Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging
19 agosto 2011
Il fattore limitante l'uso degli adulti Drosophila per studiare neurodegenerazione e biologia cellulare è l'imaging difficile dei processi intracellulari. Descriviamo la dissezione dei singoli ommatidi per generare una buona fede colture primarie di cellule neuronali, che possono essere soggetti a trattamento farmacologico e di imaging avanzate.
L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare e ottenere immagini di singoli esemplari di drosophila o matia per studiare eventi intracellulari nei modelli di neurodegenerazione. Questo viene ottenuto innanzitutto staccando la testa della mosca dal resto del corpo e aprendola con un taglio.
Successivamente, il cervello e altri tessuti vengono rimossi dall'interno della testa. Il cuticolo viene quindi eliminato e ogni retina viene tagliata a metà. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'asportare l'O con un ago di tungsteno e depositarli su un vetrino.
In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano organelli autofagici citoplasmatici mediante microscopia confocale a fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi biologica cellulare ad alta risoluzione in modelli di drosophila per la neurodegenerazione, campo in cui fino ad ora erano possibili soltanto approfondimenti di tipo genetico, dimostrando che la procedura sarà variabile. Uno studente laureato del mio laboratorio, con l'aiuto di Daniel Mackay, tecnico di istologia e microscopia del centro.
Per iniziare, riempire una pozzetta di un vetrino in vetro a tre pozzette con soluzione salina tamponata al fosfato, quindi anestetizzare le mosche con anidride carbonica. Una volta anestetizzate le mosche, prelevarne una singola utilizzando pinzette e immergerla nel piccolo contenitore di PBS. Sotto un microscopio stereoscopico, afferrare il probo con le pinzette e quindi staccare la testa dal corpo recidendo il collo.
Utilizzando un secondo paio di pinzette che trattiene la testa della mosca dal probo, tagliare la testa in due lungo la linea mediana laterale con forbici microchirurgiche. Per esporre il cervello, utilizzare la punta di una pipetta tagliata per prelevare la testa insieme alla retina e trasferirla in un altro pozzetto riempito con mezzo Schneider. Rimuovere con le pinzette la maggior parte della cuticola della testa, quindi estrarre il cervello.
Mantenere la retina posizionata tra la lamina e la cornea. Successivamente, trasferire la retina in una goccia di 50 microlitri di mezzo Schneider fresco. Posizionata direttamente su un vetrino, afferrare con una pinzetta, utilizzando forbici microchirurgiche, l'estremità più dorsale o ventrale della retina.
Tagliare la retina a metà lungo la linea mediana dorso-ventrale per esporre l'AMIA al centro dell'occhio. Continuare a tenere la retina in modo che la cornea sia rivolta verso il basso e la lamina sia rivolta verso l'alto. Utilizzando un ago fine di tungsteno, staccare prima l'oia dalla lamina e poi dalla cornea.
Una singola OIA e gruppi di OIA si raccoglieranno sul fondo della pozzetta o del vetrino. Rimuovere eventuali aggregati più grandi formatisi prima di procedere. Per analizzare l'autofagia, diluire il tracciante Lito in rapporto 1:1000 in una goccia di mezzo Schneider, mescolare e attendere 10 secondi.
Rimuovere il liquido in eccesso dal vetrino, avendo cura di lasciare l'AMIA. Aggiungere una goccia di vector shield per coprire l'amia.
Applicare un coprioggetto e sigillare con smalto per unghie; mediante microscopia confocale, sia i fagosomi marcati con g fp a TG otto che i lisosomi marcati da lyo Tracker possono essere visualizzati in un singolo tedium isolato da una mosca che esprime una forma mutante di atropina. Il pannello in campo chiaro in alto a destra mostra la struttura quasi integra del tedium, e la cornice indica l'area scansionata. Qui, il rosso indica i lisosomi e il verde indica l'autofagosoma.
Le autofagosomi, che derivano dalla fusione dei due organelli, appaiono gialli. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la coltura di campioni e la somministrazione di farmaci per rispondere a diverse domande, ad esempio identificare i composti efficaci sui marcatori dell'autofagia nelle cellule neuronali di diversi background genetici.
Combinare i vantaggi della genetica di drosophila con alcune avanzate analisi biologiche cellulari possibili nella coltura cellulare.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una procedura per dissezionare e ottenere immagini di singoli ommatidi di Drosophila al fine di studiare eventi intracellulari in modelli di neurodegenerazione. Il metodo consente la generazione di colture cellulari neuronali primarie che possono essere sottoposte a trattamento farmacologico e a tecniche avanzate di imaging.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Neurodegenerazione
Sfondo
- L'analisi mediante imaging dei processi intracellulari nei Drosophila adulti è impegnativa.
- La dissezione di singoli ommatidi fornisce una soluzione per lo studio dei meccanismi cellulari.
- Le colture primarie di neuroni permettono trattamenti farmacologici e analisi mediante imaging avanzato.
- Questo approccio migliora la comprensione dei processi di neurodegenerazione.
Scopo dello studio
- Dissezionare gli ommatidi di Drosophila per l'analisi cellulare.
- Facilitare l'acquisizione di immagini di eventi intracellulari.
- Creare una piattaforma per studi di trattamento farmacologico.
Metodi Utilizzati
- Attacca la testa della mosca e aprila.
- Rimuovi il cervello e altri tessuti interni.
- Dopo aver rimosso la cuticola, taglia la retina a metà.
- Asporta gli ommatidi con un ago di tungsteno e depositali su un vetrino.
Risultati principali
- Dissezione riuscita di singoli ommatidi.
- Creazione di colture cellulari neuronali primarie autentiche.
- Capacità di eseguire trattamenti farmacologici su cellule in coltura.
- Tecniche di imaging avanzate applicate per lo studio di processi intracellulari.
Conclusioni
- Il metodo fornisce uno strumento prezioso per lo studio della neurodegenerazione.
- La dissezione di singoli ommatidi migliora le capacità di imaging cellulare.
- Questo approccio può portare a nuove intuizioni in neurobiologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La dissezione e l'analisi di un singolo ommatidio in Drosophila permettono un'analisi ad alta risoluzione di eventi intracellulari rilevanti per la neurodegenerazione, superando i limiti dell'autofluorescenza dell'occhio intero. Questa tecnica supporta la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta, consentendo la visualizzazione diretta dei processi autofagici e delle risposte ai farmaci in cellule neuronali geneticamente definite. La sua adattabilità all'analisi in tempo reale e alla somministrazione di composti ne fa una piattaforma riutilizzabile per i flussi di ricerca sulla neurodegenerazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi diretta dell'autofagia e del traffico intracellulare in cellule neuronali rilevanti per le malattie.
- Consente la validazione funzionale di target visualizzando le risposte subcellulari a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici distinguendo gli effetti cellula-autonomi in contesti genetici mosaic.
Screening e sviluppo di saggi
- Fornisce un sistema validato ex vivo per l'analisi quantitativa mediante imaging di marcatori autofagici e lisosomiali.
- Permette la preparazione riproducibile di campioni monocellulari per test standardizzati su composti.
- Consente la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per lo screening di agenti modificanti la neurodegenerazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i percorsi rilevanti per la malattia modellando la disfunzione autofagica in un sistema geneticamente modificabile.
- Permette una continuità dalla scoperta genetica alla valutazione preclinica di composti in cellule neuronali.
- Supporta un avanzamento basato sul rischio fornendo letture cellulari predittive per i bersagli della neurodegenerazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, consentendo test basati su ipotesi sui meccanismi intracellulari e sugli effetti dei composti in un contesto neuronale geneticamente definito.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di autofagia e neurodegenerazione in singoli ommatidi.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili di imaging per la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni basate sulla microscopia confocale di autofagosomi, lisosomi e dei loro prodotti di fusione.
- Ricerca Translazionale: Facilita l'allineamento tra fenotipi cellulari e modelli di malattia, nonché lo sviluppo di biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Offre una piattaforma modulare adattabile a diverse basi genetiche e librerie di composti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e negli studi meccanicistici della neurodegenerazione.
- Valore operativo: Standardizza i protocolli di dissezione e di imaging a singola cellula per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze cellulari dirette dell'interazione con l'obiettivo e dell'efficacia del composto.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli e dei candidati terapeutici nella neurodegenerazione in base a un'analisi del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di Drosophila e nelle tecniche di microscopia confocale.
- Necessita dell'accesso a microscopia a fluorescenza e infrastrutture per la coltura cellulare.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per la preparazione dei campioni e i protocolli di acquisizione delle immagini.
- Adattabile a diversi background genetici mediante l'uso di tecniche di analisi mosaicale.
- Limitato all'analisi ex vivo; potrebbe essere necessaria una validazione in vivo per garantire continuità traslazionale.
