Name: Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Impara a dissecare singoli ommatidi di Drosophila per studiare eventi intracellulari nella neurodegenerazione. Questo metodo consente di generare colture neuronali primarie per trattamenti farmacologici e imaging avanzato.

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Ringraziamo Bernard Charroux per le discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dalla Scuola LKC biomedica.

1. Dissezione della retina Drosophila <ol><li> Riempire un pozzo di un 3-Bene vetrino con tampone fosfato (PBS 1X), e poi anestetizzare vola da CO 2. Sia i maschi che le femmine possono essere utilizzati per questo esperimento. </li><li> Una volta che le mosche sono anestetizzati, prendere una mosca con pinze e inseritelo nel piccolo piatto di PBS. </li><li> In un ambito di dissezione, pizzicare la proboscide con una pinza, e poi staccare la testa dal corpo eliminando il collo con una seconda serie di pinze. </li><li> Tenendo la testa vola dalla proboscide, tagliata a metà lungo la linea mediana a sinistra / destra della testa volare con microscissors per rivelare il cervello. </li><li> Utilizzare un puntale tagliato a raccogliere la retina, e trasferirli in un secondo pozzo della 3-Bene vetrino di vetro pieni di medio Schneider. </li><li> In primo luogo, buccia via la maggior parte della cuticola testa e poi rimuovere il cervello con una pinza. Mantenere la retina a sandwich tra la lamina e la cornea. </li><li> Poi, il trasferimento della retina su una goccia (50 ml) di media Schnieder fresca posizionato direttamente del vetrino. </li></ol> 2. Dissezione del ommatidi <ol><li> A seconda dello scopo finale della dissezione (sia immagini immediato o la cultura) e l'ottica del microscopio a fluorescenza (diretta o invertita), questo passaggio può avvenire sia su un vetrino o in una 24-pozzetti. Per lo scopo finale di questa dissezione, il ommatidi verrà sezionato direttamente sul vetrino. </li><li> Afferrare una delle estremità più dorsale o ventrale della retina con una pinza. Utilizzando microscissors, tagliare la retina a metà lungo la linea mediana dorsale / ventrale per esporre la ommatidi al centro dell'occhio. </li><li> Continua a cogliere la retina in modo che la cornea è rivolto verso il basso e la lamina è rivolto verso l'alto. Utilizzando un ago di tungsteno fine, staccare il ommatidi dalla lamina e la cornea. </li><li> Singoli ommatidi e gruppi di ommatidi raccoglierà sul fondo del pozzo o diapositiva. Rimuovere eventuali residui che potrebbero essere più grandi raccolte prima di procedere. </li></ol> 3. Trattamento, colorazione e di imaging <ol><li> Per analizzare l'autofagia, diluire 1:1000 Lysotracker nel menu Schneider (prima diluita 1:10 in Schneider e poi aggiungere 0,5 microlitri alla goccia sul vetrino), mescolare e attendere 10 secondi. </li><li> Togliere il liquido in eccesso dalla diapositiva, facendo attenzione a lasciarsi alle spalle ommatidi. Questo viene fatto meglio con una punta fine caricamento del gel. </li><li> Aggiungere una goccia di Vectashield per coprire il ommatidi, applicare un vetrino coprioggetti e sigillare con nailpolish. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: La buona esecuzione del protocollo dovrebbe lasciare un numero di ommatidi singoli e di piccoli gruppi di ommatidi tenuti insieme da frammenti di lamina ma ben separati dal lato della cornea. Questi possono essere ripreso come in questo esempio per visualizzare Atg8: GFP e Lysotracker, mostrando autophagosomes, lisosomi e autophagolysosomes (Fig. 3). Il metodo può essere utilizzato per l'imaging dal vivo, però in questo caso è da notare che autofluorescenza di media di Schneider renderà difficile distinguere i segnali a bassa intensità fluorescente. Un ulteriore problema è che i granuli di pigmento che rimangono attaccati ai fotorecettori sono intensamente fluorescenti, soprattutto nel canale rosso. Una foto brightfield può essere richiesto per distinguerli dagli organelli genuina. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di dissezione di ottenere ommatidi singoli o piccoli gruppi di ommatidi dalla retina volare. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Eventuali variazioni del semplice protocollo qui descritto che coinvolgono la genetica e l'invecchiamento volare a monte della dissezione e colorazione o coltura per un massimo di 24 ore ed a valle della droga amministrazione della dissezione. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 scansione confocale di autophagosomes e lisosomi in un singolo ommatidium sezionato da aw; GMR-GAL4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP:.: Atg8 / + volo, esprimendo un poliglutamine Atrophin mutante e dai 12 giorni a 29 ° C. Il pannello di campo chiaro (in alto a destra) mostra la struttura quasi intatta della ommatidium e la cornice indica l'area acquisita. Segni rossi lisosomi, il verde autophagosomes, auto-lisosomi, risultante dalla fusione dei due organelli, di colore giallo. Le frecce indicano due eventi di fusione in corso tra autophagosomes e lisosomi.

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li>
<li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li>
<li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li>
<li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La dissezione ommatidium singolo presentato qui permette la raccolta di informazioni delle cellule più profonde sui processi biologici come la neurodegenerazione, quando modellato negli occhi Drosophila. I neuroni dei fotorecettori sono più facilmente accessibili di altri neuroni e citoplasma è particolarmente grande, e quindi adatto per studiare la dinamica delle vescicole, nelle cellule stesse utilizzate proficuamente in molti modelli di quantificare neurodegenerazione in vivo. L&#39;aspetto critico ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Dispenser portatile di CO2 </td><td> Flystuff </td><td> 59-150 </td><td> Ricariche disponibili </td></tr><tr><td> DUMONT Tweezer n. 5 </td><td> AGAR scientifico </td><td> T5034 </td><td></td></tr><tr><td> 3-Bene vetrino </td><td> SME </td><td> 71561-01 </td><td></td></tr><tr><td> Micro forbici </td><td> VWR </td><td> HAMMHSB516-09 </td><td></td></tr><tr><td> Media Schneider </td><td> VWR </td><td> 733-1663 </td><td></td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost diapositive </td><td> VWR </td><td> 631-0108 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield con DAPI </td><td> Vector Labs </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> VWR </td><td> 631-1336 </td><td></td></tr></tbody></table>

singolo drosophila ommatidium dissection e imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

La mosca della frutta Drosophila melanogaster ha dato un contributo inestimabile alla ricerca neuroscientifica ed è stato ampiamente utilizzato come modello per le malattie neurodegenerative a causa della sua potente genetica 1. L&#39;occhio vola in particolare è stato l&#39;organo di scelta per la ricerca neurodegenerazione, essendo la parte più accessibile e di vita indispensabili del sistema nervoso Drosophila. Ma l&#39;avvertimento principale degli occhi intatto è la difficoltà, a causa della intensa autofluorescenza del pigmento, in eventi di imaging intracellulari, come autofagia dinamica 2, che sono di primaria importanza per la comprensione della neurodegenerazione. Recentemente abbiamo usato la dissezione e la cultura dei singoli ommatidi 3 che è stato essenziale per la comprensione delle disfunzioni autofagici in un modello di volo Dentatorubro-Pallidoluysian Atrofia (DRPLA) 3, 4. Ora segnalare una descrizione completa di questa tecnica (Fig. 1), adattato da studi elettrofisiologici 5, che rischia di ampliare notevolmente la possibilità di modelli di volo per neurodegenerazione. Questo metodo può essere adattato a vivere immagine eventi subcellulare e per monitorare la somministrazione efficace farmaco su cellule fotorecettrici (Fig. 2). Se usato in combinazione con tecniche di mosaico 6-8, le risposte di cellule geneticamente diverse possono essere analizzati in parallelo (Fig. 2).

Il fattore limitante l&#39;uso degli adulti<em&gt; Drosophila</emOcchio&gt; per studiare neurodegenerazione e biologia cellulare è l&#39;imaging difficile dei processi intracellulari. Descriviamo la dissezione dei singoli ommatidi per generare una buona fede colture primarie di cellule neuronali, che possono essere soggetti a trattamento farmacologico e di imaging avanzate.

Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging

La mosca della frutta Drosophila melanogaster ha fornito contributi inestimabili alla ricerca nelle neuroscienze ed è stata ampiamente utilizzata come modello per le malattie neurodegenerative...

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare e ottenere immagini di singoli esemplari di drosophila o matia per studiare eventi intracellulari nei modelli di neurodegenerazione. Questo viene ottenuto innanzitutto staccando la testa della mosca dal resto del corpo e aprendola con un taglio.Successivamente, il cervello e altri tessuti vengono rimossi dall'interno della testa. Il cuticolo viene quindi eliminato e ogni retina viene tagliata a metà. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'asportare l'O con un ago di tungsteno e depositarli su un vetrino.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano organelli autofagici citoplasmatici mediante microscopia confocale a fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi biologica cellulare ad alta risoluzione in modelli di drosophila per la neurodegenerazione, campo in cui fino ad ora erano possibili soltanto approfondimenti di tipo genetico, dimostrando che la procedura sarà variabile. Uno studente laureato del mio laboratorio, con l'aiuto di Daniel Mackay, tecnico di istologia e microscopia del centro.Per iniziare, riempire una pozzetta di un vetrino in vetro a tre pozzette c

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Il metodo di imaging verticale descritto in questo protocollo consente la visualizzazione dettagliata dei poli di un uovo di Drosophila melanogaster in via di sviluppo.  Questa visione finale fornisce una nuova prospettiva sulle disposizioni e le morfologie di più tipi di cellule nell'epitelio follicolare.

Imaging Upright di<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambers Egg

L'ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Questo protocollo è progettato per l'imaging e l'analisi delle dinamiche dell'orientamento cellulare e della crescita dei tessuti nell'epitelio addominale della Drosophila mentre la mosca della frutta subisce la metamorfosi. La metodologia qui descritta può essere applicata allo studio di diverse fasi di sviluppo, tessuti e strutture subcellulari nella Drosophila o in altri organismi modello.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Presentati qui sono i metodi dettagliati per la dissezione e la colorazione delle goccioline lipidiche degli ovociti nelle larve di Drosophila utilizzando BODIPY 493/503, un colorante fluorescente specifico per gocciolaiole lipidiche.

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Viene presentato un protocollo che consente la visualizzazione di Drosophila melanogaster intatto in qualsiasi fase dello sviluppo utilizzando la tomografia microincisa.

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Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

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In Drosophila, il nucleo dell'ovocita subisce una migrazione microtubule-dipendente durante l'oogenesi. Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per seguire la migrazione eseguendo l'imaging dal vivo su camere di uova ex-vivo. La nostra procedura mantiene in vita le camere delle uova per 12 ore per acquisire filmati time-lapse 3D multi-posizione utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

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