Preparazione di organoidi dai tumori: un modello tumorale in vitro 3D

Tritare il tessuto tumorale in piccoli pezzi. Trasferire i pezzi in una provetta con tampone per la digestione. Le fibre di collagene che circondano le cellule vengono scomposte, degradando la matrice del tessuto. Quindi, pellettare i pezzi digeriti e scartare la maggior parte del tampone di digestione. Muovi il tubo per rompere il pellet.

La soluzione è ora costituita da grumi cellulari di varie dimensioni. Risospendere i grumi cellulari in una soluzione di tripsina e un inibitore ROCK. La tripsina continua a scomporre il tumore e l'inibitore previene la morte cellulare. A intervalli regolari, pipettare la soluzione per rompere i grumi e disperdere le cellule. Quindi, risospendere le cellule in soluzione di matrice alla concentrazione appropriata.

Mettere le gocce della soluzione in una piastra di coltura per formare cupole a matrice. Posizionare le piastre capovolte in un'incubatrice e lasciare che la matrice si solidifichi completamente. Quindi, aggiungere i terreni di coltura cellulare e incubare, con il lato destro rivolto verso l'alto. La matrice fornisce un'impalcatura per supportare la crescita tridimensionale dell'organoide.

Dopo la macinazione, metti i pezzi di tumore in un tubo da 15 millilitri di tampone per la digestione per una digestione da 1,5 a 2 ore a 37 gradi Celsius. Al termine della digestione, sedimentare il tessuto digerito mediante centrifugazione e scartare il surnatante.

Muovi il tubo per allentare il pellet della cella. Risospendere le cellule in 1 millilitro di tripsina preriscaldata integrata con 10 micromolari di inibitore di Y-27632 ROCK per 5 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, triturare il liquame tissutale cinque volte con il puntale della pipetta standard P1000. Rimettere la provetta nel bagnomaria per un'ulteriore incubazione e triturazione di 5 minuti.

Per la placcatura a cupola della matrice, lavare le cellule digerite in 9 millilitri di terreno freddo, quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere le cellule in 1 millilitro di terreno fresco per il conteggio e, dopo il conteggio, raccogliere nuovamente le cellule mediante centrifugazione. Diluire le cellule tumorali nel volume appropriato di matrice.

Versare con cautela 200 microlitri di soluzione di cella matrice in ciascun pozzetto di una piastra riscaldata a 6 pozzetti a 55 gradi Celsius. Lasciare solidificare le cupole a temperatura ambiente per 2 minuti prima di posizionare la piastra capovolta in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Quando le cupole si sono completamente solidificate, aggiungere 2 millilitri di terreno organoide prostatico integrato con androgeno R1881 e inibitore ROCK a ciascun pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari.

• In vitro tumor models - Methods for studying tumor behavior in lab-controlled conditions.
• PeproTech Noggin - A protein used to regulate cellular processes in tissue culture.
• Tumor model - A method or process used to replicate tumor environment and behavior for scientific studies.
• Cell pellet - Cluster of cells collected at the bottom of a tube after centrifugation.
• ROCK inhibitor organoids - Compounds that prevent cell apoptosis during organoid creation.
• Noggin conditioned media - Media enriched with Noggin protein, used in cellular culture and experiments.
• Cell pellet in tube - Term refers to cells that have been concentrated by centrifugation in a sample tube.

• Introduce In vitro tumor models by defining this as a replicate of tumor behavior (e.g., in vitro tumor models).
• Key Concepts by summarizing principles involved in cell pellet creation (e.g., cell pellet).
• Underlying Mechanisms through visualizing the process of using ROCK inhibitor in organoid creation.
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• What are in vitro tumor models and how to create a cell pellet in lab conditions?
• What role does the PeproTech Noggin play in the tumor model creation?
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• Practical Applications - Tumor models help study cancer growth and potential cures (e.g., in vitro tumor models).
• Industry Impact - Lab studies benefit the healthcare industry and the field of oncology (e.g., ROCK inhibitor organoids).
• Societal Importance - The research contributes to advancements in cancer treatment options (e.g., Noggin conditioned media).
• Link to Scientific Advancements - Understanding tumor behavior facilitates innovative treatment approaches.