescente dopo esterasi cellulari rimuovere i gruppi di acetato, e il composto viene ossidato. Il numero di cellule, misurato mediante citometria di flusso, che si trovano ad essere fluorescente verde è l&#39;indicazione del numero di cellule che sono in uno stato ossidativo. CM-H 2 DCFDA è suscettibile di ossidazione da un gran numero di differenti ROS. Questa mancanza di specificità, per i quali ROS possono ossidare CM-H 2 DCFDA, rende questo composto un reggente prezioso per l&#39;utilizzo nelle prime fasi di un&#39;indagine patogenesi, in quanto questo test può essere usato per individuare un ambiente ossidativo cellulare, indipendentemente da quale ossigeno radicale o la combinazione di ROS sono responsabili per le condizioni di cellulare. Una volta stabilito che i ROS sono presenti dall&#39;ossidazione di CM-H 2 DCFDA, poi ulteriori esperimenti possono essere eseguiti per determinare quale ROS o combinazione di Ross sono coinvolti nel processo di patogenesi particolare. I risultati di questo studio dimostrano che con l&#39;aggiunta di perossido di idrogeno, un aumento della CM-H 2 DCFDA fluorescenza è stato rilevato rispetto ai controlli salina, indicando che questo test è un test importante per la rilevazione di un ambiente ossidativo all&#39;interno G355-5 celle, un felina linea cellulare astrociti.

Un metodo di screening per individuare gli ambienti ossidativo cellulare è quello di misurare l&#39;ossidazione delle CM-H2DCFDA. Una volta ossidato all&#39;interno di una cella di CM-H2DCFDA cambiamenti da non fluorescente in un composto fluorescente. Questo cambiamento di fluorescenza viene misurata mediante citometria di flusso e indica il numero di cellule in un ambiente ossidativo.

Test di screening per Stress Ossidativo in una linea felina cella astrociti, G355-5

Un meccanismo spesso suggerito per il danno neuronale indotto dai virus è lo stress ossidativo. Gli astrociti svolgono un ruolo importante nel controllare lo stress ossidativo di...

Gli astrociti hanno un ruolo importante nel controllo dello stress ossidativo del sistema nervoso centrale, contribuendo a mantenere un ambiente omeostatico per i neuroni e proteggendo i neuroni dalle specie reattive dell'ossigeno. In questo articolo viene presentato un metodo per dosare lo stress ossidativo negli astrociti. Per illustrare il funzionamento di questo dosaggio, viene applicato agli astrociti felini il perossido di idrogeno e le specie reattive dell'ossigeno tipicamente prodotte durante il metabolismo cellulare.Per le specie reattive dell'ossigeno, viene aggiunto alle cellule l'indicatore permeabile alle cellule CMH 2D CFDA. Il CMH 2D CFDA entra nella cellula come composto non fluorescente, dove le esterasi cellulari rimuovono i gruppi acetato. Se sono presenti specie reattive dell'ossigeno, il composto viene ossidato e diventa fluorescente.Le cellule vengono quindi raccolte e la fluorescenza viene analizzata mediante citometria a flusso. Il numero di cellule fluorescenti indica il numero di cellule in stato ossidativo. L'obiettivo, ovviamente, è individuare quali radicali liberi dell'ossigeno specifici siano presenti nelle cellule utilizzando diversi approcci.Questo

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Questo video descrive la tecnica di visualizzazione dello stress ossidativo in organoidi coltivati. Questo lavoro aiuta a comprendere il livello di stress ossidativo dovuto all'accumulo di ROS nei vari tipi di cellule presenti in un organoide dopo il trattamento con diversi modulatori di ROS.

Saggio di imaging con sonda fluorescente: una tecnica per visualizzare lo stress ossidativo nelle cellule organoidi intestinali in coltura trattate con induttore di specie reattive dell'ossigeno

Questo video dimostra la valutazione della salute mitocondriale negli astrociti geneticamente modificati, che esprimono una proteina fluorescente all'interno dei loro mitocondri. La proteina aiuta a tenere traccia dei cambiamenti nella salute mitocondriale quando la sua fluorescenza cambia da verde a rossa, indicando stress o danni. Le immagini vengono acquisite e analizzate utilizzando vari parametri.

Monitoraggio basato sulla fluorescenza dello stress mitocondriale negli astrociti

Ictus ischemico è un evento complesso in cui il contributo specifico degli astrociti nella regione colpite del cervello esposto alla privazione di ossigeno glucosio (OGD) è difficile da studiare. Questo articolo introduce una metodologia per ottenere gli astrociti isolati e studiare la loro reattività e la proliferazione in condizioni OGD.

Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione in Vitro in condizioni ischemiche-come

Questo manoscritto descrive l'uso di reporters fluorogenic geneticamente codificati in un'applicazione di imaging di cellule vive per l'esame dello stress ossidativo indotto da xenobiotici. Questo approccio sperimentale offre ineguagliabile risoluzione spazio-temporale, sensibilità e specificità, evitando molte delle lacune dei metodi convenzionali utilizzati per la rilevazione dello sforzo ossidativo tossicologico.

Approcci alla valutazione dello Stress ossidativo tossicologici utilizzando geneticamente codificato Fluorogenic sensori di imaging

Presentiamo un protocollo per lo sviluppo e l'uso di un modello di stress ossidativo trattando le cellule epiteliali pigmentate retiniche con H2O2, analizzando la morfologia cellulare, la vitalità, la densità, il glutatione e il livello di UCP-2. È un modello utile per studiare l'effetto antiossidante delle proteine secrete dalle cellule trasfettate con trasposone per trattare la degenerazione neuroretinica.

Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

Sulla base di esperimenti in vitro , questo studio ha rivelato il meccanismo della crocetina nel riparare il danno da stress ossidativo dei cardiomiociti influenzando la mitofagia, in cui la via di segnalazione PINK1 / Parkin svolge un ruolo importante.

Protezione delle cellule miocardiche H9c2 dallo stress ossidativo mediante Crocetina tramite la mitofagia mediata dalla via PINK1/Parkin

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari utilizzando il diidroetidio (DHE) come sonda colorante a fluorescenza utilizzando un approccio di screening ad alto rendimento. Il protocollo descrive i metodi per la valutazione quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari nelle tre diverse linee cellulari di carcinoma epatocellulare.

Valutazione dello screening ad alto rendimento della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) utilizzando il colorante a fluorescenza diidroetidio (DHE)

La quantificazione delle forme ossidate e ridotte di glutatione (GSSG e GSH, rispettivamente) è stata ottenuta attraverso l'uso dell'orto-ftalaldeide (OPA). L'OPA diventa altamente fluorescente una volta coniugato al GSH, ma non è in grado di coniugare il GSSG fino a quando non viene ridotto. Qui, descriviamo un saggio multiparametrico per quantificare entrambi utilizzando la quantificazione delle proteine per la normalizzazione.

Quantificazione rapida di forme ossidate e ridotte di glutatione utilizzando l'orto-ftalaldeide in cellule di mammifero in coltura in vitro

Qui descriviamo un protocollo che facilita la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in astrociti funzionali specifici per il proencefalo. Ciò consente di studiare il ruolo delle cellule gliali nella patogenesi dei disturbi dello sviluppo neurologico, come la sindrome dell'X fragile, e di modellare altri disturbi cerebrali.

Generazione e caratterizzazione di astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane prive di ribonucleoproteina messaggero X fragile

Questo protocollo video viene illustrato un nuovo metodo per la generazione e la successiva purificazione delle cellule progenitrici neuronali da una fonte rinnovabile di cellule staminali neuronali (NSC) sulla base della loro fisico (granularità e dimensione interna) e proprietà di fluorescenza usando citometria di flusso tecnologia.

Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Impara a valutare lo stress ossidativo negli astrociti utilizzando il marcatore fluorescente CM-H2DCFDA e la citometria a flusso. Questo metodo quantitativo aiuta a studiare la neuroprotezione nel sistema nervoso centrale.

Test di screening per Stress Ossidativo in una linea felina cella astrociti, G355-5

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