Name: Analisi biofilm orale di espansori palatali da Fluorescence In Situ-ibridazione e microscopia confocale a scansione laser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Impara l'analisi dei biofilm orali da espansori palatali con FISH e microscopia confocale a scansione laser. Questo metodo permette di studiare la struttura e la composizione delle comunità batteriche in microbiologia orale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto dal Fonds Igiene dell &#39;Università Medica di Graz. Tutti i soggetti hanno dato il loro consenso informato. Approvazione istituzionale del protocollo di studio è stato ottenuto presso l&#39;Università Medica di Graz.

1. Prelievo dei campioni <ol><li> Rimuovere fisso palatale espansori dopo 4 mesi di servizio intraorale. Utilizzare Sistema Campo Asciutto NOLA per isolare gli apparecchi prima di togliere loro (figure 1 e 2). </li><li> Utilizzare una pinza sterilizzata, guanti e vassoi per rimuovere espansori senza l'aggiunta di contaminazione (figure 3 e 4). </li><li> Oggetti Conservare in Sarstedt 120 fiale ml a -20 ° C. Prendere per laboratorio su ghiaccio e processo entro 24 ore. </li></ol> 2. Biofilm fissazione <ol><li> Raschiare fiocchi biofilm con un bisturi sterile, o raccogliere i pezzi con una pinza sterile. </li><li> Aggiungi ghiacciata soluzione al 4% PFA fino campione è ben coperto. </li><li> Incubare la miscela a +4 ° C (non congelare) per 3 a 12 ore. Tempi di fissazione più o temperature superiori fissazione può rendere le buste di cellule meno permeabile a sonde oligonucleotidiche gram-negativi. </li><li> Rimuovere la soluzione PFA e lavare con ghiacciata PBS 1X. Ripetere questa operazione 2-3 volte al rTogliete residuo PFA. </li><li> Risospendere il campione in 1 vol. ghiacciato 1X PBS e aggiungere 1 vol. ghiacciato del 96% (v / v) di etanolo. </li><li> Conservare il campione a -20 ° C. Campioni fissati in base a questo protocollo può essere conservato per diversi mesi o anni. </li></ol> 3. Disidratazione dei campioni fisso <ol><li> Applicare 5-30 microlitri di PFA materiale fissato campione di un vetrino da microscopio. </li><li> Secco a 46 ° C per circa 15 minuti oa temperatura ambiente per più tempo. Scongelare il lisozima e la formammide. </li><li> Aggiungere 250 ml di lisozima (1mg/ml) a temperatura ambiente per 10 minuti, facilitando la penetrazione delle sonde nelle cellule dalla distruzione parziale delle pareti cellulari. </li><li> Dip scivolare nel 50%, 80% e 96% (v / v) di etanolo per 3 minuti ciascuno. L'effetto disidratante della serie concentrazione di etanolo si disintegrerà delle membrane cellulari. </li><li> Asciugare i vetrini a 46 ° C per 10 min. </li></ol> 4. Ibridazione in situ <ol><li> Preparare 1 ml diibridazione tampone fresco (vedi Tabella 1 per le concentrazioni). Concentrazioni formammide utilizzato in questo studio: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, dei conti correnti postali, MUT590) o 45% (LGCmix). </li><li> Scongelare le soluzioni oligonucleotide sonda. Sonde scongelati devono essere tenuti sul ghiaccio e al riparo dalla luce. </li><li> Aggiungere 2 ml di ciascuna sonda a 200 l di tampone di ibridazione, mescolare bene e applicare la miscela al campione disidratato su un vetrino da microscopio. </li><li> Mettere un pezzo di carta velina in un piatto piazza Petri e versare il buffer di ibridazione rimanente sulla carta velina. </li><li> Collocare immediatamente la diapositiva orizzontalmente nel piatto e chiudere il piatto. Incubare in un forno a 46 ° C per 1-5 ore (90 min sarà sufficiente nella maggior parte dei casi). Le funzioni piatto come una camera di umidità impedendo l'evaporazione della soluzione di ibridazione dalla diapositiva. In particolare, l'evaporazione di formammide può causare non sonda specifica vincolante per non colpire le cellule. </li><li> Preparare 50 ml di tampone di lavaggio (vedi Tabella 2 per concentrations). Preparare il tampone di lavaggio in un tubo da 50 ml e preriscaldare a 48 ° C a bagnomaria. La fase di lavaggio viene eseguita a 48 ° C. </li><li> Rimuovere il piatto con la diapositiva dal forno di ibridazione. Immediatamente lavare il buffer di ibridazione con un piccolo volume di pre-riscaldato tampone di lavaggio, e trasferire la diapositiva nel buffer di lavaggio rimanenti. </li><li> Posizionare il tubo contenente il tampone di lavaggio e lo scivolo di nuovo nel bagno d'acqua e incubare a 48 ° C per 10-15 minuti. </li><li> Rimuove la pagina dal tubo e tuffo nella gelida DDH 2 O per 2-3 secondi per eliminare residui di tampone di lavaggio. </li><li> Asciugare la diapositiva il più rapidamente possibile (l'uso di aria compressa è raccomandato). Essiccazione rapida riduce sonda dissociazione. </li><li> Diapositive secchi possono essere conservati al buio a -20 ° C per diverse settimane senza significative perdite di sonda-conferito segnale di fluorescenza. </li></ol> 5. Microscopia <ol><li> Dopo la FISH e lavaggio, apply due gocce di antifadent vicino alle estremità destra e sinistra di una diapositiva (fette congelato dovrebbe essere portata a temperatura ambiente prima di questo passo). </li><li> Mettere un coperchio microscopio scivolare sulla parte superiore e attendere che il antifadent si è diffuso oltre l'intera diapositiva. Si noti che una quantità eccessiva di antifadent può sfocare l'immagine microscopio. </li><li> Osservare i campioni al microscopio confocale a scansione laser dotati di filtri adatti o laser. Abbiamo usato una Leica TCS unità (HCX PL APO/63x; NA 1.2). I dati possono essere analizzati con software come IMARIS o AMIRA. </li><li> Diapositive integrati nel antifadent possono essere conservati a +4 ° C (non congelare) per un massimo di 7 giorni prima la sonda-conferito fluorescenza comincia a declinare. In alternativa, il antifadent può essere rimosso con DDH 2 O, e le diapositive secca può essere conservata a -20 ° C per un periodo prolungato di tempo. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Raschiando biofilm off apparecchi ortodontici fissi (Figura 5) produce fiocchi adatto (Figura 6) che può essere ibridato direttamente su vetrini rivestiti per microscopia. In questo modo, i diversi gruppi di batteri orobiome possono essere identificati nel loro naturale ambiente tridimensionale da rRNA tagging batterica etichettati in modo diverso sonde specifiche (figure 7 e 8). Nella Figura 7, biofilm era macchiata di EUBmix (verde, tutti i batteri) e LGCmix (giallo, Firmicutes). Firmicutes visualizzati in verde, in quanto sono state colorate di giallo e blu. Nella Figura 8, biofilm era macchiata di EUBmix (rosso, tutti i batteri), Bac303 (blu, Bacteroidetes) e dei conti correnti postali (giallo, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis è mostrata in bianco giallognolo, in quanto tutte e tre le sonde si legano al suo DNA e la sovrapposizione dei risultati di colori in un bianco segnale. Differenze morfologiche tra i gruppi di batteri possono essere identificati (Figure 9 e 10). Grandi gruppi di batteri coccoidi sono mostrati in figura 9, dove è stata eseguita con EUBmix colorazione (verde, tutti i bacteria). Diverse forme di batteri orali sono stati visualizzati in Figura 10, dove i batteri filamentosi coccoidi e possono essere distinte dalla colorazione con EUBmix (rosso). Inoltre, un tipico fungo-come la struttura del biofilm possono essere trattati tramite modellazione 3D dei dati CLSM (figure 11 e 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Clicca qui per guardare un film della modellazione 3D.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Espansore palatale fisso in situ. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Sistema campo Nola a secco. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Pinze sterili, guanti e vassoio. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Rimosso espansione. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Biofilm raschiando con un bisturi sterile. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Fiocchi di resina Figura 6. Ibridato direttamente su lastre di vetro rivestito. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7 immagine CLSM:. Differenziazione di uno specifico gruppo di batteri. Sovrapposizione di dati 2D CLSM pila 3D. Biofilm colorati con EUBmix (verde, tutti i batteri) e LGCmix (giallo, Firmicutes). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8 immagine CLSM:. Differenziazione di uno specifico gruppo di batteri. Sovrapposizione di dati 2D CLSM pila 3D. Macchiato biofilm con EUBmix (rosso, tutti i batteri), Bac303 (blu, Bacteroidetes) e dei conti correnti postali (giallo, Porphyromonas gingivalis). <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9 immagine CLSM:. Differenziazione delle morfologie specifiche. Sovrapposizione di dati 2D CLSM pila 3D. Biofilm colorati con EUBmix (verde, tutti i batteri). Grandi cluster di batteri coccoidi (frecce). <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10"> . Figura 10 immagini CLSM: differenziazione delle morfologie specifiche. Sovrapposizione di dati 2D CLSM pila 3D. Biofilm colorati con EUBmix (rosso, tutti i batteri). Coccoidi (freccia in basso) e batteri filamentosi (freccia in alto) si possono distinguere. <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 11"> Figura 11. Struttura di funghi, viste 3D dal basso. Pile di fiocchi biofilm (raschiato la superficie di un apparecchio ortodontico), colorate con EUBmix e proceduressed con IMARIS (immagine CLSM). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 11"> Figura 12. Struttura di funghi, vista laterale 3D. Pile di fiocchi biofilm (raschiato la superficie di un apparecchio ortodontico) trattati con IMARIS (immagine CLSM). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Ibridazione di buffer (200 mL) </td></tr><tr><td> Concentrazione Formammide </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2% SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Ogni pesce sonda </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Costituenti Tabella 1. Tampone di ibridazione (concentrazioni in microlitri). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Tampone di lavaggio (50 ml) </td></tr><tr><td> Concentrazione Formammide </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> Costituenti Tabella 2. Tampone di lavaggio (concentrazioni in microlitri). Movie 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Clicca qui per guardare il film.</a>

<ol><li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li>
<li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+among+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Communication among oral bacteria.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).</li>
<li>Zijnge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilm+architecture+on+natural+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oral biofilm architecture on natural teeth.</a> PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluorescent+in+situ+hybridization+for+the+specific+detection+and+quantification+of+oral+streptococci+in+dental+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque.</a> J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).</li>
<li>Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+in+dental+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions in dental biofilm development.</a> J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).</li>
<li>Jung, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+initial+bacterial+colonization+on+dentine+and+enamel+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ.</a> J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).</li>
<li>Al-Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+enamel+in+situ+investigated+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization.</a> J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).</li>
<li>Bryers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Medical biofilms.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).</li>
<li>Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+the+bacterial+community+associated+with+the+reindeer+lichen+Cladonia+arbuscula+reveals+predominance+of+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+biofilm+formation+and+the+effects+of+antimicrobial+agents+on+orthodontic+bonding+materials+in+a+parallel+plate+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Orthod%22%5BJournal%5D)">Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber.</a> Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).</li>
<li>Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes%3A+new+features+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007.</a> Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).</li>
<li>Diaz, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).</li>
<li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+and+successions+during+plaque+development%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions and successions during plaque development.</a> Periodontology. 42, 47-79 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+multispecies+biofilm+development+and+the+key+role+of+cell-cell+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).</li>
<li>Chalmers, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+monitoring+the+development+of+bacterial+biofilms+in+human+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets.</a> FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).</li>
<li>Moter, A., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.</a> J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il presente protocollo descritto è un approccio altamente funzionale per biofilm colorazione raccolti dai materiali duri. Campionamento e ibridazione sono i passaggi più critici. Durante il campionamento, occorre fare attenzione che le fette di spessore adeguato sono raccolti per assicurare che la struttura del biofilm rimane intatto. Durante l&#39;ibridazione, è essenziale per evitare eccessive fluttuazioni di temperatura, evitando legame non specifico, o la perdita di legame, delle sonde fluorescente. Questo protocollo FISH è un metodo elegante per macchiare normale biofilm eterogeneo direttamente su vetrini senza interrompere la sua composizione. Le slide possono essere immediatamente utilizzati per la microscopia, senza la necessità di spostare il campione ancora una volta. In questo modo, un miglioramento rispetto colorazione in tubi si ottiene una minore forza di taglio applicata al biofilm. Fette&gt; 50 micron di spessore possono essere preparati e studiati in questo modo.

analisi biofilm orale di espansori palatali da fluorescence in situ-ibridazione e microscopia confocale a scansione laser

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Microscopia confocale a scansione laser (CLSM) di naturale biofilm eterogeneo è oggi facilitato da una gamma completa di tecniche di colorazione, uno dei quali è ibridazione in situ fluorescente (FISH). 1,2 Abbiamo eseguito uno studio pilota in cui campioni di biofilm orali raccolte da fisso apparecchi ortodontici (palatale expander) sono state macchiate dalla FISH, con l&#39;obiettivo di valutare l&#39;tridimensionale organizzazione del biofilm naturale e accumulo di placca. 3,4 PESCE crea l&#39;opportunità di macchia cellule nel loro ambiente nativo biofilm con l&#39;uso di 16S fluorescente rRNA-targeting sonde. 4-7,19 Rispetto alle tecniche alternative come l&#39;etichettatura immunofluorescenza, questo è un poco costoso, tecnica di etichettatura preciso e semplice da indagare diversi gruppi di batteri nel biofilm consorzi misti. 18,20 sonde sono state usate Generale che si legano al Eubatteri ( EUB338 + + EUB338II EUB338III, di seguito EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. LGCmix di seguito), 9,10 e Bacteroidetes (Bac303) 11 Inoltre, le sonde specifiche vincolanti di Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 e Porphyromonas gingivalis (conti correnti postali) 13,14 sono stati utilizzati . La durezza estrema dei materiali superficie interessata (in acciaio inox e resina acrilica) ci costrinse a trovare nuovi modi di preparare il biofilm. Poiché questi materiali di superficie non potrebbe essere facilmente tagliato con una cryotome, vari metodi di campionamento sono stati esplorati per ottenere intatto biofilm orale. La più realizzabile di questi approcci è presentata in questa comunicazione. Piccoli fiocchi del biofilm che trasporta resina acrilica sono stati raschiata con un bisturi sterile, facendo attenzione a non danneggiare la struttura del biofilm. Forcipe sono stati utilizzati per raccogliere biofilm dalle superfici in acciaio. Una volta raccolti, i campioni sono stati fissati e posti direttamente sul polysine vetrini rivestiti. FISH è stata eseguita direttamente su queste diapositive con le sonde mentioned sopra. PESCE protocolli diversi sono stati combinati e modificati per creare un nuovo protocollo che è stato facile da maneggiare. 5,10,14,15 Successivamente i campioni sono stati analizzati al microscopio confocale a scansione laser. Noto configurazioni 3,4,16,17 potrebbero essere visualizzati, tra cui funghi in stile formazioni e gruppi di batteri coccoidi pervaso da canali. Inoltre, la composizione batterica di queste strutture tipiche biofilm sono stati analizzati e immagini 2D e 3D creato.

Vi presentiamo un protocollo per l&#39;analisi strutturale e compositiva delle risorse naturali biofilm orale da apparecchi ortodontici con<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) e la microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Campioni di biofilm orale sono stati raccolti da espansori palatali, raschiando acrilica sfalda la loro superficie e riferimento per l&#39;elaborazione molecolare.

Analisi biofilm orale di espansori palatali da Fluorescence In Situ-ibridazione e microscopia confocale a scansione laser

La microscopia confocale a scansione laser (CLSM) di biofilm naturali eterogenei è oggi facilitata da una gamma completa di tecniche di colorazione, una delle quali...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere biofilm orale nativo da espansori palatini per l'ibridazione fluorescente in situ. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo l'espansore palatino, trasportando il biofilm di quattro mesi dal paziente. Successivamente, i frammenti di resina acrilica contenenti il biofilm vengono raschiati via dall'espansore palatino.Successivamente, la fluorescenza nell'ibridazione C su biofilm fissato viene eseguita direttamente su vetrini rivestiti. Infine, l'analisi del biofilm colorato è effettuata mediante microscopia a scansione laser confocale. Alla fine, la struttura e la composizione delle comunità batteriche del biofilm vengono mostrate attraverso ibridazione fluorescente in situ e microscopia a scansione laser confocale. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo riscontrato biofilm spessi su espansori ortodontici visibili ad occhio nudo.Ci hanno fatto riflettere su possibili associazioni tra questi microrganismi e le malattie parodontali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia orale, come la disposizione spaziale e la composizione dei biofilm orali nativi. Il metodo è interdisciplinare e deve essere eseguito da diversi specialisti.Quindi Elizabeth è un'ortodontista e Barbara è una biologa del laboratorio molecolare. Per iniziare, dopo quattro mesi di permanenza in superficie intraorale, utilizzando il sistema di campo secco NOLA, isolare l'espansore palatale fisso per evitare contaminazioni. Rimuovere l'apparecchio dalla bocca del paziente utilizzando pinze sterili, guanti e vassoi.Conservare gli oggetti in vial da 120 millilitri a meno 20 gradi Celsius. Trasportarli in laboratorio su ghiaccio ed elaborarli entro 24 ore per fissare i campioni. Raschiare via le scaglie di biofilm con un bisturi sterile o raccogliere i frammenti con pinze sterili.È fondamentale raschiare via scaglie di resina acrilica di spessore adeguato per garantire che la struttura del biofilm rimanga intatta al freddo di ghiaccio. Soluzione di paraformaldeide al 4% fino a quando il campione è completamente ricoperto. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per tre-dodici ore.Tempi di fissazione più lunghi o temperature di fissazione più elevate possono rendere gli involucri cellulari delle cellule gram-negative meno permeabili ai sonde oligonucleotidiche. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di paraldeide e lavare con PBS freddo ghiacciato una volta. Ripetere questo passaggio da due a tre volte per rimuovere il paraldeide residuo, quindi trasferire il campione in un volume di PBS freddo ghiacciato una volta e aggiungere un volume di etanolo al 96% freddo ghiacciato; conservare il campione a meno 20 gradi Celsius.I campioni possono essere conservati per diversi mesi o anni per disidratare il campione. Applicare dapprima da cinque a trenta microlitri di materiale campione fissato con paraldeide su un vetrino. Far asciugare il campione per 15 minuti a 46 gradi Celsius o per un periodo più lungo a temperatura ambiente, mentre il lisozima e il formiade degradano parzialmente le pareti cellulari.Per un migliore ingresso delle sonde, aggiungere 250 microlitri di una soluzione da un milligrammo per millilitro di lisozima per 10 minuti a temperatura ambiente; immergere i vetrini in etanolo al 50, 80 e 96% per tre minuti ciascuno. L'effetto disidratante della serie di concentrazioni di etanolo disintegrerà le membrane per favorire l'assorbimento delle sonde oligonucleotidiche. Infine, asciugare i vetrini a 46 gradi Celsius per eseguire l'ibridazione in situ U.Preparare innanzitutto un millilitro di tampone di ibridazione fresco e preriscaldarlo a 47 gradi Celsius. Scongelare le soluzioni dell'oligonucleotide della sonda sul ghiaccio, proteggendole dalla luce. Collocare un pezzo di carta da filtro in una piastra di Petri quadrata ed aggiungere 800 microlitri di tampone di ibridazione sulla carta assorbente mediante pipetta.Chiudere immediatamente la camera poiché il buffer contiene formammide, aggiungere due microlitri di ogni sonda a 200 microlitri del resto del buffer di ibridazione. Mescolare accuratamente e applicare immediatamente la miscela sul campione disidratato su un vetrino, posizionare orizzontalmente il vetrino nella capsula e coprirlo. Incubare la capsula in un forno per uno a cinque ore a 46 gradi Celsius.La piastra funge da camera umidificata, prevenendo l'evaporazione della soluzione di ibridazione dal vetrino. In particolare, l'evaporazione della formammide può causare un legame non specifico della sonda a cellule non bersaglio. Preparare 50 millilitri di soluzione di lavaggio e preriscaldarla a 48 gradi Celsius in un bagno termostatato.Rimuovere la piastra con il vetrino dall'incubatore per ibridazione. Lavare immediatamente via il buffer di ibridazione con un piccolo volume di buffer di lavaggio preriscaldato e trasferire il vetrino nel buffer di lavaggio rimanente. Riposizionare il tubo contenente il buffer di lavaggio e il vetrino nel bagnomaria e incubare per 10-15 minuti a 48 gradi Celsius.Per colorare i campioni con più di una sonda, ripetere i passaggi precedenti dopo aver rimosso il tampone di lavaggio, avendo cura di iniziare con la forma più alta a una concentrazione lieve. Rimuovere il vetrino dal tubo e immergerlo nel ghiaccio.Acqua distillata fredda per due o tre secondi. Per eliminare il buffer residuo di lavaggio, asciugare l'oggetto il più rapidamente possibile, poiché un'essiccazione rapida riduce la dissociazione della sonda.Conservare le vetrini essiccati al buio a meno 20 gradi Celsius per diverse settimane senza alcuna perdita significativa del segnale di fluorescenza conferito dalla sonda. Per acquisire le immagini dei campioni, applicare due gocce di reagente Antifa vicino alle estremità sinistra e destra di un vetrino, quindi aggiungere un coprioggetto. Osservare i campioni al microscopio confocale a scansione laser dotato di filtri o laser appropriati; i vetrini possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di sette giorni oppure possono essere lavati con acqua doppio distillata e conservati a meno 20 gradi Celsius per periodi più lunghi.Si tratta di prelevare biofilm da apparecchi ortodontici fissi. Si otterranno frammenti adatti che potranno essere ibridati direttamente su vetrini rivestiti per l'analisi microscopica; in questo modo, diversi gruppi del microbioma orale, inclusi batteri in configurazione tridimensionale, possono essere identificati mediante sonde specifiche. In questa figura, il biofilm è stato colorato con la miscela EUB e con la miscela LGC mix, i firmicutes appaiono verdi poiché sono stati colorati con giallo e blu.Qui il biofilm &egrave; stato colorato con la miscela EUB mix back 3 0 3 e pogi. I batteri del gruppo bacteria dts appaiono in rosa e rosso tenue. Ramons gingivalis &egrave; mostrato in bianco giallastro poich&eacute; tutte e tre le sonde si legano al suo DNA e l&apos;overlap dei colori produce un segnale bianco morfologico.È possibile identificare anche le differenze tra gruppi di batteri, nonché determinate strutture come grandi aggregati di batteri cocchi. Di seguito sono riportati esempi di tali aggregati ottenuti utilizzando la miscela EUB per la colorazione. Inoltre, una tipica struttura simile a un fungo del biofilm può essere elaborata mediante modellazione 3D dei dati CLSM.Questa è un'animazione 3D del biofilm colorato con il mix EUB. Questo metodo può fornire informazioni sulla formazione del biofilm indotta da trattamenti ortodontici. Può inoltre essere applicato a qualsiasi altra superficie artificiale nel corpo umano che ospiti strutture di biofilm complesse con possibile patogenicità.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare biofilm orali nativi per l'ibridazione con fluorescenza in C due e la microscopia a scansione laser confocale. È importante ricordare che questo è un campo interdisciplinare e che puoi avere successo solo in un team. Tratta sempre i tuoi colleghi con cortesia.

oral-biofilm-analysis-palatal-expanders-fluorescence-situ

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Biofilm formato sulla superficie dei denti sono molto complesse ed esposte a continue sfide innata ed esogeni ambientali, che modulano la loro architettura, fisiologia e trascrittoma. Abbiamo sviluppato una serie di strumenti per esaminare la composizione, l'organizzazione strutturale e di espressione genica dei biofilm orali, che possono essere adattati ad altre aree di ricerca biofilm.

Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Fonte: Tay, S. B., et.al. Interruzione antivirulenta dei biofilm patogeni tramite lattonasi ingegnerizzate che stingono il quorum.  J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra il processo di inibizione della formazione di biofilm introducendo un enzima che interrompe la segnalazione cellulare batterica. L'enzima impedisce ai batteri di produrre sostanze polimeriche extracellulari, riducendo così lo sviluppo di biofilm su un micropiatto con fondo di vetro. Infine, la struttura del biofilm viene...

Valutazione microscopica dell'inibizione enzimatica della formazione di biofilm mediata dagli enzimi

Questo video mostra un test in tempo reale per il monitoraggio del pH extracellulare nei biofilm dentali utilizzando una sonda raziometrica sensibile al pH. Quando un biofilm batterico cresciuto in situ è esposto al glucosio, una riduzione del pH extracellulare vicino alla biomassa batterica protona la sonda, portando al suo aumento della concentrazione all'interno dei batteri. La disparità nella lunghezza d'onda di emissione tra la sonda protonata e quella non protonata viene utilizzata per...

Un test per il monitoraggio in tempo reale del pH extracellulare nei biofilm dentali

Viene presentato un protocollo per la quantificazione e il confronto simultaneo di tre componenti cellulari ed extracellulari all'interno di biofilm. La metodologia prevede l'uso della microscopia a scansione laser confocale, del software di analisi e visualizzazione strutturale del biofilm e del software di analisi statistica.

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

L'obiettivo di questo metodo è di descrivere l'uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l'architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati.

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

Un colorante raziometrico pH-sensibile è utilizzato in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale per monitorare pH extracellulare in biofilm dentali in tempo reale.

Imaging Raziometrico del pH extracellulare nel dentale biofilm

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per crescere e qualitativamente analizzare biofilm batterici su ife fungine mediante microscopia confocale ed elettronica.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Cambiamenti nel microbioma orale per tutta l'infanzia sono di crescente interesse. Confronto tra diversi microbiome studi rivela una mancanza di protocolli di campionamento standardizzati. Spazio limitato rende il solco subgengivale suono dei bambini impegnativi di campionamento. Carta del punto di campionamento è presentato qui in dettaglio come il metodo di scelta per questa zona.

Biofilm orali campionamento per l'analisi di Microbiome nei bambini sani

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentarie, compresa l'analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Un modello in situ associato con tecniche di microscopia potente viene utilizzato per l'analisi di biofilm orale.

Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali

Il protocollo descrive la coltivazione di biofilm tra regni costituiti da albicani Candida e Streptococcus mutans e presenta un metodo confocale basato sulla microscopia per il monitoraggio del pH extracellulare all'interno di questi biofilm.

Monitoraggio del pH extracellulare nei biofilm tra regni incrociati utilizzando la microscopia Confocal

L'obiettivo di questo protocollo è fornire un approccio standardizzato per valutare quantitativamente l'integrità della barriera epiteliale gingivale murina applicando topicamente destranti marcati con fluorescenza di dimensioni molecolari variabili sulla superficie gengivale in vivo, seguiti da imaging ex vivo utilizzando un sistema di microscopia a fotone singolo.

Valutazione funzionale della barriera epiteliale gingivale del topo utilizzando traccianti fluorescenti

Impara l'analisi dei biofilm orali da espansori palatali con FISH e microscopia confocale a scansione laser. Questo metodo permette di studiare la struttura e la composizione delle comunità batteriche in microbiologia orale.

Analisi biofilm orale di espansori palatali da Fluorescence In Situ-ibridazione e microscopia confocale a scansione laser

Esplora altri video