Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è generare RNA Aptima in vitro per la proteina HIV one GP one 20 utilizzando una membrana di nitrocellulosa. Questo viene ottenuto mediante PCR e successiva trascrizione in vitro con T seven. Per preparare il DNA iniziale e la libreria casuale di RNA, come secondo passaggio, la miscela di proteina bersaglio e libreria di RNA viene applicata su un filtro di nitrocellulosa prerisciacquato, che consente l'isolamento delle molecole di RNA legate dalle specie di RNA non legate.

Dopo 12 cicli di selezione, la libreria di RNA viene clonata e sequenziata al fine di identificare i singoli candidati aptameri di RNA presenti nella libreria. I risultati ottenuti permettono di identificare diversi nuovi aptameri con affinità nell'ordine dei nanomoli, basati su saggi di spostamento elettroforetico e microscopia confocale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi a sandwich o le procedure di isolamento su colonna, è la semplicità e il fatto che non richiede un pretrattamento della proteina o delle librerie, come ad esempio l'immobilizzazione della proteina sulla fase solida. La libreria di RNA per l'isolamento degli aptameri anti HIV GP120 viene preparata a partire da una libreria di DNA sintetizzata commercialmente, contenente sequenze casuali di 50 nucleotidi.

La sequenza della libreria di oligonucleotidi di DNA a singolo filamento è lunga 81 nucleotidi. Come mostrato in questo diagramma, la regione casuale è delimitata da regioni costanti: un tumore di 30 all'estremità cinque prime e un 16 MA all'estremità tre prime. Le regioni costanti includono il promotore T sette per la trascrizione in vitro e un marcatore tre prime per l'R-T-P-C-R.

Amplificare la libreria casuale di oligonucleotidi di DNA a singolo filamento mediante PCR, limitando la PCR a 10 cicli per preservare l'abbondanza della libreria di DNA originale. Dopo le reazioni di PCR, il pool di DNA a doppio filamento amplificato viene recuperato utilizzando un kit di purificazione su gel. Il DNA a doppio filamento viene quindi convertito in una libreria di RNA utilizzando il kit cript secondo le istruzioni del produttore, sostituendo nella miscela di reazione per la trascrizione CTP e UTP con due fluoropirimidine, rispettivamente CTP e due fluoropirimidine UTP, al fine di produrre un RNA resistente alle ribonucleasi.

Al termine delle reazioni di trascrizione, digerire le reazioni con DS one per rimuovere il DNA stampo e purificare mediante un gel di poliacrilammide all'8% e sette moli di urea. Infine, quantificare la libreria di RNA purificata mediante spettrofotometria UV. Prima della selezione degli optimas, preparare i tamponi necessari e conservarli alle temperature appropriate.

Tampone Heaps a temperatura ambiente e tamponi per il ripiegamento dell'RNA e per il legame dell'RNA a meno 20 gradi Celsius. Prima di iniziare il primo ciclo di selezione, preriscaldare il pool casuale di RNA su un filtro di nitrocellulosa prerisciacquato a temperatura ambiente per 30 minuti per ridurre al minimo il legame non specifico con il filtro. Dopo 30 minuti, rimuovere il filtro di nitrocellulosa.

Combinare il pool di RNA casuale pre-purificato e la proteina HIV-1 gp120 in tampone di legame per RNA a bassa forza ionica e incubare su una piattaforma rotante a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, far passare la reazione attraverso un filtro in nitrocellulosa prerisciacquato e lavare con un millilitro di tampone di legame per RNA a bassa forza ionica per eluire l'RNA legato dal filtro. Rimuovere la membrana in nitrocellulosa dal portafiltri.

Aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione alla membrana e riscaldare a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo che l'RNA è stato eluito dal filtro, centrifugare brevemente il tubo, trasferire la soluzione di RNA in un nuovo tubo ed eseguire un'estrazione con fenolo-cloroformio sull'eit. Utilizzare una colonna MicroCon YM 30 per concentrare l'RNA ed eluire l'RNA recuperato con 20 microlitri di acqua priva di RNAsi.

La popolazione di RNA recuperata viene quindi retrotrascritta e amplificata per 15 cicli di PCR. Dopo che la popolazione amplificata di DNA a doppio filamento è stata purificata, viene trascritta in una nuova popolazione di RNA come dimostrato in precedenza prima del successivo ciclo di selezione. Riformare la popolazione di RNA in tampone HBS 1x riscaldando a 95 gradi Celsius per tre minuti, quindi lasciare raffreddare lentamente a 37 gradi Celsius.

Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Adsorbire l'RNA rinaturato, trasferirlo su un filtro di nitrocellulosa per 30 minuti prima dell'incubazione con la proteina bersaglio HIV bowel GP120 per il successivo ciclo di selezione. Per ottenere con successo gli abers con maggiore affinità di legame, la stringenza della selezione deve essere attentamente controllata mediante l'adeguamento delle condizioni di selezione.

Le condizioni di selezione sono mostrate in questa tabella. Per i cicli di cellex dal primo al quarto, incubare il pool di RNA pre-purificato con la proteina bersaglio in un tampone di legame per RNA a bassa forza ionica per 30 minuti. Dopo il quarto ciclo di cellex, utilizzare un tampone di legame per RNA ad alta forza ionica man mano che il cellex procede.

Ridurre la quantità di proteina GP120 e aumentare il tRNA di lievito competitore per incrementare la selettività della selezione aptamerica ad ogni ciclo. L'avanzamento della selezione di GP120 ottimale di HIV-1 viene monitorato mediante un saggio di legame su filtro. In questo video, i 12 pool di RNA raccolti dopo tutti i cicli di selezione verranno sottoposti a saggio.

Prima di tutto, rimuovere il trifosfato iniziale in posizione cinque prime trattando ogni pool di RNA con fosfatasi intestinale di vitello per un'ora a 37 gradi Celsius. Per preparare l'RNA trattato con CIP per la marcatura con la polinucleotide chinasi T4 e P32 80 p, riscaldare a 95 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da raffreddamento in ghiaccio. La marcatura dell'RNA viene eseguita in una stanza calda appositamente dedicata a esperimenti che coinvolgono radioattività, in tampone PNK, con polinucleotide chinasi T4, un microlitro di ATP gamma-P32 e acqua fino a un volume finale di 20 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, aggiungere 20 microlitri di acqua a ciascuna reazione e purificare mediante una colonna G 50. Infine, ottenere 40 microlitri di RNA marcato a una concentrazione finale di 250 nano molar. Riformare, in un tampone HBS una volta, ciascun pool di RNA marcato riscaldando a 95 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, lasciare raffreddare a 37 gradi Celsius, processo che richiederà da 30 a 40 minuti.

Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Una volta che il pool di RNA è stato ripiegato, eseguire una reazione di legame di 100 microlitri. Combinare il pool di RNA marcato all'estremità con la proteina GP one 20 e un eccesso molare dieci volte di tRNA competitor non specifico in tampone di legame per RNA ad alto sale, incubando a temperatura ambiente per 30 minuti.

Al termine dei 30 minuti, separare 50 microlitri della reazione di legame mediante un filtro di nitrocellulosa prerisciacquato. Successivamente, lavare il filtro con due millilitri di buffer di legame e contare l'attività radioattiva trattenuta sul filtro utilizzando un contatore a scintillazione multifunzione come conteggio del controllo in ingresso. I restanti 50 microlitri della reazione di legame nello stesso momento, il saggio di legame della popolazione di RNA dopo ogni ciclo di selezione è stato analizzato mediante un saggio di legame su filtro con tRNA competitore per monitorare l'andamento di HIV uno, GP uno 20.

Le attività di legame della selezione Optima sono state calcolate come percentuale di RNA in ingresso trattenuto sul filtro nel complesso proteina-RNA, come mostrato qui. Il pool di RNA iniziale mostra solo lo 0,1% dell'RNA in ingresso trattenuto sulla membrana. Tuttavia, dopo nove cicli di selezione, la nona libreria di RNA presenta il 9,72% dell'RNA in ingresso legato.

Sebbene siano stati effettuati ulteriori cicli di selezione, non si osserva un arricchimento aggiuntivo, suggerendo che è stato raggiunto il legame massimo del pool di RNA. Le attività di legame dei pool di RNA sono state ulteriormente confermate mediante saggi di spostamento elettroforetico in gel. Questi risultati dimostrano che alcuni ligandi con elevata specificità di legame per la proteina bersaglio vengono progressivamente arricchiti in questi pool di RNA.

In questo esempio, il 12° pool di RNA ha mostrato l'attività di legame più elevata, poiché il legame massimo del pool di RNA è stato raggiunto dopo il 12° ciclo di selezione; questo pool di RNA è stato quindi retrotrascritto in cDNA, che è stato successivamente amplificato mediante PCR. Il prodotto della PCR è stato quindi purificato e clonato in un vettore di clonaggio TA e sequenziato dopo l'allineamento di 140 cloni. Sono stati identificati sei gruppi di anti GP one 20 optimas.

Sono indicate solo le sequenze casuali delle regioni centrali di Aptima in questa tabella. Circa il 40% dei cloni contiene una sequenza conservata. È stata scelta una sequenza rappresentativa per ciascun gruppo per ulteriori caratterizzazioni, in base alla loro abbondanza relativa all'interno del gruppo, mediante un saggio di spostamento della mobilità in gel nativo; sono state calcolate le costanti di dissociazione KD di questi aptameri rappresentativi, ad esempio, A uno.

Il migliore tra gli aber ha un valore di KD apparente di 52 nanomolari. Come mostrato qui. Questi aber selezionati possono legarsi in modo selettivo alla proteina bersaglio HIV-1 GP120, ma non alla proteina H-I-V-G-P120 CM. Cellule CHO-G160 che esprimono stabilmente la glicoproteina dell'involucro dell'HIV GP160 sono state utilizzate per verificare il legame e l'internalizzazione degli optimas anti-GP120 selezionati.

Queste cellule non elaborano la GP160 in GP120 e G41 poiché mancano delle proteasi codificate dal gene gag necessarie per l'elaborazione dell'involucro. L'analisi citometrica a flusso rivela che gli aptameri marcati con S3 si legano specificamente alle cellule CHO che esprimono GP160, ma non alle cellule di controllo CHO EE, che non esprimono GP160. Inoltre, la microscopia confocale in tempo reale su cellule vive lungo l'asse Z indica che, dopo due ore di incubazione, l'aptameri marcati con SI3 vengono internalizzati selettivamente dalle cellule CHO GP160, ma non dalle cellule di controllo CHO EE. È stato inoltre osservato che l'aptameri si accumulano nel citoplasma, suggerendo che l'aptameri GP120 possa entrare nelle cellule tramite endocitosi mediata da recettore.

Infine, dopo aver seguito questo video, dovresti avere una buona comprensione dell'utilizzo e di come utilizzare le misure basate sul campo per isolare gli RNA Abers.