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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 4:50 min • April 30th, 2023
La fosforilazione di specifici residui di aminoacidi, come la tirosina, genera fosfopeptidi che svolgono un ruolo critico nella regolazione di diverse vie di segnalazione cellulare. Il loro studio consente l'identificazione di potenziali biomarcatori per la terapia del cancro.
Per isolare i fosfopeptidi, iniziare con una polvere liofilizzata di peptidi purificati estratti dal tessuto tumorale. Risospendere la polvere in un tampone adatto per preparare una sospensione peptidica uniforme. Mantenere un pH neutro per garantire la stabilità dei peptidi.
Preparare un impasto liquido costituito da perle di idrogel coniugate a specifici anticorpi anti-fosfopeptide nel tampone desiderato. Aggiungere l'impasto liquido di perline alla sospensione peptidica. Gli anticorpi immobilizzati sulle perle riconoscono e si legano ai loro specifici residui di amminoacidi fosforilati all'interno dei fosfopeptidi, formando complessi.
Centrifugare la miscela per raccogliere i complessi fosfopeptide-perlina nel pellet. Rimuovere il surnatante contenente peptidi non legati o fosfopeptidi non specifici. Aggiungere un tampone di eluizione a basso pH adatto ai complessi e incubare. Il pH basso indebolisce l'interazione tra i residui di fosfopeptide e i complessi anticorpo-perlina, rilasciando i peptidi nella soluzione.
Trasferire il composto in una cartuccia filtrante preassemblata. Centrifugare per eluire i fosfopeptidi rilasciati nella provetta di raccolta. Concentrare il campione sotto vuoto a una temperatura elevata per rimuovere il tampone e ottenere un pellet secco concentrato di fosfopeptidi puri.
Risospendere la polvere liofilizzata con 0,5 millilitri di tampone legante l'immunoprecipitazione ghiacciata, o IP, in ciascuna frazione. Trasferire il volume di risospensione di 0,5 millilitri dalla seconda frazione al tubo con la prima frazione e conservare il puntale della pipetta. Utilizzare altri 0,5 millilitri di tampone IP per sciacquare ogni provetta di liofilizzazione prima di trasferire il contenuto nella criopro. Quindi, ripetere il risciacquo utilizzando 2 millilitri di tampone IP.
Dopo aver utilizzato P200 con una punta tagliata per trasferire lo stock di 0,5 milligrammi per millilitro di liquame di perle di anticorpi nel tubo di microfuga, aggiungere 450 microlitri di tampone legante IP ghiacciato per lavare 50 microlitri di liquame di perle di anticorpi 4G10 e 25 microlitri di liquame di perle di anticorpi 27B10.4 in un tubo di microfuga. Centrifugare la provetta a 100 x g e 4 gradi Celsius per 1 minuto. Dopo aver aspirato il surnatante, aggiungere un volume uguale al liquame originale del tampone legante IP per risospendere le perle. Aggiungere perle di pY prelavate alla soluzione del campione risospeso nelle crioprovette con tappo a vite. Quindi, incubarli a 4 gradi Celsius su un rotatore end-over-end per una notte. Dopo aver fatto girare le perline, conservare il surnatante, che verrà utilizzato per arricchire i peptidi pST.
Quindi, utilizzare 300 microlitri di tampone legante IP per risospendere le perle e trasferirle in una provetta da microcentrifuga da 2 millilitri. Centrifugare i campioni a 100 x g e 4 gradi Celsius per 1 minuto. Quindi, con 500 microlitri di tampone legante IP, lavare le perle tre volte. Lavare le perle quattro volte con 450 microlitri di bicarbonato di ammonio 25 mM, pH 7,5. Immergere una punta di caricamento del gel leggermente sotto la superficie del cordone e aspirare completamente il surnatante. Aggiungere quattro volte il volume delle perle dello 0,1% di TFA alle perline.
Quindi, mescolarli bene e incubare la provetta in un termomixer a 1.000 giri/min e 37 gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire la risospensione in un filtro centrifugo da 0,2 micrometri e centrifugare il filtro a 850 x g per 1 minuto. Dopo aver trasferito l'eluizione in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico, concentrare l'eluato sotto vuoto fino a essiccarlo a 40 gradi Celsius con un tempo di riscaldamento di 300 minuti durante la notte.