Saggio Dell'organoide Prostatico: una tecnica di coltura ex vivo basata su anello su gel matrice per studiare la capacità di differenziazione delle cellule epiteliali della prostata

L'epitelio prostatico comprende principalmente cellule epiteliali basali e epiteliali luminali. Un monostrato di cellule basali forma il rivestimento esterno della ghiandola e supporta la sopravvivenza delle cellule luminali. Al contrario, le cellule luminali rivestono il lume e secernono proteine specifiche della prostata.

Per studiare la differenziazione epiteliale prostatica ex vivo, iniziare con una sospensione di cellule epiteliali prostatiche basali. Miscelare la sospensione con una matrice di membrana basale raffreddata nel rapporto desiderato. Pipettare questa miscela vicino alla base della parete interna di una piastra di coltura repellente per cellule. Agitare la piastra per il composto in modo da formare un anello lungo la circonferenza del pozzetto.

Incubare la piastra per consentire alla matrice di solidificarsi. Integra la cultura con un media preferito. I fattori di crescita nei terreni supportano la proliferazione delle cellule epiteliali basali. Allo stesso tempo, la natura repellente per le cellule della piastra di coltura impedisce qualsiasi attacco cellulare, incoraggiando le cellule a formare sferoidi 3D all'interno della matrice.

Nel corso del tempo, gli sferoidi sviluppano lumi delimitati da epitelio multistrato. Le cellule epiteliali basali che rivestono il lume alla fine si differenziano e formano cellule luminali secretorie, dando origine a strutture ghiandolari 3D.

Iniziare questa procedura con la preparazione di cellule epiteliali prostatiche basali e luminali di topo come descritto nel protocollo di testo. Lavare il pellet cellulare in 500 microlitri di terreno organoidico di topo. Quindi, risospendere il pellet a una densità di celle di 1.000 celle per microlitro. Per preparare le master mix, mescolare le cellule epiteliali sospese in terreni organoidi di topo con il gel della matrice per generare una miscela finale che contiene il 25% di cellule nel terreno e il 75% di gel della matrice. A seconda dell'applicazione a valle, le celle basali sono tipicamente piastrate a una concentrazione compresa tra 100 e 2.000 celle per 80 microlitri, mentre le celle luminali sono piastrate a una concentrazione compresa tra 2.000 e 10.000 celle per 80 microlitri.

Per ogni miscela di cellule, aggiungere 80 microlitri di gel matrice per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Pipett una goccia sulla metà inferiore della parete del pozzetto evitando il contatto diretto con il rivestimento in poli-HEMA. Dopo aver aggiunto il gel della matrice, agitare la piastra per consentire alla miscela di cellule del gel della matrice di formare un anello attorno al bordo del pozzetto. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di CO2, con il lato destro rivolto verso l'alto, per 10 minuti per consentire al gel della matrice di indurirsi parzialmente.

Dopo l'incubazione per 10 minuti, capovolgere la piastra a 24 pozzetti e incubare per altri 50 minuti per consentire al gel della matrice di indurirsi completamente. Quindi, aggiungere 350 microlitri di terreno organoide di topo preriscaldato, goccia a goccia, al centro di ciascun pozzetto. Dopo aver aggiunto il terreno, rimettere la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore.

Per rifornire i terreni organoidi di topo, inclinare la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45 gradi e rimuovere delicatamente i terreni esistenti dal centro di ciascun pozzetto utilizzando una pipetta P1000 evitando l'anello di gel della matrice. Aggiungere 350 microlitri di organoidi di topo preriscaldati come prima. Si raccomanda di aggiungere un volume maggiore di terreno agli organoidi coltivati per più di cinque giorni per prevenire il rapido esaurimento dei nutrienti chiave e dei fattori di crescita.

• Prostate Epithelium - Consists of basal and luminal cells forming the prostate gland's structure.
• Basal Cells - Cells forming the outer lining of the prostate epithelium.
• Luminal Cells - Cells lining the lumen of the prostate gland and secreting prostate-specific proteins.
• 3D Spheroids - Cell structures formed in a cell-repellent environment.
• Organoid Assay - A method to study cell differentiation and formation of 3D glandular structures ex vivo.

• Introduction to Prostate Epithelium - It is formed of basal and luminal cells (e.g., prostate epithelial cells).
• Outline of Cellular Components - Basal cells support luminal cell survival; luminal cells line the lumen (e.g., organoid assay).
• Explanation of 3D Spheroids Formation - Grown within a matrix in a cell-repellent environment.
• Connection to Experiment - Formation of luminal cells from basal cells in 3D glandular structures.

• What are prostate epithelial cells and their role in the prostate epithelium?
• How does the organoid assay contribute to the study of prostatic epithelial differentiation?
• What is the process of 3D spheroids formation in a cell-repellent environment?

• Practical Applications - Used to study cell differentiation and formation of glandular structures ex vivo (e.g., organoid assay).
• Industry Impact - Crucial for biomedical research and development in urology (e.g., prostate health).
• Societal Importance - Contributes to better understanding and treatment of prostate diseases (e.g., prostate cancer).
• Scientific Advancements - Enabled the study of prostate cell proliferation and differentiation.