Name: Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Scopri come eseguire screening competitivi di librerie di lievito con codice a barre per analizzare interazioni gene-farmaco. Questo metodo automatizzato utilizza Candida albicans per identificare mutanti sensibili in modo ad alta portata.

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Ringraziamo Ron Davis, Adam Deutschbauer, e l&#39;intero laboratorio HIP HOP presso l&#39;Università di Toronto per le discussioni e consigli. NC è sostenuto da finanziamenti della National Human Genome Research Institute (Grant Numero HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, e Canadian Cancer Society (# 020380). JO è stato sostenuto dal Programma di Stanford Formazione Genoma (Grant Numero T32 HG00044 dal National Human Genome Research Institute) e il National Institutes of Health (Grant Numero P01 GH000205). GG è supportato dal RO1 NHGRI HG003317 e la Canadian Cancer Society, Grant # 020380, TD e il Donnelly Sequencing Center è sostenuto in parte da finanziamenti della Fondazione canadese per l&#39;innovazione di Drs. Brenda e Jack Andrews Greenblatt. AMS è supportato da una borsa di studio dell&#39;Università di Toronto Open.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui, abbiamo delineato un protocollo che, con modeste modifiche, può essere facilmente adattato ad una vasta gamma di collezioni esistenti di codici a barre collezioni mutante di microrganismi diversi per creare tag collezioni mutante. Sottolineiamo che, mentre noi abbiamo riportato un protocollo di mutagenesi trasposone tag per i patogeni lievito C. albicans, un protocollo molto simile potrebbe essere adattato ad una grande varietà di funghi unicellulari. Modificato, questo protocollo funziona bene nei batteri 13, e attualmente collezioni per una serie di ulteriori genomi fungini e batterici sono in costruzione. Al momento, questo test fornisce l&#39;unica completa, genome-wide a schermo imparziali per gene-piccole interazioni molecola. Una caratteristica particolarmente interessante del saggio è che nessuna conoscenza preliminare del gene o piccola molecola è richiesto. Nonostante la portata e la potenza di questi test, la loro trasferibilità in altri laboratori è stato ostacolato in qualche modo con l&#39;investimento di capitale iniziale e gli strumenti informatici per l&#39;analisi dei risultati. Con l&#39;adozione di una lettura prossima sequenza di generazione combinata con strumenti affidabili per l&#39;analisi, ci aspettiamo che la loro adozione ad aumentare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiotici </td><td> Vendor e catalogo numeri </td></tr><tr><td> Carbenicillina </td><td> Sigma, parte # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Sigma, parte # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomicina </td><td> Sigma, parte # S0692 </td></tr><tr><td> Cloramfenicolo </td><td> Sigma, parte # C0378 </td></tr><tr><td> DNA di pulizia e kit di concentrazione </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, parte # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Kit Maxi plasmidi </td><td> Qiagen, parte # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, parte # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, parte # 28704 </td></tr><tr><td> PCR e reagenti elettroforesi </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi (Mg-free) Buffer </td><td> New England Biolabs, parte # M0320L </td></tr><tr><td> Soluzione Mix desossinucleotide </td><td> New England Biolabs, parte # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, parte # 63036 </td></tr><tr><td> Agarosio, carico colorante e acido nucleico macchia adatto per elettroforesi su gel </td><td> Vari </td></tr><tr><td> 10X tampone TAE </td><td> Sigma, parte # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Inoltre DNA Ladder </td><td> Invitrogen, parte # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD brodo </td><td></td></tr><tr><td> 10 g di estratto di lievito </td><td> Sigma, parte # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto peptone </td><td> BD Biosciences, parte # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g di destrosio </td><td> Sigma, parte # D9434 </td></tr><tr><td> Da laboratorio </td><td></td></tr><tr><td> Pipette multicanale (1000, 200, e 20 mL) </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Monouso serbatoi pipettaggio </td><td> Vari </td></tr><tr><td> 15 e 50 provette ml </td><td> Vari </td></tr><tr><td> 96 - e pozzetti 384-pozzo profondo </td><td> Axygen Scientifico, parte # P-2ML-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-bene e 384 pozzetti PCR e film di tenuta </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Rullo di lamiera per la sigillatura a più pozzetti </td><td> Sigma, parte # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C e 37 ° C agitando incubatori per la crescita di batteri e lieviti su piastre e tubi </td><td> Vari </td></tr><tr><td> In vitro trasposone mutagenesi </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 trasposasi </td><td> Biotecnologie Epicentre, parte # TNP92110 </td></tr><tr><td> High-throughput trasformazione </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Prep Kit plasmidi </td><td> Bordo Biosystems, parte # 84359 </td></tr><tr><td> polietilene glicole, peso molecolare 3350 </td><td> Vari </td></tr><tr><td> acetato di litio </td><td> Sigma, parte # 517992 </td></tr><tr><td> 6-pozzetti, sterile </td><td> Corning, parte # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml uridina </td><td> Sigma, parte # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA soluzione tampone </td><td> Sigma, parte # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Vari </td></tr><tr><td> salmone testicolo DNA </td><td> Sigma, parte # 1626 </td></tr><tr><td> La crescita delle collezioni barcode </td><td></td></tr><tr><td> 48-pozzetti, qualora la crescita culture in lastre </td><td> Greiner, parte # M9437 </td></tr><tr><td> Sigillante adesivo </td><td> ABgene, parte # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 mL cultura fiaschi </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Spettrofotometro in grado di assorbanza </td><td> Vari </td></tr><tr><td> A temperatura controllata shaker per 250 ml o palloni spettrofotometro agitazione </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Safe-Lock provetta, 2 ml </td><td> Eppendorf, parte # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Ibridazione attrezzature </td><td></td></tr><tr><td> Ibridazione Forno 640 </td><td> Affymetrix, parte # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip fluidico Stazione 450 </td><td> Affymetrix, parte # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, parte # 00-0212 </td></tr><tr><td> Bagno di acqua bollente con cremagliera galleggiante </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Ibridazione di consumo </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag 16K Array v2 </td><td> Affymetrix, parte # 511331 </td></tr><tr><td> Soluzione Denhardt, il concentrato di 50X </td><td> Sigma, parte # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidina, R-ficoeritrina coniugato (SAPE) </td><td> Invitrogen, parte # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock provetta, 0,5 ml </td><td> Eppendorf, parte # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversificato Biotech, parte # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, parte # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, parte # T2700 </td></tr><tr><td> MES monoidrato acido libero </td><td> Sigma, parte # M5287 </td></tr><tr><td> MES sale di sodio </td><td> Sigma, parte # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, parte # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, parte # S2015 </td></tr><tr><td> Biologia molecolare acqua grado </td><td> Sigma, parte # W4502 </td></tr><tr><td> Ibridazione Primer </td><td> Vari fornitori (dissalazione di serie) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotina-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotina-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotina-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Sequencing Primer: Piattaforma Illumina </td><td> Vari fornitori </td></tr><tr><td> UpTag Avanti (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT CCT CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Avanti (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT CCT CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Leggi 1 UP-tag seguenti primer (100um) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leggi 1 GIU-tag Primer seq (100um) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leggi 2 Primer Sequencing Index (standard Illumina fondo R1) (100um) </td><td> 5 &#39;AC ATTO CTT CCT CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Reagenti Sequencing Ulteriori / attrezzature </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF Kit di purificazione PCR </td><td> Qiagen, parte # 29051 </td></tr><tr><td> Pompa del vuoto </td><td> Qualsiasi fornitore </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vacuum Manifold </td><td> Macherey-Nagel, parte # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, parte # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit saggio tubi </td><td> Invitrogen, parte # Q32856 </td></tr><tr><td> Acrilamide 40% più 1% di N, N&#39;-metilene-bis-acrilamide, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, part # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, parte # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Acido borico </td><td> Sigma, parte # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, parte # E0306 </td></tr><tr><td> Ammonio persolfato </td><td> Sigma, parte # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, parte # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Bromuro di etidio Soluzione </td><td> Bioshop, parte # ETB444.10 </td></tr><tr><td> Ammonio acetato 0.5M </td><td> Teknova, parte # A2000 </td></tr><tr><td> 10mM acetato di magnesio tetraidrato </td><td> Sigma, parte # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Vedi 0.5M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Di sodio acetato, pH 5,2 </td><td> Teknova, parte # S0297 </td></tr><tr><td> Velocità a vuoto </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Leggi singolo cluster Kit Generation </td><td> Illumina, parte # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36 quater Sequencing Kit v4 </td><td>Illumina, parte # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> TBE ricetta 10X <table border="1"><tbody><tr><td> Importi </td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> 108 grammi </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 grammi </td><td> Acido borico </td></tr><tr><td> 40ml </td><td> 0.5M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungi dH 2 O a 1L marchio </td></tr></tbody></table> 12% di poliacrilammide ricetta gel <table border="1"><tbody><tr><td> Volumi </td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> Acrilamide 40% più 1% di N, N&#39;-metilene-bis-acrilamide, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> TBE 10X </td></tr><tr><td> 140 microlitri </td><td> Persolfato di ammonio 10% </td></tr><tr><td> Volume totale: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag mix di fondo: Risospendere Uptag e Buptagkanmx4 ciascuno in DDH 2 O a 100 micron, quindi mescolare in un rapporto di 1:1 per una concentrazione finale di 50 micron ciascuna. Conservare a -20 ° C. Downtag mix di fondo: Risospendere Dntag e Bdntagkanmx4 ciascuno in DDH 2 O a 100 micron, quindi mescolare in un rapporto di 1:1 per una concentrazione finale di 50 micron ciascuna. Conservare a -20 ° C. Oligonucleotidi mista: Risospendere ciascuna delle seguenti otto oligos (standard dissalate) in DDH 2 O a 100 mM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Mescolare un volume equivalente di otto oligonucleotidi per una concentrazione finale di 12,5 mM ciascuno. 12X MES magazzino: Per 10 ml, sciogliere 0,7 g monoidrato acido libero MES e 1,93 g di sale di sodio MES in 8 acqua biologia molecolare grado ml. Dopo aver mescolato bene, controllare il pH e regolare, se necessario, a pH 6,5-6,7. Aggiungere acqua per un volume totale di 10 ml. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce (ad esempio, avvolgere il tubo in alluminio). Sostituire se visibilmente soluzione diventa gialla o dopo 6 mesi. Ibridazione tampone 2X: Per 50 ml, miscelare 8,3 ml di 12X MES magazzino (dal 2.9.14), 17,7 ml di 5 M NaCl, 4,0 ml di 0.5 M EDTA, 0,1 ml di 10% di Tween 20 (vol / vol), e 19,9 ml di filtrato DDH 2 O. Filtro sterilizzare. Lavare A: Mescolare 300 ml 20X SSPE, 1 ml di Tween 10% (vol / vol), 699 ml di DDH 2 O. Filtro sterilizzare. Lavare B: Mescolare 150 ml 20X SSPE, 1 ml di Tween 10% (vol / vol), 849 ml di DDH 2 O. Filtro sterilizzare. Codice a barre sequenza primer In UP-tag sequenze primer 5 &#39;coda (in grassetto) sono Illumina sequenze specifico adattatore incorporato nel fondo F e R. La sequenza variabile (corsivo) rappresenta il 5-mer tag di indicizzazione utilizzato in multiplexing / index read-out. Coda di 3 &#39;(sottolineato) rappresenta l&#39;innesco comune che fiancheggiano il codice a barre uptag ed è necessario per amplificare i codici a barre lievito. In GIU-tag Primer sequenze 5 &#39;coda è identico a 5&#39; coda di UP-tag primer (Illumina sequenza specifica), tuttavia, il 3 &#39;coda (sottolineato), è sostituito con il primer comuni che vengono utilizzati per amplificare il DOWN- tag codici a barre.

schermi competitivo genomica delle biblioteche di lievito con codice a barre

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

In virtù dei progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, abbiamo accesso alle sequenze del genoma nuovo quasi ogni giorno. Il tempo di questi progressi sta accelerando, promettendo una maggiore profondità e ampiezza. Alla luce di questi progressi straordinari, la necessità di una rapida, metodi paralleli per definire la funzione del gene diventa sempre più importante. Collezioni di genome-wide mutanti di delezione in lieviti ed E. coli sono serviti come cavalli da tiro per la caratterizzazione funzionale della funzione del gene, ma questo approccio non è scalabile, attuale gene-cancellazione approcci richiedono ciascuno delle migliaia di geni che costituiscono il genoma da eliminare e verificato. Solo dopo questo lavoro è completo possiamo perseguire high-throughput fenotipizzazione. Negli ultimi dieci anni, il nostro laboratorio ha perfezionato un portafoglio di competitivo, miniaturizzati, ad alta produttività genome-wide test che possono essere eseguite in parallelo. Questo parallelizzazione è possibile perché l&#39;inclusione dei &#39;tag&#39; del DNA, o &#39;codici a barre,&#39; in ogni mutante, con il codice a barre che funge da proxy per la mutazione e si può misurare l&#39;abbondanza di codici a barre per valutare idoneità mutante. In questo studio, cerchiamo di colmare il divario tra sequenza del DNA e codice a barre collezioni di mutanti. Per fare questo introduciamo un combinato trasposone interruzione-codici a barre approccio che apre saggi di codici a barre parallele di nuova sequenza, ma poco caratterizzato microbi. Per illustrare questo approccio vi presentiamo una nuova collezione di Candida albicans interruzione codice a barre e di descrivere come sia microarray-based e sequenziamento di nuova generazione basati su piattaforme possono essere utilizzate per raccogliere 10.000 - 1.000.000 gene-gene e le interazioni farmaco-gene in un singolo esperimento.

Abbiamo sviluppato completa, imparziale genoma schermate per capire gene-farmaco e interazioni gene-ambiente. Metodi per lo screening queste collezioni mutanti sono presentati.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

Grazie ai progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, abbiamo accesso a nuove sequenze genomiche quasi quotidianamente. Il ritmo di questi progressi è...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare collezioni di microrganismi con marcatori genomici per comprendere le interazioni tra geni e farmaci e tra geni e ambiente in modo altamente parallelo. Questo risultato si ottiene esaminando la collezione di microrganismi per cinque a venti generazioni di crescita in presenza di un farmaco, utilizzando robotica per mantenere le cellule in crescita esponenziale. Come secondo passaggio, le cellule vengono raccolte, consentendoci di estrarre il DNA genomico da 4.000 a 6.000 individui contemporaneamente.I prodotti PCR successivi, costituiti dai codici a barre amplificati, vengono quantificati mediante ibridazione su microarray o sequenziamento dei codici a barre, al fine di quantificare i codici stessi e determinare così l'abbondanza di ciascun ceppo in un pool complesso. Alla fine, si ottengono risultati che mostrano quali mutanti con codice a barre risultano sensibili ai trattamenti e vengono quindi eliminati dal pool nel corso dell'esperimento. Il principale vantaggio della tecnica che analizzeremo oggi consiste nel fatto che, invece di lavorare con ceppi singoli come colonie su piastre o colture liquide individuali, possiamo analizzare decine o centinaia di migliaia di ceppi diversi raggruppati in un unico pool.Una volta resa evidente la potenza di questo saggio, abbiamo dovuto automatizzarlo; fortunatamente, lavoravo presso il centro tecnologico del genoma di Stanford, circondato da ingegneri che mi hanno permesso di raggiungere questo obiettivo. A illustrare il protocollo oggi sarà Andrew Smith, uno studente dottorando senior del mio laboratorio, che illustrerà tutti i protocolli e le procedure associate, insieme a Tanya Durick, che ci mostrerà come eseguire le fasi di sequenziamento del protocollo. Questo protocollo utilizza una libreria di mutanti di Candida albicans generati mediante mutagenesi mediata da trasposone, in cui ciascun mutante porta un marcatore a codice a barre che consente di combinare singoli mutanti in un unico pool. Una copia della libreria viene replicata su 3 84.Piastre a pozzetti contenenti mezzo di coltura vengono utilizzate per far crescere le colonie a 30 gradi Celsius per due o tre giorni, fino al raggiungimento della dimensione massima. Successivamente, operando in un ambiente di microbiologia con fiamma e materiali sterili, inondare ogni piastra con cinque-dieci millilitri di mezzo di coltura e lasciare in ammollo per cinque minuti. Successivamente, sospendere le colonie con un’ansa di spalmatura e versare il liquido insieme alle cellule in un tubo conico da 50 millilitri per centrifuga.Aggiungere DMSO al 7%. Regolare le cellule a una concentrazione finale di OD 600 pari a 50 per millilitro con mezzo contenente DMSO al 7%, quindi aliquotare volumi di 40 microlitri in provette a strip per PCR; gli aliquote di cellule raggruppati possono essere conservati indefinitamente a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, scongelare gli aliquote di cellule raggruppate sul ghiaccio, quindi diluire immediatamente e delicatamente il pool in mezzo contenente un farmaco o una condizione scelta, inoculando a un OD 600 di 0.0625 in un volume totale di 700 microlitri per pozzetto in una piastra a 48 pozzetti. Ai fini di questo video, verranno preparate tre ripetizioni di due condizioni.Includere almeno un controllo con solvente appropriato nella piastra. Sigillare la piastra con un sigillo di plastica, coltivare le cellule in un spettrofotometro o in un agitatore a temperatura controllata a 30 gradi Celsius, utilizzando un regime di agitazione determinato sperimentalmente. Ad esempio, agitare per 14 minuti, leggere le pozzette per un minuto, quindi riprendere l'agitazione.Una parte della sospensione cellulare può essere raccolta dal robot e conservata su una piastra in carbone situata sul deck robotico. Ai punti temporali di generazione definiti dall'utente, tipicamente a 5, 10, 15 e 20 generazioni di crescita, raccogliere almeno due od 600 di cellule per ogni campione e punto temporale.Trasferire i campioni cellulari raccolti in provette microcentrifuga con chiusura di sicurezza. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per l'estrazione del DNA genomico, che verrà mostrata successivamente per iniziare questa procedura. DNA genomico purificato da cellule raccolte in diversi punti temporali con un kit per lieviti.Secondo le istruzioni del produttore, con una modifica, eluire il DNA con 300 microlitri di 0,1 XTE. Successivamente, preparare due reazioni PCR per ogni campione: una per i marcatori UPT e una per i marcatori down.Analizzare i prodotti PCR risultanti su un gel. È previsto un prodotto di 60 paia di basi per entrambe le PCR negli ampliconi utilizzati per l'ibridazione, come mostrato nelle corsie uno e tre. In questo esempio, è previsto un prodotto di 130 paia di basi negli ampliconi per il sequenziamento del codice a barre, come mostrato nelle corsie cinque e sette.A questo punto, i prodotti di PCR possono essere utilizzati per l'analisi con microarray o per il sequenziamento diretto del codice a barre, a seconda del prodotto di PCR generato. Per prepararsi all'analisi con microarray, preriscaldare il forno di ibridazione a 42 gradi Celsius e preparare un bagnomaria in ebollizione e un secchiello con ghiaccio contenente una sospensione di acqua e ghiaccio. Inumidire preventivamente gli array riempiendoli lentamente con 120 microlitri di ibridizzazione tampone 1x.Incubare le matrici nel buffer di ibridazione a 42 gradi Celsius e 20 giri al minuto per 10 minuti; mentre le matrici sono in incubazione, preparare provette con tappo a vite da 0,5 millilitri contenenti 120 microlitri di ibridazione. Mescolare per ogni campione più uno in eccesso come tampone aggiunto a ciascuna provetta. Aggiungere 30 microlitri di PCR per il tag di uptake e 30 microlitri di PCR per il tag di down al mix di ibridazione, per un volume totale di 150 microlitri.Bollire per due minuti e porre in acqua ghiacciata per almeno due minuti. Centrifugare brevemente i tubi prima dell'uso. Rimuovere il buffer di pre-ibridazione dagli array e aggiungere 120 microlitri di mix di ibridazione PCR per prevenire l'evaporazione.Coprire le guarnizioni dell'array con un tampone resistente, ibridare per 16 ore a 42 gradi Celsius e 20 giri al minuto. Rimuovere gli array dal forno di ibridazione ed eliminare i tamponi resistenti dai chip. Rimuovere lentamente la miscela di ibridazione dagli array mediante pipetta e riempire gli array.Con 120 microlitri di soluzione di lavaggio, caricare le matrici nel lavatore della stazione fluidica preparata. Il lavaggio delle matrici verrà eseguito utilizzando il protocollo gene Flex SV 3 4 50 con le seguenti modifiche: un passaggio aggiuntivo con wash A prima della colorazione.Lavare B, temperatura di 42 gradi Celsius anziché 40 gradi Celsius e colorazione a 42 gradi Celsius sulla stazione fluidica invece che a 25 gradi Celsius. Dopo le operazioni fluidiche, eseguire la stazione fluidica, arrestare il protocollo quattro 50. Scaricare il lavatore dopo aver verificato l'assenza di bolle d'aria.Posizionare le matrici nel lettore e scansionare a una lunghezza d'onda di emissione di 560 nanometri. Il prodotto PCR di 130 paia di basi viene utilizzato per il sequenziamento del codice a barre di nuova generazione al fine di separare inizialmente 12 campioni di DNA in un gel PAGE al 12%. Successivamente, colorare il gel con cyber green e ritagliare la banda del gel di interesse.Il DNA estratto dal gel viene quindi quantificato mediante PCR in tempo reale per generare cluster su una flow cell a lettura singola utilizzando il CBOT e il kit di generazione di cluster a lettura singola. Caricare la flow cell nel sequenziatore e osservare la prima base rilasciata. Il sequenziatore mostrato qui è un esempio rappresentativo. I dati raccolti in determinati punti del protocollo.Il pool di mutanti marcati è stato coltivato per 20 generazioni in presenza dell'agente antifungino clotrimazolo e in DMSO come controllo; è stato calcolato e riportato il rapporto logaritmico in base due per ogni gene. Tutti i ceppi che risultano significativamente sensibili al trattamento con clotrimazolo, con un rapporto logaritmico in base due pari a due, sono evidenziati in rosso. In questo esempio sono mostrati quattro ceppi: NCP uno, ERG due e due alleli indipendenti di ERG 11.Il noto bersaglio proteico del farmaco antimicotico clotrimazolo, identificato come sensibile in uno schermo in pool, dovrebbe essere verificato per quanto riguarda la sua sensibilità in saggi individuali di crescita in presenza della stessa concentrazione del farmaco. Questo grafico successivo mostra i risultati di un esperimento di conferma. Le quattro ceppi identificati nello schermo hanno mostrato una crescita ridotta rispetto al ceppo parentale di tipo selvatico.BWP 17 indicato in nero. Queste curve di crescita individuali mettono in evidenza un aspetto importante di questi screening genetici su farmaci in pool, ovvero che il rango assoluto di un ceppo particolare non riflette necessariamente il suo grado esatto di sensibilità. Inoltre, i risultati mostrano l'importanza di disporre di più alleli per ogni gene.In questo caso, i due mutanti con interruzione di ERG 11 presentano sensibilità leggermente diverse al farmaco. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in cinque giorni, dalla semina del saggio fino all'analisi dei dati, se eseguita correttamente. Pertanto, sebbene ogni singolo esperimento fornisca informazioni biologiche significative, la vera potenza si ottiene quando sono stati effettuati numerosi esperimenti e raccolto un database che consenta ora di prevedere la funzione genica e l'azione dei farmaci.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare collezioni di mutanti con marcatori a barre su scala genomica per lo screening in pool, e anche di come utilizzare microray o sequenziamento per identificare i geni di interesse dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della genomica funzionale di esplorare la funzione di ciascuno dei 6.000 diversi geni presenti nel genoma del lievito.

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