Name: Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Impara l'imaging di calcio nel lobo antennale di Drosophila melanogaster per studiare l'attività neuronale olfattiva. Questa tecnica ottica rivela pattern spaziali e temporali delle risposte agli odori.

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Noi riconosciamo Silke Sachse e Beate Eisermann nello sviluppo di questa metodologia, Pablo Traversa per disegnare i progetti di blocco di montaggio e Daniela Pelz per l&#39;utilizzo dello schema in figura 1. Siamo grati a Silke Sachse, Pavan Ramdya e Raffaello Rytz per i commenti sul manoscritto. R. Bell è supportato da una Boehringer Ingelheim PhD Fellowship Foundation. La ricerca nel laboratorio di R. Benton è finanziato da un Consiglio europeo della ricerca a partire Independent Researcher Grant e il Fondo nazionale svizzero Science Foundation.

1. Blocco di Montaggio <ol><li> Il blocco plexiglass montaggio (Figura 1A) dovrebbero essere apportate alle specifiche esatte espresse nella matrice (disponibile dalla <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) Per consentire un facile montaggio e la dissezione di mosca. Filo attraverso le viti dal retro ma non li estendono oltre la parte anteriore del blocco; loro posizione sarà regolato durante la preparazione della animale (vedi 2,7). </li><li> Utilizzando un trapano precisione, intaccare il bordo superiore della camera circolare per la mosca, scavi sotto la superficie per fare spazio per il corpo della mosca, riducendo lo spessore del blocco a questo punto. </li><li> Tagliare una griglia di rame con un bisturi e perpendicolare in prossimità del fondo della fessura di creare un "collo". Assicurarsi che i due lembi ottenuti sono di livello, in quanto ciò contribuirà l'inserimento della mosca. </li><li> Con uno stuzzicadenti, mettere una piccola goccia di colla sul blocco di montaggio sopra la camera circolare per la mosca. Posizionare la griglia di rame sulla colla e posizione in modo che la fessura è centrata sul blocco (Figura 1A). Premere delicatamente e rimuovere ogni eccesso di colla. Con un paio di pinzette, aggiungere piccole gocce di colla alle alette su ciascun lato e piegare la griglia sul fronte del blocco in modo che la fessura è rivolta verso il basso diritte. Assicurarsi che la parte superiore della griglia è a livello con il blocco. Lasciare asciugare completamente. </li><li> Assemblare un titolare di filo: tagliare un coprioggetto di plastica a metà e togliere un pezzo centrale per fare una forma a "U". Utilizzare cera d'api di incollare un pezzo di filo nella parte superiore della "U", non rendono il cavo troppo teso. </li><li> Costruire lo scudo antennale: fare un buco in un vetrino di plastica con una carta hole-punch. Tagliare i bordi del coprioggetto a 0,5 x 0,7 cm. Incollare il vetrino di plastica forato per nastro adesivo e poi mettere una goccia di etanolo sul nastro esposto attraverso il foro dirimuovere l'adesivo. </li></ol> 2. Preparazione degli animali <ol><li> Le mosche del genotipo appropriata - cioè tenendo la combinazione desiderata di "driver" e l'attività-reporter transgeni - dovrebbe essere 1-3 settimane di età, la cuticola dei giovani mosche è troppo morbido e difficile da tagliare. Quando gli esperimenti richiedere che il confronto diretto di genotipi diversi, e al fine di corrispondere i livelli di espressione del transgene, mosche dovrebbe essere pari età al fine di evitare differenze fisiologiche legate all'età. Se il genere non è importante, preferiamo usare le mosche di sesso femminile poiché hanno più la testa e sono più facili da manipolare. </li><li> Anestetizzare le mosche da raffreddamento su ghiaccio. </li><li> Introdurre una mosca nel blocco di montaggio. Tenere la mosca dal giunto ala e farla scorrere, dorsale-prima superficie, lungo la fessura della griglia di rame in modo che sia sospesa dal suo collo (Figura 1B-C). Se necessario, si ruotare fino sta guardando. </li><li> Posizionare una spina bel cactus di fronte alla fly testa per impedirne la fuoriuscita (Figura 1B-C). Posizionare la colonna vertebrale cactus davanti proboscide per impedire che si sposti. Fissare la colonna vertebrale cactus al blocco utilizzando cera d'api. Assicurarsi che la parte superiore della testa è a livello con la parte superiore del blocco. </li><li> Fissare la testa della mosca al blocco con una piccola goccia di resina (sciolto in etanolo). Posizionare il blocco in una scatola umidificata e consentire la colofonia indurire per circa un'ora. </li><li> Utilizzando pinze, tirare la piastra antennale in avanti e far cadere il filo sul supporto (cera-side out, vedi 1.5) nella piega cuticolare tra l'antenna e la testa. Fissare il supporto alla parte anteriore del blocco con cera d'api. </li><li> Usando le viti costruito nel blocco, spingere delicatamente il titolare del filo in avanti per creare uno spazio tra la piastra antennale e la testa. </li><li> Posizionare lo scudo antennale (vedi 1.6) sopra la parte superiore della testa della mosca con il foro posizionato centralmente. Fissare con cera d'api per la parte superiore del blocco di montaggio. </li><li> Utilizzando una lama-splitter, cuta piccolo buco nel nastro sullo scudo esponendo la cuticola della testa della mosca dietro l'antenna. Il foro non dovrebbe estendersi oltre gli occhi per evitare che la preparazione di fuoriuscire. </li><li> Sigillare il foro tra il nastro e la cuticola con due componenti di silicio. Rimuovere l'eventuale eccesso di silicone dalla parte superiore della testa della mosca. </li><li> Mettere una goccia di Drosophila Ringer salina (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 36 mM saccarosio, 5 mM di HEPES, pH 7,3) sulla testa. Assicurarsi che non vi siano perdite: le antenne dovrebbero rimanere completamente asciutto. Utilizzando una lama zaffiro, tagliato un buco nella cuticola. In primo luogo, leggermente punteggio lungo la piega cuticolare direttamente dietro l'antenna, quindi tagliati lungo gli occhi e attraverso il ocelli sul retro. Infine, piegare il pezzo di cuticola oltre il limite segnato e tagliare dalla parte inferiore per evitare di recidere i nervi antennali. </li><li> Rimuovere con cautela ghiandole e trachea con le pinzette sottili. Sciacquare ripetutamente con Drosophila </li></ol> 3. Odore stimolo di consegna <ol><li> Siringhe odore: inserire un tampone di cellulosa in una siringa 2 ml di plastica con pinzette pulite e pipetta (usando punte filtro) 20 pl di odore, diluite come desiderato in un solvente appropriato, usando la punta della pipetta per spingere il pad in profondità nella canna . Plug e il tappo della siringa fino al momento. Diluizioni odore fresco deve essere preparato almeno ogni 3 mesi (o più frequentemente, per gli odori altamente volatili e / o di uso frequente), e pastiglie nuove devono essere preparati per siringhe odore appena prima di ogni sessione di registrazione. Non usare pagliette odori per più di tre stimoli, poiché la concentrazione di odore potrebbe decadere. </li><li> Su misura olfattometro (Figura 2): un flusso di aria primaria (1 l / min) è diretto attraverso la tubazione Teflon (0,4 mm di diametro interno); 27 centimetri a monte della uscita di questo tubo, un flusso d'aria secondaria (1 l / min ) è aggiunto. Entrambi i flussi d'aria generati da pompe a membrana, ela portata viene regolata da due misuratori di portata indipendenti. I flussi d'aria può essere umidificata passando attraverso l'acqua in bottiglie di lavaggio di gas, anche se occorre prestare attenzione per evitare un'eccessiva umidificazione (vale a dire oltre il ~ 60%). Il flusso d'aria secondaria è diretta attraverso una siringa odore o una siringa vuota: siringhe sono connessi al flusso d'aria attraverso un ago di siringa (1,2 mm di diametro esterno) perforare lo stantuffo. Una valvola a tre vie magnetico controllato attraverso una unità di controllo della valvola (ad es VC6 Harvard Apparatus) è usato per passare l'aria pulita e stimolo odore. </li></ol> 4. Imaging in vivo <ol><li> Descriviamo qui di immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza in posizione verticale (vale a dire diritto fisso fase Zeiss Axio D1 Examiner) dotata di un obiettivo 20x acqua (per es Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (Figura 2). Per l'imaging con G-CAMP (eccitazione / emissione: 488/509 nm), utilizzare un blocco filtro con le seguenti proprietà: filtro di eccitazione 450-490 nm, Specchio dicroico (T495LP) e 500-550 nm filtro per le emissioni (Chroma ET). Posizionare il blocco di montaggio contenente la mosca al microscopio. Posizionare l'uscita dei circa 0,5 cm olfattometro di fronte antenne della mosca. </li><li> Abbassare l'obiettivo fino a toccare la soluzione di Ringer sulla testa della mosca. Guardando attraverso il visualizzatore luminoso sotto-campo di illuminazione, la posizione preparazione modo che il foro nella capsula testa è centrato e suoi confini sono a fuoco. Passare a luce fluorescente e regolare la messa a fuoco fino a quando puoi vedere i neuroni marcati (risulta dal basale fluorescenza verde del G-cAMP). </li><li> Fine Focus sul glomeruli di interesse con l'acquisizione di immagini con un Charge-Coupled Device (CCD) telecamera (ad esempio CoolSNAP-HQ2 sistema di fotocamera digitale) montata sul microscopio usando software appropriato ripresa (ad es Metafluor) (Figura 3A). Chiudere il diaframma nel percorso della luce di illuminazione per limitare la luce di eccitazione alla zona immaginata. </li><li> Per la schedatura dei cattivi odori evocatiattività, impostare la velocità di acquisizione a 4 Hz e regolare il tempo di esposizione per ottenere valori di fluorescenza entro il campo dinamico di fotocamera CCD, ma non inferiore a 1000 (unità arbitrarie), con almeno 12-bit risoluzione dinamica. Il tempo di esposizione non deve superare i 100 ms, se possibile, di ridurre G-CAMP photobleaching. Se la risoluzione spaziale della fotocamera lo consente, è possibile aumentare il binning (numero di pozzi sul chip che verrà categorizzata in un pixel digitale) per ridurre il tempo di esposizione. Otteniamo le immagini di 350x225 pixel (con un binning di 2x2), corrispondenti a 210x135 micron presso la preparazione. Queste impostazioni sono ottimali per catturare odori glomerulari indotte risposte di G-CAMP con una buona risoluzione spaziale e temporale, limitando giornalista sbiancamento. </li><li> Impostare i parametri di misura. Abbiamo tipicamente registrare per 10 secondi (cioè 40 fotogrammi), con stimolazione odore generalmente a partire 4 secondi dopo l'inizio del periodo di acquisizione (telaio 15) e una durata di un secondo (uino fotogramma 19). Una preparazione mosca può normalmente essere testati con un massimo di 25-30 stimoli odore diverso, spesso limitate da un declino irreversibile nel segnale fluorescente del reporter a causa di photobleaching. Il inter-stimolo intervallo dipenderà dalla forza della risposta osservata e il tasso di photobleaching. La lunghezza appropriata di intervallo inter-stimolo per evitare di adattamento sensoriale può essere determinata in modo approssimativo con la presentazione ripetuta di un odore controllo positivo (se conosciuto) in esperimenti di prova. L'inclusione di questo odore ogni ~ 10 stimoli di una stessa serie può consentire la verifica della continua vitalità e la reattività costante della preparazione. </li></ol> 5. Elaborazione dati e analisi I dati vengono trattati con ImageJ (con Mac biofotonica plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) e personalizzati programmi scritti in Matlab e R come segue: <ol><li> Correggere per artefatti da movimento di esempio:allineare tutte le immagini corrispondenti ad una preparazione di animale (per esempio 30 misure di 40 fotogrammi ciascuna) con il "corpo rigido" modo di StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / Thévenaz / stackreg</a> ) in ImageJ. Questo passaggio è necessario per rimuovere spostamenti nella posizione dei neuroni marcati rispetto al telaio acquisizione entro e tra le misurazioni. Tuttavia, è solo possibile rimuovere spostamenti nel piano xy. I dati devono essere eliminata se i cambiamenti si verificano forti a fuoco. </li><li> Segmento stack in singole misurazioni di 10 secondi (40 frame). </li><li> Corretto per lo sbiancamento artefatti: l'esposizione alla luce fluorescente causerà fluorescenza a decadere nel corso di una singola misura 10. In alcuni casi, è importante per correggere questo decadimento prima di analizzare i dati. Per ciascuna misurazione calcolare un frame sfondo. Questo dovrebbe essere la media di diversi fotogrammi prima della comparsa dello stimolo (ad esempio frames 6-14). Dividere ogni fotogramma di questo backgintorno telaio per ottenere le modifiche relative fluorescenza. Calcolare il valore medio relativo fluorescenza per ogni fotogramma facendo la media di tutti i pixel all'interno dell'area marcato da G-CAMP. Montare un doppio esponenziale alla curva di fluorescenza media, attribuendo maggiore importanza ai telai prima stimolo e peso zero al tempo della risposta odore (20 fotogrammi dall'insorgenza stimolo nel nostro caso). Sottrarre la curva montato dalla curva relativa fluorescenza di ciascun pixel. Moltiplicare i frame corretti dalla cornice di fondo di ri-ottenere i dati grezzi. Questo tipo di correzione può portare ad una modifica la dinamica di risposta se il segnale non ritorna alla linea di base alla fine della misura (ad esempio se risposte eccitatorie inibitori o molto forti vengono evocati) (Figura 4). Mentre correzione di artefatti sbianca è utile in molti casi, l'interpretazione dei parametri temporali deve essere fatto con cautela se una correzione candeggiante è applicato. </li><li> Calcolare la variazione relativa di fluorescenza (&amp; DeLTA; F / F) per ciascun frame di ogni misurazione come (F i-F 0) / * 0 F 100, F dove 0 è il fotogramma di sfondo (vedi 5.3), e F i il valore di fluorescenza per l'i-esimo fotogramma di la misurazione. </li><li> Calcolare la media Af / F all'interno di una regione circolare di interesse in un glomerulo (Figura 3B) con un diametro di 10 pixel per ottenere tracce di attività (Figura 5A). Se lo si desidera, trasformare queste tracce in mappe di calore che utilizzano ImageJ (Figura 5A). </li><li> Calcolare l'ampiezza di picco della risposta sottraendo la media Af / F di quattro fotogrammi prima stimolazione dalla media Af / F di quattro frame durante il picco della risposta. La stessa procedura viene utilizzata sia per illustrare modelli di risposta spaziali (si veda la Figura 3B) e di quantificare l'ampiezza della risposta in specifiche regioni di interesse in tutta mosche (vedi Figura 5B). La risposta di picco può essere quantificato integrando l'area sotto la curva durante il tempo dello stimolo, o averaging le cornici intorno al massimo della risposta. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Abbiamo usato i protocolli di cui sopra per registrare ed analizzare le risposte di acido propionico evocate di mosche che esprimono CaMP1.6 G-28 sotto il controllo del promotore per il co-recettore olfattivo IR8a, che è attiva in molti differenti popolazioni di OSN (29,30 Figure 3-5). La stimolazione con 1% di acido propionico provoca aumenti G-CAMP fluorescenza - indica aumenti del calcio intracellulare - in OSN innervano due glomeruli, DC4 e DP1l (Figura 3B). Si illustrano diversi modi di rappresentare dati provenienti da più mosche in figura 5: tracce di attività di linea, mappe di calore e una trama di risposte bar di picco. Risposte propionico-evocati hanno ampiezze dei picchi distinti e le dinamiche temporali e DC4 DP1l. Inoltre, anche se le risposte sono generalmente robusti, la variabilità tra i singoli animali possono essere osservati anche in entrambi i glomeruli (vedere cheatmaps in figura 5A). La quantificazione delle risposte di picco (Figura 5B) consente un semplice confronto statistico tra glomeruli diversi e odori diversi tra animali. Tuttavia, i cattivi odori evocati risposte di calcio può avere dinamica temporale non uniformi, e quantificare la loro grandezza con un singolo valore non tiene conto di questa complessità. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica del blocco di montaggio (A) prima e (B) dopo l'introduzione della mosca, e (C) una vista dall'alto in primo piano (adattato da 31). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Schematica del set-up sperimentale. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. (A) Vista dall'alto della preparazione dopo la fase fly 2.8 (riquadro a sinistra) e cruda immagine di fluorescenza delle antelobi NNAL etichettati con G-CaMP1.6 (genotipo: promoter IR8a: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 e DP1l glomeruli si distinguono per la loro morfologia, dimensioni e la posizione e sono contrassegnati in rosso e blu, rispettivamente. (B) con codice a colori immagine della risposta di acido propionico (1% v / v). L'immagine corrisponde al Af / F del picco della risposta calcolato come indicato nella fase 5,6 (vedi anche figura 5A). Il ColorScale a sinistra indica il Af / F% del valore. I cerchi neri indicano la posizione e la dimensione della regione di interesse utilizzato per quantificare le risposte (vedi figura 5). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Correzione sbianca del segnale reporter fluorescente. Esempi di effetti di correzione candeggina, come descritto nel passaggio 5,3. Dati campione sul pannello di sinistra può essere corretta senza grandi cambiamenti nella forma della risposta. I dati si riferiscono sul pannello di destra è gravemente incidereed dalla correzione candeggina, probabilmente perché il segnale cade e viene mantenuta al di sotto baseline dopo la cessazione odore stimolo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 5 (A) Top:. Dinamica temporale di risposte di calcio di glomeruli DC4 (sinistra) e DP1l (destra) di acido propionico (1% v / v). Le tracce nere indicano la mediana della media Af / F all'interno della regione di interesse (vedi Figura 3B) in otto animali. La superficie grigia indica l'intervallo tra il primo e terzo quartile della distribuzione. Presentazione dei valori mediani e di quartile fornisce ulteriori informazioni sulla variabilità e la distribuzione delle risposte osservate di errore medio e standard. Le caselle verdi e magenta indicano i fotogrammi media per calcolare le risposte di picco mostrato in figura 3b, e quantificati nella Figura 5B. In basso: le mappe di calore mostrano i dati di risposta per tutti i singoli animali in file separati, con Af / F valori represented dal ColorScale (estrema destra). Le barre orizzontali neri indicano il tempo e la durata dello stimolo. (B) mediani risposte punta ad acido propionico in otto animali per DC4 e DP1l glomeruli. Le barre di errore indicano l'intervallo tra primo e terzo quartile della distribuzione.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi di preparazione e di analisi descritte qui può essere utilizzato per analizzare i cattivi odori evocati risposte in una popolazione di neuroni nel lobo antennale (OSN, LN e PN) per il quale un transgene corrispondente driver è disponibile. Mentre descrivere la sua applicazione utilizzando un microscopio a fluorescenza, imaging ottico di questa preparazione può anche essere effettuata usando la microscopia confocale a due fotoni o 22,32. Infatti, questi strumenti ultime alleviare il problema di scattering di luce ad ampio campo di microscopia, che può ridurre la risoluzione delle immagini, specialmente quando un gran numero di neuroni esprimono il reporter. Questa preparazione consente registrazioni di solito i cattivi odori evocati risposte per almeno mezz&#39;ora, ma questa volta può essere significativamente più o meno lungo a seconda del numero e della lunghezza delle misurazioni registrate, il tempo di esposizione utilizzato per ogni fotogramma e la inter-stimolo intervallo. Inoltre, l&#39;eccitazione a due fotoni può ridurre photobleaching del fluorescente reporter, nonché fototossicità cellulare, per consentire la misurazione per periodi più lunghi 22,32. Indipendentemente dalla scelta del microscopio, il movimento del cervello mosca all&#39;interno della capsula testa è il problema più ricorrente quando l&#39;imaging in animali intatti. Mentre il movimento di correzione in grado di correggere problemi minori (passo 5.1), di solito è meglio solo per registrare dalle preparazioni altamente stabili. Strategie per ridurre gli artefatti di movimento includono: (i) corretto vincolare la proboscide della mosca con la spina dorsale cactus, (ii) immobilizzare le gambe del mosca fissando loro il palco con eicosane (prima al punto 2.6) (eicosane può essere fuso a ~ 37 ° C; usare un filo d&#39;argento per estendere e perfezionare la punta del saldatore per questo scopo), (iii) intaccare l&#39;esofago (visibile tra i nervi antennali) con le pinzette sottili. Oltre a G-CaMP1.6 qui utilizzato, un numero di versioni ottimizzate di G-CAMP indicatori di calcio e altri sono disponibili,che si differenziano nel loro rapporto segnale-rumore, la fluorescenza basale e dinamica temporale 12,28,33. La scelta precisa del sensore dovrebbe tener conto di tutte queste proprietà, il tipo di neuroni da analizzare e la questione biologica affrontata. Sensori di corrente segnalare le modifiche di calcio che correlano abbastanza bene con l&#39;azione potenziali 12,34, e la loro ulteriore miglioramento, insieme a un numero crescente di specifiche linee genetiche del driver 35 continuerà a migliorare il potenziale di imaging ottico di attività neurale in al volo intatto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Cactus colonna vertebrale </td><td> Giardinaggio, centro per </td><td></td><td> ~ 7 millimetri sottile lungo, non troppo flessibile </td></tr><tr><td> Colofonia </td><td> Strumento a corda negozio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Due componenti di silicio </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Custom made blocco di montaggio in plexiglass </td><td> Blueprints disponibili <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Griglie di rame </td><td> Athene Griglie </td><td> G220-5 </td><td> Normalmente utilizzato per i campioni di microscopia elettronica. </td></tr><tr><td> Viti </td><td> Ferramenta </td&gt; <td></td><td> 2 mm di diametro </td></tr><tr><td> Coprioggetti plastica </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Punte di ferro di saldatura </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentazione regolamentato </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Filo sottile </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 millimetri </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD della fotocamera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Acquisizione software </td></tr><tr><td> Monocromatore </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Lame fragili </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Supporto per blade </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire blade </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Lama a doppio taglio 1 millimetro </td></tr><tr><td> Pompe a membrana gas </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire portalama </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Valvola a tre vie </td><td> Lee Azienda </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configurazione E </td></tr><tr><td> Rotametro 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotametro 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Cera vergine </td><td> SILADENT Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulosa pad </td><td> Kettenbach Medical </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetta </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologia # 5 </td></tr><tr><td> Siringhe </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pezzi </td></tr><tr><td> Aghi </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 millimetri OD </td></tr></tbody></table>

imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel drosophila lobe antenne

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Il lobo antenne è il centro principale olfattivo nel cervello insetti e rappresenta l&#39;equivalente anatomica e funzionale del bulbo olfattivo vertebrato 1-5. Informazioni olfattivo nel mondo esterno viene trasmessa al lobo antennale da neuroni sensoriali olfattivi (OSN), che segregano per regioni distinte neuropilo chiamati glomeruli secondo il recettore specifico olfattivo esprimono. Qui, OSN assoni sinapsi con entrambe le interneuroni locali (LNS), i cui processi possono innervare molti glomeruli diversi, e neuroni di proiezione (PN), che trasmettono informazioni olfattive ai maggiori regioni del cervello olfattive. Imaging ottico dell&#39;attività di OSN, LNS e PNS nel lobo antennale - tradizionalmente mediante indicatori sintetici di calcio (es. calcio verde, FURA-2) o la tensione-sensibili (ad esempio coloranti RH414) - è stata a lungo una tecnica importante per capire come olfattiva gli stimoli sono rappresentati come modelli spaziali e temporalidell&#39;attività glomerulare in molte specie di insetti 6-10. Sviluppo di geneticamente codificati reporter attività neurale, come gli indicatori di calcio fluorescenti G-Camp 11,12 e Cameleon 13, l&#39;indicatore di calcio bioluminescente GFP-equorina 14,15, o un reporter di trasmissione sinaptica, Synapto-pHluorin 16 ha reso sistema olfattivo del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, particolarmente accessibile all&#39;imaging neurofisiologico, integrando le sue proprietà complessivamente descritte-molecolari, elettrofisiologici e neuroanatomici 2,4,17. I giornalisti possono essere selettivamente espressa tramite binari sistemi di controllo trascrizionale (es. GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q del sistema 21) in popolazioni di neuroni definiti all&#39;interno del circuito olfattivo di sezionare con elevata risoluzione spaziale e temporale come odori evocati attività neurale è rappresentata, modulato e trasformato 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Qui si descrivono i metodi di preparazione e di analisi per misurare i cattivi odori evocati risposte nel lobo antennale Drosophila utilizzando G-CAMP 25-27. La preparazione animale è minimamente invasiva e può essere adattato per l&#39;imaging mediante microscopia a fluorescenza, confocale e due fotoni a grande campo.

Descriviamo una tecnica consolidata per misurare e analizzare i cattivi odori evocati risposte di calcio nel lobo antennale di vivere<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

Il lobo antennale è il centro olfattivo primario nel cervello degli insetti e rappresenta l'equivalente anatomico e funzionale del bulbo olfattivo dei vertebrati...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività fisiologica dei neuroni olfattivi in *Drosophila* e nel lobo antennale mediante imaging ottico delle variazioni di calcio intracellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto assemblando il supporto per il blocco di montaggio, il porta-filo e lo schermo per le antenne. Successivamente, una mosca che esprime il sensore fluorescente di calcio GCaMP viene montata e fissata al blocco.Dopo aver montato la mosca, si asporta il cuticolo sulla parte superiore della testa per esporre i lobi antennali. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel posizionare la mosca sotto il microscopio e stimolarla con un odore. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano i modelli di attività indotti dall'odore nei lobi antennali DLA, attraverso i cambiamenti registrati nella fluorescenza relativa del sensore del calcio G camp.Questo metodo può aiutare a rivelare come gli odori siano rappresentati come schemi spaziali e temporali di attività neuronale a diversi livelli della circuitazione olfattiva. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi come l'elettrofisiologia è che possiamo registrare l'attività di neuroni geneticamente identificati che non sono accessibili agli elettrodi di registrazione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul trattamento neuronale degli odori.Si può applicare anche ad altre regioni del cervello della mosca, come i sistemi uditivo e visivo. Innanzitutto, inserire le viti attraverso la parte posteriore del blocco di montaggio in plexiglass, in modo che non sporgano oltre la faccia anteriore. Utilizzare un trapano di precisione per creare una piccola incavatura nel bordo superiore della camera circolare destinata alla mosca, scavando al di sotto della superficie per ridurre lo spessore del blocco.Sotto una lente stereoscopica, tagliare una griglia di rame con un bisturi perpendicolarmente e vicino alla base della fessura, creando così un collare per trattenere la mosca. Assicurarsi che le due linguette risultanti siano alla stessa altezza, poiché ciò facilita l'inserimento della mosca. Con uno stuzzicadenti, applicare una piccola goccia di colla istantanea sul blocco di montaggio sopra la camera circolare.Per la mosca, posizionare la griglia di rame sulla colla e disporla in modo che la fessura sia centrata sul blocco. Premere delicatamente sulla griglia ed eliminare l'eccesso di colla con una pinzetta. Aggiungere piccole gocce di colla sotto le linguette su ciascun lato e piegare la griglia sul davanti del blocco in modo che la fessura risulti orientata verticalmente verso il basso.Assicurarsi che la parte superiore della griglia sia allineata con il blocco e lasciarla asciugare completamente. Per realizzare un supporto di filo metallico, tagliare a metà un coperchio di plastica e rimuovere una sezione centrale per ottenere una forma a U. Utilizzare la cera d'api per incollare un pezzo di filo metallico lungo il bordo superiore della U in modo che il filo non sia troppo t.Costruire uno schermo per antenna utilizzando un perforatore per carta per fare un foro in un coperchio di plastica. Tagliare i bordi del coperchio in modo da ottenere una dimensione di 0,5 per 0,7 centimetri. Incollare il coperchio di plastica forato su un nastro adesivo, quindi applicare una goccia di etanolo sul nastro esposto attraverso il foro.Per rimuovere l'adesivo, anestetizzare moscerini di uno-tre settimane di età con il genotipo appropriato raffreddandoli sul ghiaccio. Sotto la lente stereoscopica, prendere un moscerino per l'articolazione dell'ala e farlo scorrere con la superficie dorsale in avanti lungo la griglia di rame in modo che rimanga sospeso per il collo. Se necessario, ruotare il moscerino finché non è rivolto verso il basso.Posizionare una sottile spina di cactus davanti alla testa della mosca per impedirle di scappare e sistemare la spina davanti al probo per impedirne il movimento. Fissare la spina di cactus al blocco utilizzando cera d'api, assicurandosi che la sommità della testa sia allineata con la sommità del blocco. Fissare la testa della mosca al blocco con una piccola goccia di colofonia disciolta in etanolo.Posizionare il blocco in una scatola umidificata e lasciare indurire la pece per circa un'ora. Utilizzando pinzette, tirare in avanti la piastra antennale e inserire il supporto del filo nella piega cuticolare tra l'antenna e la testa. Fissare il supporto alla parte anteriore del blocco con altra cera d'api.Utilizzando le viti incorporate nel blocco, spingere delicatamente in avanti il supporto del filo per creare un po' di spazio tra la piastra dell'antenna e la testa. Posizionare lo schermo dell'antenna sulla sommità della testa di un moscerino, con l'elemento posizionato al centro. Fissare lo schermo alla sommità del blocco di montaggio con della cera d'api.Utilizzando un taglierino a lama, praticare un piccolo foro nel nastro adesivo sullo scudo, esponendo la cuticola della testa della mosca dietro l'antenna. Il foro non deve estendersi oltre gli occhi per evitare fuoriuscite del preparato. Sigillare il foro tra il nastro e la cuticola con silicone bicomponente.Rimuovere qualsiasi eccesso di silicone dalla parte superiore della testa della mosca. Applicare una goccia di soluzione salina ringer per Drosophila sulla testa della mosca, assicurandosi che non ci siano perdite e che le antenne rimangano completamente asciutte. Utilizzando una lama di zaffiro, praticare un leggero solco lungo la piega cuticolare direttamente dietro l'antenna.Quindi effettuare un taglio lungo gli occhi e attraverso il sellium sul dorso. Infine, piegare il frammento di cuticola oltre il bordo precedentemente inciso e tagliare dal lato inferiore. Per evitare di recidere i nervi delle antenne, rimuovere con cura le ghiandole e le trachee utilizzando pinzette fini.Risciacquare ripetutamente con soluzione fisiologica per Drosophila, lasciando una goccia abbondante sulla testa. Inserire un tampone di cellulosa in una siringa di plastica da due millilitri utilizzando pinze pulite. Mediante una punta filtrata per pipetta, applicare 20 microlitri di odorante diluito.Collegare e tappare la siringa fino al momento dell'uso per l'acquisizione delle immagini. Posizionare il supporto contenente la mosca sotto il microscopio. Abbassare l'obiettivo finché non tocca la soluzione di Ringer sulla testa della mosca.Guardando attraverso l'oculare con illuminazione in campo chiaro, posizionare il preparato in modo che il foro nella capsula cefalica sia centrato e i suoi margini siano a fuoco. Passare alla luce fluorescente e regolare il fuoco finché non si vedono i neuroni marcati, che devono essere evidenti dalla fluorescenza verde basale di GCaMP. Acquisire immagini con una telecamera CCD montata sul microscopio utilizzando un software di acquisizione appropriato e mettere a fuoco sui glomeruli di interesse.Assicurarsi di chiudere il diaframma nel percorso della luce di illuminazione per limitare la luce di eccitazione all'area immaginata. Posizionare l'uscita dell'olfattometro approssimativamente a 0,5 centimetri davanti alle antenne delle mosche. Qui, i lobi anali sono mostrati in una mosca che esprime GCaMP 1.6 sotto il controllo di un promotore di neuroni sensoriali olfattivi che induce l'espressione in diversi glomeruli; la stimolazione con acido propionico al 1% induce un aumento della fluorescenza di GCaMP, indicativo di un incremento del calcio intracellulare, nei neuroni sensoriali olfattivi che innervano i glomeruli DC quattro e DP uno L. Qui vengono mostrate le dinamiche temporali delle risposte al calcio dei glomeruli DC quattro e DP uno L all'acido propionico.I tracciati neri mostrano la mediana della delta F media su F all'interno della regione di interesse su otto animali, e la superficie grigia indica l'intervallo compreso tra il primo e il terzo quartile della distribuzione. Le mappe termiche riportate sotto mostrano le risposte dei singoli animali. I riquadri magenta con sfumatura verde indicano i fotogrammi mediati per calcolare le risposte di picco dei glomeruli al di sopra dei livelli di fluorescenza di base di GCaMP e sono qui mostrati in forma quantificata.La correzione del fotobiancamento del marcatore fluorescente può avere effetti sulla risposta. I dati del campione con picco nel pannello sinistro possono essere corretti senza cambiamenti significativi nella forma della risposta. I dati nel pannello destro sono fortemente influenzati dalla correzione del fotobiancamento, probabilmente perché il segnale diminuisce e rimane al di sotto della linea di base dopo la cessazione dello stimolo odoroso. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti.Se eseguita correttamente, mentre si tenta questa procedura, è importante mantenere l'antenna completamente asciutta, altrimenti non sarà in grado di rilevare gli odori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare, acquisire e analizzare gli odori.Indurre l'attività neuronale nella mosca della frutta.

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Le api possono essere condizionate in un paradigma di apprendimento olfattivo appetitivo (PER condizionata). Utilizzando gli odori come stimoli, abbiamo stabilito un metodo in cui il comportamento viene registrato contemporaneamente Imaging calcio è utilizzato per misurare l'attività odore evocato nei neuroni del corpo dei...

In vivo Ca 2 + - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l&#39;apprendimento olfattivo nel Honey Bee

Questo video descrive l'imaging del calcio in vivo nei neuroni di Drosophila utilizzando GCaMP. La clip del protocollo in primo piano mostra come registrare i cambiamenti nella fluorescenza GCaMP dai neuroni del corpo a fungo durante un esperimento di condizionamento olfattivo.

Drosophila In Vivo Imaging del calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

Questo video dimostra un metodo per rilevare le risposte dei neuroni sensoriali in Drosophila utilizzando il legame del ligando e l'imaging a fluorescenza. I ligandi si legano ai recettori neuronali, causando l'afflusso di calcio. Il calcio si lega ai complessi indicatori, portando all'emissione di fluorescenza, che conferma la risposta neuronale al ligando.

Rilevamento delle risposte fisiologiche dai neuroni sensoriali in Drosophila

Questo video mostra un metodo per l'imaging del calcio in vivo utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente nei moscerini. Descrive i passaggi per preparare i moscerini per la microscopia, condurre il condizionamento olfattivo e visualizzare l'afflusso di calcio indotto dagli odori.

in vivo Imaging del calcio utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente in Drosophila melanogaster

Fonte: Ishimoto, H. et. Al., Imaging del calcio ex vivo per la visualizzazione delle risposte cerebrali alla segnalazione endocrina in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Questo video dimostra l'imaging del calcio da studiareDrosophila risposte cerebrali ai neuropeptidi. I neuroni che esprimono un indicatore fluorescente di calcio rivelano la dinamica intracellulare del calcio e le risposte funzionali alle molecole di segnalazione.

Imaging ex vivo del calcio per studiare le risposte cerebrali della Drosophila ai neuropeptidi

Le zampe anteriori e la proboscide di Drosophila contengono un ricco repertorio di neuroni sensoriali gustativi. Qui, presentiamo un metodo che utilizza l'imaging del calcio per misurare le risposte fisiologiche dei neuroni sensoriali nella zampa anteriore e nella proboscide di moscerini vivi dopo l'applicazione esogena di un feromone gustativo.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

Questo articolo descrive un adattabile ex vivo protocollo per la visualizzazione Ca 2+ durante l'attivazione uovo in Drosophila.

Calcio Imaging in<em&gt; Drosophila</em&gt; All&#39;attivazione Egg

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Un approccio di imaging del calcio consente la registrazione delle risposte indotte dal gusto nel cervello dei moscerini svegli mentre una soluzione viene applicata al labello. Le risposte gustative primarie in Drosophila melanogaster sono utilizzate come esempio, ma questo protocollo può essere adattato per studiare i neuroni a valle o altre specie.

In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

Un ostacolo significativo allo studio dell'attività cellulare durante i processi cognitivi come l'apprendimento e la memoria è l'uso di anestetici per la preparazione dell'imaging in vivo . L'anestesia compromette la memoria a breve termine e la cognizione in più modelli, tra cui la Drosophila. Questo studio presenta un metodo unico per preparare la Drosophila adulta per l'imaging in vivo senza anestesia.

In vivo Imaging dell'attività neurale nelle mosche adulte di Drosophila non anestetizzate

Presentiamo i protocolli di imaging del calcio per un neurone olfattivo larvale di Drosophila , utilizzando un adesivo tissutale topico per l'immobilizzazione. Questo metodo migliora la stabilità, facilitando esperimenti affidabili in vivo ed ex-vivo . Gli script R personalizzati analizzano i segnali del calcio, fornendo una piattaforma efficiente per la ricerca neurofisiologica dettagliata.

Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio

Impara l'imaging di calcio nel lobo antennale di Drosophila melanogaster per studiare l'attività neuronale olfattiva. Questa tecnica ottica rivela pattern spaziali e temporali delle risposte agli odori.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

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