Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività fisiologica dei neuroni olfattivi nella drosofila e nel lobo dell'antenna mediante imaging ottico dei cambiamenti intracellulari del calcio. Ciò si ottiene assemblando prima il supporto del cavo del blocco di montaggio e la schermatura dell'antenna. Successivamente, una mosca che esprime il sensore di calcio fluorescente GCaMP viene montata e fissata al blocco.

Una volta montata la mosca, la cuticola sulla parte superiore della testa della mosca viene tagliata via per esporre i lobi dell'antenna. Il passaggio finale della procedura consiste nel mettere la mosca al microscopio e stimolarla con un odore. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano modelli di attività evocati dall'odore nei lobi dell'antenna DLA attraverso i cambiamenti registrati nella fluorescenza relativa del campo G del sensore di calcio.

Questo metodo può aiutare a rivelare come gli odori sono rappresentati come modelli spaziali e temporali di attività neurale a diversi livelli dei circuiti olfattivi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi come l'elettrofisiologia è che possiamo registrare l'attività di neuroni geneticamente identificati che non sono accessibili agli elettrodi di registrazione. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sull'elaborazione neurale degli odori.

Può anche essere applicato ad altre regioni del cervello joof, come il sistema uditivo e quello gassoso. Innanzitutto, avvitare le viti attraverso la parte posteriore del blocco di montaggio in plexiglass, in modo che non si estendano oltre la parte anteriore. Usa un trapano di precisione per fare un'ammaccatura nel bordo superiore della camera circolare per la mosca scavando sotto la superficie per ridurre lo spessore del blocco.

Sotto un cannocchiale da dissezione, tagliare una griglia di rame con un bisturi perpendicolare e vicino alla parte inferiore della fessura per creare un collare per trattenere la mosca. Assicurati che i due lembi risultanti siano a livello in quanto ciò aiuterà nell'inserimento della mosca. Con uno stuzzicadenti, posizionare una piccola goccia di super colla sul blocco di montaggio sopra la camera circolare.

Per la mosca, posizionare la griglia di rame sulla colla e posizionarla in modo che la fessura sia centrata sul blocco. Premere delicatamente sulla griglia e rimuovere la colla in eccesso con un paio di pinzette. Aggiungi piccole gocce di colla sotto i lembi su ciascun lato e piega la griglia sulla parte anteriore del blocco in modo che la fessura sia rivolta verso il basso.

Assicurati che la parte superiore della griglia sia a livello del blocco e lascialo asciugare completamente. Per realizzare un portafilo, tagliare a metà un vetrino coprioggetti di plastica e rimuovere un pezzo centrale per creare una forma a U. Usa la cera d'api per incollare un pezzo di filo sulla parte superiore dell'U in modo che il filo non sia troppo t.

Costruisci uno schermo dell'antenna usando un perforatore di carta per fare un foro in un vetrino di plastica. Tagliare i bordi del vetrino coprioggetto a 0,5 x 0,7 centimetri. Incolla il vetrino di plastica forato sul nastro adesivo, quindi posiziona una goccia di etanolo sul nastro esposto attraverso il foro.

Per rimuovere l'adesivo, anestetizzare le mosche di età compresa tra una e tre settimane del genotipo appropriato raffreddandole con ghiaccio. Sotto il cannocchiale da dissezione, raccogli una mosca per l'articolazione dell'ala e falla scorrere prima sulla superficie dorsale lungo la griglia di rame in modo che sia sospesa per il collo. Se necessario, ruotare la mosca finché non guarda verso il basso.

Posiziona una sottile spina di cactus davanti alla testa della mosca per impedirle di scappare e posiziona la spina dorsale davanti al probos per impedirle di muoversi. Fissa la spina del cactus al blocco usando la cera d'api, assicurandoti che la parte superiore della testa sia a livello della parte superiore del blocco. Fissare la testa della mosca al blocco con una piccola goccia di colofonia sciolta in etanolo.

Metti il blocco in una scatola umidificata e lascia indurire la colofonia per circa un'ora. Usando una pinza, tirare in avanti la piastra dell'antenna e far cadere il supporto del cavo nella piega cuticolare tra l'antenna e la testa. Fissa il supporto alla parte anteriore del blocco con altra cera d'api.

Utilizzando le viti integrate nel blocco, spingere delicatamente in avanti il supporto del cavo per creare un po' di spazio tra la piastra dell'antenna e la testa. Posiziona lo schermo dell'antenna sopra la testa di una mosca con il tutto posizionato centralmente. Fissare lo scudo alla parte superiore del blocco di montaggio con cera d'api.

Usando un divisore a lame, taglia un piccolo foro nel nastro sullo scudo, esponendo la cuticola della testa della mosca dietro l'antenna. Il foro non deve estendersi oltre gli occhi per evitare perdite dal preparato. Sigillare il foro tra il nastro e la cuticola con silicone bicomponente.

Rimuovere il silicone in eccesso dalla parte superiore della testa della mosca. Metti una goccia di soluzione salina per la drosophila sulla testa della mosca, assicurandoti che non ci siano perdite e che le antenne rimangano completamente asciutte. Usando una lama di zaffiro, incidere leggermente lungo la piega cuticolare direttamente dietro l'antenna.

Poi tagliare lungo gli occhi e attraverso i selli sul retro. Infine, piegare il pezzo di cuticola sul bordo inciso e tagliare dal lato inferiore. Per evitare di recidere i nervi dell'antenna, rimuovere con cura le ghiandole e la trachea con una pinzetta fine.

Risciacquare ripetutamente con la soluzione di suoneria Drosophila, lasciando una grossa goccia sulla testa. Inserire un tampone di cellulosa in una siringa di plastica da due millilitri con una pinza pulita. Utilizzando un puntale per pipetta filtrato, applicare 20 microlitri di odorizzante diluito.

Collegare e tappare la siringa fino a quando non è necessario per l'imaging. Posizionare il supporto contenente la mosca sotto il microscopio. Abbassare l'obiettivo finché non tocca la soluzione della suoneria sulla testa del volo.

Guardando attraverso il visore sotto l'illuminazione a campo chiaro, posizionare la preparazione in modo che il foro nella capsula della testa sia centrato e i suoi bordi siano a fuoco. Passa alla luce fluorescente e regola la messa a fuoco fino a quando non riesci a vedere i neuroni etichettati, che dovrebbero essere evidenti dalla fluorescenza verde basale di GCaMP. Acquisire immagini con una camera CCD montata sul microscopio utilizzando un apposito software di acquisizione e trovare la messa a fuoco sui glomeruli di interesse.

Assicurarsi di chiudere il diaframma nel percorso della luce di illuminazione per limitare la luce di eccitazione all'area dell'immagine. Posizionare l'uscita dell'olfattometro a circa 0,5 centimetri davanti alle antenne delle mosche. Qui, i lobi anali sono mostrati in un moscerino che esprime GCaMP 1.6 sotto il controllo di un promotore di neuroni sensoriali olfattivi che guida l'espressione in diversi glomeruli La stimolazione con acido propionico all'1% suscita aumenti della fluorescenza GAMP indicando aumenti del calcio intracellulare, nei neuroni sensoriali olfattivi, innervando i glomeruli, DC quattro e DP uno L.La dinamica temporale delle risposte del calcio dei glomeruli DC quattro e DP uno L all'acido propionico è mostrata qui.

Le tracce nere mostrano la mediana del delta medio F su F all'interno della regione di interesse in otto animali, e la superficie grigia indica l'intervallo tra il primo e il terzo quartile della distribuzione. Le mappe di calore sottostanti mostrano le risposte dei singoli animali. I riquadri magenta verdi indicano i fotogrammi mediati per calcolare le risposte di picco dei glomeruli al di sopra dei livelli di fluorescenza basale di GCaMP e sono mostrati quantificati qui.

La correzione dello sbiancamento del reporter fluorescente può avere effetti sulla risposta. I dati di campionamento di picco nel pannello di sinistra possono essere corretti senza modifiche sostanziali nella forma della risposta. Campione. I dati sul pannello di destra sono gravemente influenzati dalla correzione della candeggina, probabilmente perché il segnale diminuisce e viene mantenuto al di sotto della linea di base dopo la terminazione dello stimolo olfattivo Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti.

Se eseguita correttamente Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere l'antenna completamente asciutta o non saranno in grado di rilevare gli odori. Dopo aver visto questo video. Dovresti avere una buona comprensione di come preparare l'immagine e analizzare l'odore.

Evoca l'attività neuronale nel moscerino della frutta.