Estrazione del lisato proteico: una tecnica per lisare gli organoidi per raccogliere le proteine cellulari

Il lisato cellulare, o il fluido contenente il contenuto cellulare lisato, trova applicazione nei processi a valle come l'estrazione e l'analisi delle proteine. Lo studio di queste frazioni rivela informazioni sulle caratteristiche e le funzioni delle cellule.

Per preparare i lisati proteici organoidi, iniziare con una coltura di organoidi coltivati in una matrice di membrana basale desiderata. Rimuovere i terreni di coltura esauriti dal piatto. Aggiungere un terreno caldo contenente proteasi sopra la matrice. Pipet ripetutamente per rimuovere la matrice dal piatto.

Incubare la miscela. Gli enzimi proteolitici nel terreno degradano la matrice e rilasciano gli organoidi nella soluzione. Centrifugare il campione per separare gli organoidi dal surnatante contenente l'enzima.

Risospendere il pellet di organoide in un tampone di lisi proteica adatto. Incubare il campione. I detergenti nel tampone distruggono le membrane cellulari degli organoidi, rilasciando contenuti intracellulari nella soluzione. Contemporaneamente, gli inibitori proteici nel tampone inattivano gli enzimi proteasi e fosfatasi rilasciati, impedendo la degradazione delle loro proteine substrato.

Inoltre, sonicare la miscela per distruggere completamente le cellule. L'involucro nucleare si rompe e rilascia proteine nucleari nella soluzione. Le onde soniche tagliano anche gli acidi nucleici rilasciati, impedendo loro di contaminare il lisato proteico.

Per raccogliere gli organoidi, far esplodere ripetutamente il gel della matrice pipettando 1 millilitro di terreno preriscaldato contenente dispasi direttamente sull'anello del gel della matrice fino a quando l'intero anello non viene rimosso. Trasferire la miscela di organoidi in gel di matrice rimossa in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la completa digestione, come descritto nel protocollo di testo, aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato al pellet dell'organoide e risospendere muovendo delicatamente.

Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta. Risospendere i pellet di organoidi in 100 microlitri di tampone di lisi proteica per 10 microlitri di volume di cellule impaccate. Scorri per riattivare. Ora, sonicare gli organoidi immergendo le provette nel ghiaccio umido e applicando delicatamente la punta del dismembratore sonico all'esterno della provetta della microcentrifuga. Sonicare per 40 secondi a 20 kHz prima di procedere al western blotting con i protocolli stabiliti.