Name: Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Impara a sviluppare aptameri RNA anti-HIV gp120 con alta affinità mediante SELEX su filtro nitrocellulosa. Questo metodo consente la consegna mirata di siRNA per terapie antiretrovirali innovative.

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Ringraziamo Britta Hoehn, Guihua Sole, Harris Soifer e Lisa Scherer per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health AI29329 e HL07470 assegnato a JJR I seguenti reagenti sono stati ottenuti attraverso la ricerca e l&#39;AIDS NIH reagente Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: La CHO-EE e CHO-gp160 cellulare linea, il pNL4-3 luc vettoriale; HIV-1 BAL gp120 da DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R e JZ hanno richiesto il brevetto per &quot;Cell-tipo specifico aptamer-siRNA sistema di consegna per l&#39;HIV-1 terapia&quot;. USPTO, n.<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, Data di pubblicazione: 11 giugno 2009.

Aptameri sono evoluti in vitro degli acidi nucleici che assumono specifiche e stabili forme tridimensionali, fornendo in tal modo altamente specifico, legame stretto di molecole mirate 8. La bassa affinità nanomolare legame e specificità squisita aptameri ai loro obiettivi li rendono strumenti versatili per la diagnostica, imaging in vivo, e terapie 9. Con l&#39;avvento della tecnologia per la consegna aptamer siRNA mirate è ora possibile utilizzare la funzione aptamer vincolante ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> MF-Millipore membrana del filtro </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Dimensione dei pori 0,45 micron </td></tr><tr><td> Swinnex portafiltro </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 millimetri di diametro </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> Purificazione del DNA </td></tr><tr><td> Microcontrollore YM-30 colonna </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA concentrazione </td></tr><tr><td> Bio-spin 30 colonne </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA purificazione </td></tr><tr><td> PCR Taq DNA polimerasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe Kit di trascrizione T7 </td><td> Epicentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP per PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Acido ribonucleico, trasferimento da E.coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA concorrente </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L proteina gp120 </td><td> la ricerca AIDS e reagente Reference Program </td><td> 4961 </td><td> Proteina bersaglio </td></tr><tr><td> Silenziatore etichettatura kit siRNA - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Acido fenolo / cloroformio 5 / 1 soluzione (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformio / isopropanolo 24 / 1 soluzione </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Vitello fosfatasi intestinali (CIP) </td><td> New England BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4 chinasi polinucleotide </td><td> New England BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glicogeno </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA precipitazioni </td></tr><tr><td> Gamma-P 32-ATP </td><td> MP Biomedica </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> Nazionale di diagnostica </td><td> CE-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Nazionale di diagnostica </td><td> CE-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Di ammonio persolfato (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI media 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio, 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Minimo Medium (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM non essenziali aminoacido (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA clonazione kit con pCR 2,1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di cell-tipo specifico anti-hiv gp120 aptameri per la consegna di sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

L&#39;epidemia globale di infezione da HIV ha creato un urgente bisogno di nuove classi di farmaci antiretrovirali. La capacità potente di small interfering (si) RNA di inibire l&#39;espressione di trascrizioni di RNA complementare viene sfruttato come una nuova classe di terapie per una varietà di malattie tra cui l&#39;HIV. Molti rapporti precedenti hanno dimostrato che nuove strategie a base di RNAi anti-HIV/AIDS terapeutiche sono molto promettente, ma uno dei principali ostacoli per l&#39;applicazione di successo terapeutico e la traduzione clinica di siRNA è la consegna efficiente. In particolare, considerando la sicurezza e l&#39;efficacia di terapie a base di RNAi, è altamente auspicabile per sviluppare un approccio mirato intracellulare consegna di siRNA a popolazioni di cellule o tessuti specifici. L&#39;HIV-1 proteina gp120, una busta glicoproteina sulla superficie del virus HIV-1, svolge un ruolo importante in ingresso del virus nelle cellule CD4. L&#39;interazione di gp120 e CD4 che innesca l&#39;HIV-1 ingresso e avvia la fusione cellulare è stato convalidato come clinicamente rilevante anti-virale strategia di scoperta di nuovi farmaci. Qui, abbiamo innanzitutto discutere la selezione e l&#39;individuazione di 2&#39;-F modificato anti-HIV gp120 aptameri RNA. Utilizzando un metodo convenzionale SELEX filtro di nitrocellulosa, diversi aptameri nuovo con affinità nanomolare sono stati isolati da un 50 casuale nt RNA biblioteca. Al fine di ottenere con successo le specie legate con maggiore affinità, il rigore selezione viene accuratamente controllato regolando le condizioni. Il aptameri selezionato può legano specificamente ed essere rapidamente internalizzato nelle cellule che esprimono la proteina di HIV-1 busta. Inoltre, il aptameri sola può neutralizzare l&#39;infettività di HIV-1. Sulla base della miglior aptamer A-1, abbiamo anche creato un romanzo a doppia funzione inibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in cui sia il aptamer e le porzioni siRNA hanno potente attività anti-HIV. Inoltre, utilizziamo la gp120 aptamer-siRNA chimere per cellulari tipo di consegna specifiche del siRNA HIV-1 in cellule infette. Questa doppia funzione chimera indica un notevole potenziale per la combinazione di diversi agenti terapeutici degli acidi nucleici (aptamero e siRNA), nella soppressione da HIV-1, rendendo il aptamer-siRNA chimere attraente candidati terapeutici per i pazienti non aver terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART).

Diversi 2&#39;-Fluoro aptameri contro l&#39;HIV-RNA 1BA-L gp120 con nanomole affinità sono isolati da una libreria di RNA<em&gt; In vitro</em&gt; Procedura SELEX. Un nuovo doppio inibitoria funzione anti-gp120 aptamer-siRNA chimera si crea e mostra la promessa considerevole sistemico terapia anti-HIV.

Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

L'epidemia globale di infezione da HIV ha creato un bisogno urgente di nuove classi di agenti antiretrovirali. La potente capacità dei piccoli RNA interferenti...

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è generare RNA Aptima in vitro per la proteina HIV one GP one 20 utilizzando una membrana di nitrocellulosa. Questo viene ottenuto mediante PCR e successiva trascrizione in vitro con T seven. Per preparare il DNA iniziale e la libreria casuale di RNA, come secondo passaggio, la miscela di proteina bersaglio e libreria di RNA viene applicata su un filtro di nitrocellulosa prerisciacquato, che consente l'isolamento delle molecole di RNA legate dalle specie di RNA non legate.Dopo 12 cicli di selezione, la libreria di RNA viene clonata e sequenziata al fine di identificare i singoli candidati aptameri di RNA presenti nella libreria. I risultati ottenuti permettono di identificare diversi nuovi aptameri con affinità nell'ordine dei nanomoli, basati su saggi di spostamento elettroforetico e microscopia confocale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi a sandwich o le procedure di isolamento su colonna, è la semplicità e il fatto che non richiede un pretrattamento della proteina o delle librerie, come ad esempio l'immobilizzazione della proteina sulla fase solida. La libreria di RNA per l'isolament

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Immunologia e Infezioni

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Un metodo dettagliato è fornito qui che descrive la purificazione, il ripiegamento e la caratterizzazione delle nanoparticelle proteiche auto-assemblanti (SAPN) da utilizzare nello sviluppo del vaccino.

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Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura

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Impara a sviluppare aptameri RNA anti-HIV gp120 con alta affinità mediante SELEX su filtro nitrocellulosa. Questo metodo consente la consegna mirata di siRNA per terapie antiretrovirali innovative.

Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

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